一种巨大血小板综合征的斑马鱼模型

1.本发明属于生物技术领域，特别涉及研究血小板发育研究领域，具体涉及一种巨大血小板综合征的斑马鱼模型。


背景技术：

2.血小板是血液系统中主要的组成部分。当血管破损时，血小板起到了止血和凝血的作用。当血小板数目减少或者功能减退，会导致机体止血功能障碍和血栓形成不良，并且引发相关的血小板疾病。巨大血小板综合征,又称bernard
‑
soulier syndrome,一种罕见的遗传性出血性疾病，其发病率不足1/100万，主要是由于血小板膜上的糖蛋白复合体gpib
‑
ix
‑
v的合成和表达缺陷或者其中任一亚基gpib，gpix和gpv的基因缺陷所导致。gpib
‑
ix
‑
v的缺陷导致血小板不能正常粘附到血管内皮上而导致皮肤，黏膜出血或者内脏出血，出血轻重不一。病人的外周血中会出现巨大的血小板且轻度或中度的血小板数目的减少。(anna savoia,annalisa pastore,daniela de rocco,et al.(2011).clinical and genetic aspects of bernard
‑
soulier syndrome:searching for genotype/phenotype correlations.haematologica 96(3):417
‑
423).在老鼠的模型中，外周血中血小板的形态也出现了异常，能形成伪足样的血小板(偏成熟的血小板)数目减少，说明gpib
‑
ix
‑
v对血小板的形态的维持和成熟发挥了重要的作用。(c.strassel,c.nonne,a.eckly,t.david,c.leon,et al.(2007).decreased thrombotic tendency in mouse models of the bernard
‑
soulier syndrome.arteriosclerthrombvasc biol.27:241
‑
247).在13例bernard
‑
soulier病例报导中，发现有7例gpix这一基因的错义突变的病人。
3.为了更好地研究gpix在血小板中的作用以及bernard
‑
soulier syndrome巨大血小板的发病机制，需要观察胚胎的发育和大规模的药物筛选。因此，需要建立一种相关的动物模型。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种巨大血小板综合征的斑马鱼模型。本发明提供的巨大血小板综合征的斑马鱼模型是一种gpix基因突变致血小板减少的斑马鱼模型。
5.本发明为了更好地研究gp9在早期发育血小板中的作用以及相关的调控机制，构了建斑马鱼突变体gp9并应用于制备相应的疾病模型(巨大血小板综合征的斑马鱼模型)。由于斑马鱼产卵高，体外受精，早期胚胎发育透明的特性，有利于观察血小板的行为变化。同时，也有利于一些治疗巨大血小板综合征的大规模药物筛选。
6.本发明的目的在于提供一种巨大血小板综合征的斑马鱼模型。本发明提供的gpix基因突变致血小板减少斑马鱼模型可以应用于bernard
‑
soulier巨大血小板综合征发病机制的研究。
7.本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
8.本发明提供的巨大血小板综合征的斑马鱼模型，该斑马鱼模型为gp9
smu15
突变体斑马鱼。
9.进一步地，gp9
smu15
突变体斑马鱼的表型是由gp9基因异常表达引起，即由gp9
smu15
突变引起。
10.进一步地，所述gp9
smu15
突变体斑马鱼为斑马鱼gp9基因缺失了17个碱基，导致gp9基因提前终止表达，gp9蛋白表达异常的突变体斑马鱼。所述gp9
smu15
突变体斑马鱼的gp9基因翻译提前终止，为缺失重要的功能域的突变体。
11.进一步地，所述gp9
smu15
突变体斑马鱼是通过crispr/cas9靶向基因敲除gp9基因上的17个碱基得到的。
12.进一步地，所述gp9
smu15
突变体斑马鱼是通过crispr/cas9靶向基因敲除斑马鱼gp9基因的2号外显子序列atg起始密码子之后的17个碱基得到的。
13.进一步地，所述gp9
smu15
突变体斑马鱼的gp9蛋白相对于野生型斑马鱼的gp9蛋白缺失了lrrnt的功能域。
14.进一步地，所述gp9
smu15
突变体斑马鱼的gp9蛋白相对于野生型斑马鱼的gp9蛋白缺失了lrrct的功能域。
