一种抑制胶原合成和沉积的化合物及其应用

本发明涉及一种抑制胶原合成和沉积的小分子化合物及其药学上可接受的盐以及在预防或治疗特发性肺纤维化的应用。
背景技术：
：器官纤维化，如肺纤维化、肾纤维化、肝纤维化、心肌纤维化等，是一类严重危害人类身体健康及生命的重大疾病。近年来，随着全球工业化以及人们生活、饮食方式的改变，纤维化疾病的发病率明显增加。特发性肺纤维化(ipf)是一种原因不明、局限于肺，以普通型间质性肺炎为病理特征的慢性进行性发展的纤维化性间质性肺疾病。ipf侵犯肺泡壁、肺泡腔进而发展为弥漫性肺间质纤维化，患者最终因呼吸衰竭而死亡。有关统计结果表明，ipf患者5年存活率只有20％。该病预后不良，目前临床缺乏有效的治疗方法，属who所列疑难病之一。近年来ipf发生有明显上升的趋势。去年开始在全球爆发的新冠病毒感染后期也存在潜在的肺纤维化后遗症。目前临床可用于ipf疾病治疗的药物仅有吡非尼酮和尼达尼布，适用于轻度及中度ipf患者，临床具有一定的不良反应，并且药物价格昂贵，本领域迫切需要研发有效治疗ipf的新化合物和新治疗途径。肺纤维化形成过程复杂，发生机制尚未完全阐明。目前的研究认为：肺纤维化起源于肺泡上皮细胞微损伤和异常的损伤修复。肺纤维化是肺组织受损后的病理性修复过程，其主要病理特征为成纤维细胞和肌成纤维细胞的增殖、细胞外基质(ecm)的沉积和成纤维细胞灶的形成。胶原是ecm的主要组成部分。胶原的生物合成包含转录、翻译和翻译后的修饰以及分泌等一系列复杂的过程。其中，胶原的翻译后修饰是胶原生物合成中至关重要的一步。近年来的研究发现胶原翻译后修饰过程中的两个特异性酶：脯氨酰羟化酶(p4h)和赖氨酰氧化酶(lox)与肺纤维化的发生发展密切相关。在细胞内质网，p4h催化前胶原多肽链脯氨酸残基的羟基化，使前胶原分子在胞内形成稳定的三螺旋结构。p4h对胶原的稳定性起着重要作用：p4h活性增加时促进胶原沉积、硬度增加。luo等在ipf病人及博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠肺组织中均发现p4h表达明显增加；肺纤维化小鼠给予p4h抑制剂吡啶-2,5-二甲酸(pdca)后则降低p4h基因表达，减弱胶原合成，减轻肺纤维化，提示p4h可能是治疗纤维性疾病的潜在靶点。n-草酰甘氨酸、吡啶-2,4-二甲酸、3,4-二羟基苯甲酸以及简单的金属螯合剂，例如2,2’-联吡啶均可抑制p4h；但是这些p4h抑制剂存在着不少缺陷，比如水溶性差难以溶解，以及对p4h的选择性不高、存在较大的细胞毒性等等。三螺旋原胶原经修饰后，分泌到ecm中并自我组装形成微纤维结构。形成微纤维结构过程中，前原胶原n端和c端的特异性赖氨酸残基和羟基化赖氨酸残基被lox氧化形成各自的醛化形式，随后发生一系列缩合反应形成分子间和分子内的共价交联。这种交联结构使组织胶原纤维之间紧密连接,增加ecm的稳定性,并且可抵抗胶原酶的水解。lox的表达及其活性调节在保持ecm结构的完整性方面起重要作用。lox被认为是多种器官纤维化的中间作用因子，促进胶原与弹性纤维的交联，促进ecm的沉积及硬化。病理情况下，lox通过催化过多的胶原蛋白交联，引起肺纤维化。抑制lox的活性，可降低ecm中胶原的稳定性并诱导胶原的消化分解，被认为是肺纤维化治疗的新靶点。大多数报道的lox抑制剂是伯胺，例如β-氨基丙腈(bapn)、取代苄胺、氨基脲衍生物和氨基硫脲衍生物等，这些抑制剂通过氨基和辅基中的醌形成希夫碱，并通过附近的亲核基团稳定产物，从而起到抑制作用。然而大多数早期的不可逆lox抑制剂存在较多的副作用，并且部分脂溶性较小，难以透过细胞膜。