15.本发明提供的gpix基因突变致血小板减少的斑马鱼模型在制备bernard
‑
soulier syndrome巨大血小板综合征的动物模型中的应用。
16.进一步地，所述巨大血小板综合征为bernard
‑
soulier syndrome；所述巨大血小板综合征的症状为血小板减少，血小板的增殖减少。
17.更进一步地，所述巨大血小板综合征的症状为胚胎期血小板数目的减少，血小板前体细胞的增殖减少；
18.更进一步地，所述巨大血小板综合征的症状为成年期凝血功能异常，外周血血小板的数目减少。有些斑马鱼模型外周血血小板大小增大以及皮肤黏膜出血。
19.本发明总体构思为：
20.(1)通过crispr/cas9靶向基因敲除的技术，得到gp9基因序列缺失的突变体斑马鱼。
21.(2)在胚胎时期，利用标记不同阶段血小板的探针进行原位杂交试验来检测血小板分子标记的变化以及通过q
‑
pcr的方法检测血小板相关基因的表达变化。
22.(3)用brdu增殖实验、tunel凋亡实验来检测血小板分化过程中增殖和凋亡的改变；
23.(4)在斑马鱼gp9
smu15
突变体的成年时期，用流式细胞术的方法观察gp9
smu15
突变体血小板的数目变化。
24.(5)在成鱼时期，损伤gp9
smu15
突变体的尾巴，测得其止血时间来检测突变体的凝血功能是否正常；观察突变体是否有bernard
‑
soulier syndrome的临床症状如皮肤黏膜出血以及内脏出血的表现。
25.与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
26.(1)本发明提供的突变体斑马鱼能应用在筛选对巨大血小板综合征有效的药物；该斑马鱼gp9
smu15
突变体胚胎期血小板的数目减少，且成年期凝血功能异常，有些gp9
smu15
突变体的皮肤黏膜有出血的症状，具有与人bss疾病的相似症状；由于斑马鱼产卵量多，养殖
方便，饲养的费用较饲养老鼠低的特点，有利于高通量筛选治疗巨大血小板综合征的药物，花费较少；另外，gp9
smu15
突变体胚胎期血小板的数目减少，可以在胚胎期对斑马鱼进行药物处理来筛选有效的药物，实验周期短。
27.(2)本发明中的巨大血小板综合征的斑马鱼模型，由于其稳定遗传性可以用于长期追踪疾病的发病机制，从胚胎期到成年期疾病的进展。并且gp9
smu15
突变体具有稳定遗传的血小板减少的表型，gp9
smu15
突变体还可以用来扩展研究血小板凝血功能障碍和血小板相关疾病的机制。
28.(3)在小鼠中，现有bernard
‑
soulier syndrome的疾病模型，主要是由血小板膜上gpib
‑
ix
‑
v复合体其中一个亚基gpib基因缺陷所导致的；而gpix即gp9的基因缺陷所导致的bernard
‑
soulier syndrome的小鼠模型至今还没有；斑马鱼gp9
smu15
突变体是由gpib
‑
ix
‑
v复合体其中一个亚基gpix的基因缺陷所导致的，而有一些bss的病人是由于gpix的基因缺陷所导致的，斑马鱼gp9
smu15
突变体可以提供针对gpix的基因缺陷导致bss的疾病模型；同时，可以研究血小板膜蛋白gp9在血液系统中所发挥的作用。
29.(4)本发明中gp9
smu15
突变体具有以下表型：
①
gp9
smu15
突变体胚胎期血小板的数目减少，gp9
smu15
突变体血小板的增殖减少，凋亡不变；
②
成年期，gp9
smu15
突变体凝血障碍，损伤后，出血时间显著延长；
③
成年期，约1/5gp9
smu15
突变体的鱼有皮肤黏膜出血的症状，与bernard
‑
soulier syndrome病人的症状相似；
④
成年期，gp9
smu15
突变体外周血的血小板的比例减少。
附图说明
30.图1是crispr/cas9靶向基因敲除技术获得斑马鱼突变体gp9
smu15
示意图；其中图1中的ai部分为crispr/cas9靶向基因敲除设计方案，选择斑马鱼gp9基因的2号外显子序列作为靶点进行基因敲除。其中图1中的aii部分为经测序得到突变体gp9
smu15
在靶点位置缺失了17个碱基，缺失后gp9蛋白提前终止，缺乏重要的功能域。图1中的aii部分为gp9
smu15
突变体蛋白相对于野生型，缺乏lrrnt(leucine
‑
rich repeat n
‑
terminal domain)为n端富含亮氨酸重复序列结构域；lrrct(leucine
‑
rich repeat c
‑