鉴于单一的p4h抑制剂或lox抑制剂在肺纤维化干预中的局限性，而双重抑制剂具有一致的admet药动学性质，可在同一组织器官发挥药效作用、便于使用的优越性，我们提出通过单一化学实体实现双重靶向p4h和lox抑制胶原合成和沉积、协同干预肺纤维化的研究新策略。目前国内外尚无双重靶向p4h和lox抑制胶原合成和沉积的小分子化合物干预ipf的文献报道。技术实现要素：针对现有技术中，ipf治疗药物吡非尼酮高剂量引起的肠胃不适、乏力及光敏性皮炎等诸多副作用，本发明提供一种抑制胶原合成和沉积、具有高效和低毒的抗肺纤维化小分子化合物及其药学上可接受的盐。本发明通过拼合原理将p4h抑制剂pdca和lox抑制剂bapn连接，获得结构新颖的小分子化合物。本发明涉及的小分子化合物，体外能抑制肺成纤细胞增殖、减少肺成纤细胞分泌胶原标志物羟脯氨酸(hyp)；动物水平减少肺纤维化大鼠肺组织hyp含量，下调促纤维化因子转化生长因子(tgf-β1)蛋白和基质金属蛋白酶(mmp-9)水平、上调抗纤维化因子金属蛋白酶组织抑制因子(timp-1)水平，减少胶原沉积，干预肺纤维化过程。其抗肺纤维化效果明显优于现有的治疗药物吡非尼酮，并且可降低药物使用剂量，减轻毒副作用。详细
发明内容如下：一种抑制胶原合成和沉积的小分子化合物，具有如式i所示结构：其中，r独立地选自羟基、c1-c4烷氧基、α-氰基甲基氨基、β-氰基乙基氨基、γ-氰基丙基氨基或δ-氰基丁基氨基。进一步地，r独立地选自β-氰基乙胺基、甲氧基或羟基；即化合物cq11(r＝β-cn-ch2ch2nh)、cq15(r＝och3)和cq16(r＝oh)。本发明还提供了上述小分子化合物在药学上可接受的盐，所述的药学上可接受的盐为所述的小分子与无机酸、有机酸反应成盐。所述的药学上可接受的盐为盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、草酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、富马酸盐、牛磺酸盐、柠檬酸盐或琥珀酸盐，或者其混合盐。一种抑制胶原合成和胶原沉积的小分子化合物的制备方法，举例如下：方法1：以pdca(吡啶-2,5-二甲酸)和bapn(β-氨基丙腈)为原料，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)为缩合剂，三乙胺(tea)为缚酸剂，在二氯甲烷(dcm)中反应获得化合物cq11，反应式如下；方法2：以5-(甲氧基羰基)-2-吡啶甲酸与bapn(β-氨基丙腈)为原料，edc为缩合剂，tea为缚酸剂，反应得到化合物cq15，再经naoh水解得到化合物cq16，反应式如下；本发明还提供了一种抑制胶原合成和胶原沉积的小分子化合物及其药学上可接受的盐在制备治疗特发性肺纤维化疾病药物中的应用。初步的体内外药理试验发现该类化合物对人肺成纤维细胞hfl1有较好的抑制增殖作用，增殖抑制作用大大优于吡非尼酮；其次具有显著地减少hyp生成、抑制胶原合成的作用。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明提供了一种抑制胶原合成和胶原沉积的小分子化合物，应用拼合原理，通过化学合成的方法将p4h抑制剂和lox抑制剂构建成结构新颖的小分子化合物。然后，细胞水平证实所构建的小分子化合物能抑制成纤维细胞增殖，减少hyp的分泌量；动物水平证实所构建的小分子化合物能减少肺纤维化大鼠肺组织hyp的含量，下调肺组织tgf-β1蛋白和mmp-9水平，抑制胶原合成和胶原沉积，其抗肺纤维化效果显著优于现有上市药物吡非尼酮。该类化合物具有成为ipf治疗新药的潜力，不仅具有科学价值还具有重要的社会价值。