terminal domain)为c端富含亮氨酸重复序列结构域。
31.图2是3dpf的鱼血液表型结果图；图2的a部分为流式检测结果图，图2的b部分为为流式统计图，显示3dpf的野生型同胞鱼和突变体gp9
smu15
的cd41gfphigh细胞的数量显著降低，图2的c部分为为wish整体原位杂交图，图2的d部分为为统计图，显示突变体gp9
smu15
的cd41基因表达较野生型同胞鱼显著减少；图2的e部分为为qpcr检测基因表达量，显示突变体gp9
smu15
血小板相关基因的表达减少(t
‑
检验，p<0.05；均数
±
标准误，n表示相应组别中斑马鱼的样本量)。
32.图3是在56hpf,wt(gp9
+/+
)和gp9
smu15
突变体斑马鱼血小板增殖和凋亡实验结果图；其中，图3的a部分为wt(gp9
+/+
)和gp9
smu15
突变体血小板前体细胞cd41:gfp和brdu双染实验结果图(上边：cd41染色，中间：brdu，下边：合成图)，箭头显示cd41:gfp与brdu共染阳性细胞；图3的b部分为wt和gp9
smu15
突变体中cd41:gfp
+
血小板增殖细胞比例统计图(t
‑
检验，p<0.01；均数
±
标准误)；图3的c部分为在3dpf，wt和gp9
smu15
突变体血小板cd41:gfp和tunel双染实验(上边：cd41染色，中间：tunel染色，下边：合成图)。
33.图4是在成年期，wt和gp9
smu15
突变体斑马鱼外周血中血小板的比例结果图；其中图4的a部分边为流式分析图，图4的b部分为cd41:gfp
+
血小板的比例统计图。
34.图5是在成年期，损伤wt和gp9
smu15
突变体斑马鱼尾部的凝血时间实验结果统计图(t
‑
检验，p<0.001；均数
±
标准误)。
具体实施方式
35.以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
36.本发明中所使用的术语“野生型”或者“wt”都是指野生型斑马鱼。
37.本发明中所使用的术语“dpf”指受精后的天数。
38.实施例1
39.1、材料和方法：
40.(1)斑马鱼养殖
41.斑马鱼的养殖如文献(westerfield m:the zebrafish:guide for the laboratory use of zebrafish(brachdanio rerio).edition by eugene,or,m.westerfield,1993)所述。
42.(2)本发明中用到如下的品系：ab野生型斑马鱼、gp9
smu15
突变体斑马鱼、tg(cd41:gfp)转基因斑马鱼。其中，将各个转基因斑马鱼系与gp9
smu15
突变体斑马鱼杂交后再自交获得cd41转基因背景的gp9
smu15
突变体斑马鱼，如tg(cd41:gfp)；gp9
‑
/
‑
。
43.(3)crispr/cas9
‑
靶向基因敲除gp9基因(可参照图1所示)
44.选择gp9基因的2号外显子序列atg起始密码子之后的序列作为靶向敲除的序列，根据http://www.crisprscan.org/网站预测的得分高，靶点效率高的，脱靶效率低的靶点序列gggcaaagtcacgcacctgc，该序列之后agg构成pam区，最后合成引物的序列为t7(17bp)+target+grna fp(20bp)序列：5
’‑3’
taatacgactcactatagggcaaagtcacgcacctgcgttttagagct agaaatag，grna rp序列:5
’‑3’
agcaccgactcggtgccact，以z
‑
cas9质粒为模板，用t7 rna聚合酶(thermo，ep0111)体外合成。
45.所得的突变体为gp9基因的2号外显子缺失了17个碱基，导致了移码突变，提前终止，产生了截短的gp9蛋白；相对于野生型gp9蛋白，缺失了lrrnt和lrrct重要的功能域。
46.实施例2
47.整体原位杂交(whole
‑
mount in situ hybridization)检测gp9
smu15
突变体血小板相关基因的表达
48.按照以下标准实验操作流程完成(thissec,thisse b.(2008).high
‑
resolution in situ hybridization to whole
‑
mount zebrafish embryos.nature protocols.vol.3no.1).
49.结果如图2的c部分、图2的d部分所示，在3dpf,gp9
smu15
突变体中血小板的标记分子cd41的信号相对于野生型较少，说明gp9
smu15
突变体血小板数目有可能减少。
50.实施例3q
‑
pcr检测gp9
smu15
突变体血小板相关基因的表达
51.收集3dpf wt和3dpfgp9
smu15
突变体的鱼，使用tripure rna isolation reagent
(thermo,15596018)提取胚胎的总rna，按照说明书的操作步骤实施。用m
‑
mlv逆转录酶(promega,m1701)逆转录成cdna。用斑马鱼elf1a为内参基因进行q
‑
pcr检测，其中引物的序列信息如下表1所示。
52.表1
[0053][0054][0055]
结果如图2的e部分所示，在3dpf,gp9
smu15
突变体相对于野生型，血小板相关的基因cd41,nfe2,fog1的表达都下降，结合cd41整体原位杂交的结果，进一步说明了在胚胎期，gp9
smu15
突变体中血小板的数目减少。
[0056]
实施例4胚胎期血小板的增殖和凋亡检测
[0057]
溴脱氧尿嘧啶核苷(brdu)实验参照说明书来实施。用10mm浓度的brdu(sigma
‑
aldrich；b5002)浸泡56hpf的转基因系tg(cd41:gfp)gp9
+/+
和gp9
smu15
突变体1小时，再用鼠源性brdu抗体(roche；10875400)和山羊来源gfp抗体(abcam；ab66580)进行孵育12
‑
14小时)，再和抗鼠的555(thermo；a31570以及抗山羊的488(thermo；a11055)荧光进行染色，分别标记结果如图3的a部分所示。同时利用末端脱氧核苷酰转移酶介导的dutp缺口末端标记(tunel)检测细胞凋亡的实验。用in situ cell death detection试剂盒(roche；12156792910)进行检测，用山羊来源gfp抗体(abcam；ab66580)和抗山羊的488荧光进行染色。如图3的b部分所示：相对于野生型，gp9
smu15
中gfp信号数和brdu共定位的细胞占所有gfp的信号的百分比降低，说明在gp9
smu15
中血小板的增殖减少。而tunel结果如图3的c部分所示，没有共定位的凋亡细胞，说明gp9
smu15
中血小板的凋亡没有变化。
[0058]
实施例5流式细胞术检测幼虫及成年期外周血中血小板的数目
[0059]
幼鱼处理：选取tg(cd41:gfp)野生型和tg(cd41:gfp)gp9
smu15
3dpf的幼虫，将组织研碎后重悬于5％fbs悬浮。成鱼处理：选取tg(cd41:gfp)野生型和tg(cd41:gfp)gp9
smu15
成年鱼，用冰麻醉成鱼，通过戳鳃取外周血，用5％fbs悬浮外周血，均通过流式分析检测野生型和gp9
smu15
突变体中gfp即血小板占外周血中细胞的百分比大小，并进行统计学分析。通过流式分析检测野生型和gp9
smu15
突变体gfp即血小板占外周血中细胞的百分比大小，并进行统计学分析。对3dpf的幼虫，如图2的a部分、图2的b部分所示，相对于野生型，gp9
smu15
中gfp
high
代表的血小板的数目减少。对于成鱼，如图4的a部分、图4的b部分所示：相对于野生型，gp9
smu15
外周血中血小板的数目减少。
[0060]
实施例6凝血实验和自发出血的情况
[0061]
用刀片对成鱼野生型和gp9
smu15
的尾巴进行切割，切割后开始计时，测成鱼出血到凝血所需的时间。如图5所示，相对于野生型，gp9
smu15
突变体的成鱼所需的时间更长，说明gp9
smu15
突变体凝血功能出现障碍。并且观察了突变体中尾巴黏膜出血的情况，19条gp9
smu15
突变体中有4条出现尾巴黏膜出现出血的症状。
[0062]
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。