附图说明图1为化合物对hfl1细胞的毒性的表征图；图2为化合物对纤维化hfl1细胞增殖的抑制作用的效果图；图3为化合物对纤维化hfl1细胞分泌hyp的影响图；图4为化合物对博莱霉素诱导的肺纤维化大鼠肺组织he染色的影响图；图5为化合物对博莱霉素诱导的肺纤维化大鼠肺组织masson染色的影响图；图6为化合物对博莱霉素诱导的肺纤维化大鼠肺组织tgf-β1、mmp-9和timp-1免疫组化染色半定量分析结果图。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。原料可以从商业途径获得，或者通过本领域已知的方法制备，或根据本文所述方法制备。目标化合物的结构通过核磁共振(nmr)来确定。nmr采用brukerdrx400型核磁共振仪测定，溶剂为氘代氯仿(cdc13)或氘代二甲亚砜(dmso-d6)，tms为内标。hrms采用waterssynaptg2测定，熔点采用buchim565熔点仪测定。柱层析采用200-300目硅胶。实施例1cq11(ⅰ,r＝β-cn-ch2ch2nh)的制备三口烧瓶中依次加入pdca(吡啶-2,5-二甲酸)167mg(1mmol)、bapn168mg(2.4mmol)和二氯甲烷40ml搅拌，之后加入edc400mg(2mmol)，并加入催化量三乙胺，室温25℃搅拌反应，tlc监测反应终点。反应毕，反应液用适量饱和碳酸氢钠溶液洗涤三次，分液，合并有机层，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩至干。硅胶柱层析纯化：dcm/meoh梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩、真空干燥得21mg白色固体cq11，mp：188.0-189.0℃；纯度：99％(hplc)。1h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.24(dt,j＝16.1,5.7hz,1h),9.06(d,j＝1.4hz,1h),8.40(dd,j＝8.1,2.2hz,1h),8.17(d,j＝8.2hz,1h),3.79-3.41(m,4h),2.97-2.66(m,4h).13c-nmr(100mhz,dmso-d6)δ164.97,163.99,151.88,147.88,137.08,132.33,122.31,119.67,35.78,18.25.hrmsm/z(esi)calcdforc13h13n5o2[m+na]+:294.0967；found:294.0957。实施例2cq15(ⅰ,r＝och3)的制备烧瓶中加入5-(甲氧羰基)-2-吡啶甲酸9.0g(0.05mol)，400ml二氯甲烷；室温搅拌下依次加入edc10.0g50mmol)、bapn4.2g(0.06mol)和三乙胺1.5ml(0.01mol)，继续室温搅拌，tlc监测反应终点。反应毕，反应液水洗三次，合并收集二氯甲烷层，无水硫酸钠干燥，浓缩至干得粗品。乙醇水溶液重结晶得白色固体cq15，mp:136.0-137.0℃；纯度：99％(hplc)。1h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.33(s,1h),9.15(dd,j＝2.1,0.8hz,1h),8.52(dd,j＝8.1,2.1hz,1h),8.22(dd,j＝8.1,0.8hz,1h),3.95(s,3h),3.59(q,j＝6.5hz,2h),2.84(t,j＝6.6hz,2h).13c-nmr(100mhz,dmso-d6)δ165.12,163.77,153.10,149.39,139.23,128.32,122.62,119.61,53.18,35.63,17.87.hrms(esi)m/zcalcdforc11h11n3o3[m+h]+：234.0879,found234.0885。实施例3cq16(ⅰ,r＝oh))的制备cq15233mg(1mmol)用2ml甲醇溶解，倒入装有naoh水溶液20ml的圆底烧瓶，常温搅拌反应，tlc监测至cq15完全消失。反应毕，反应液用适量乙酸乙酯洗涤三次，水层用稀盐酸调节ph至2-3，加入适量乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯层，无水硫酸钠干燥、浓缩得193mg浅黄色固体cq16，mp:196.0-197.0℃；纯度：99％(hplc)。1h-nmr(400mhz,dmso-d6),δ13.29(s,1h),9.12(s,1h),8.94(m,j＝6hz,1h),8.46(dd,j1＝2.3hz,j2＝0.9hz,1h),8.16(d,j＝8.2hz,1h),3.48(m,j＝6.7hz,2h),2.55(t,j＝6.8hz,2h).13c-nmr(100mhz,dmso-d6)δ166.08,163.88,152.79,149.61,139.24,124.98,122.48,119.60,hrms(esi)m/zcalcdforc10h9n3o3[m+h]+：220.0722,found220.0728。实施例4化合物cq15的盐酸盐取cq15100mg，溶于1ml乙酸乙酯，冰水浴中冷却至0℃，滴加饱和hcl乙酸乙酯溶液，离心干燥得白色固体，收率70％。实施例5体外抗肺纤维化药效测试(1)对人肺成纤维细胞hfl1的毒性hfl1细胞接种于96孔板，配制不同浓度的cq11、cq15、cq16、pdca(p4h抑制剂)和bapn(lox抑制剂)给药，培养24h后，mtt法检测计算细胞存活率，结果见图1。图1可见：bapn对hfl1细胞毒性最小，cq15、cq16和cq11其次，pdca对hfl1细胞毒性较大。(2)对纤维化hfl1细胞增殖的抑制作用设正常对照组、tgf-β1模型对照组、阳性对照pdca(p4h抑制剂)组、阳性对照bapn(lox抑制剂)组、阳性对照pdca+bapn联用组、阳性对照pfd组和受试药物cq11、cq15和cq16治疗组。除正常对照组外，其余各组用tgf-β1诱导hfl1细胞24h后，分别加入一定浓度的含药培养液。mtt法检测化合物对纤维化hfl1细胞增殖的抑制作用，结果见图2和表1。表1化合物对纤维化hfl1细胞增殖抑制活性compd.ic50(μm)pfd2.96cq110.68cq150.43cq160.66pdca0.79bapn1.57pdca+bapn1.01由图2和表1可见：cq11、cq15和cq16具有较好的增殖抑制活性，其抑制作用较p4h抑制剂pdca、lox抑制剂bapn单一使用及联合使用均强，较上市药物pfd强。(3)对纤维化hfl1细胞分泌hyp的影响，结果见图3。由图3可见：cq15抑制tgf-β1诱导的hyp效果最为显著，其抑制作用较pdca、bapn单用及pdca和bapn联合用药均强，较上市药物pfd强。实施例6cq15对博莱霉素诱导的肺纤维化大鼠的药效评价(1)动物模型和实验分组选择sd大鼠，通过气管内注射博来霉素5mg/ml，正常饲养14天，建立肺纤维化大鼠模型。实验分为6组：即正常对照组、模型对照组、阳性对照组(吡非尼酮240mg/kg，按照临床剂量换算)、受试药物cq15低剂量治疗组(60mg/kg)、cq15中剂量治疗组(120mg/kg)和受试药物cq15高剂量治疗组(240mg/kg)。每组10只。正常对照组和模型组给予等体积生理盐水，其余各组相应药物连续灌胃28天，每天1次。灌胃28天后，各组大鼠取血后处死，迅速取左肺组织适量，4％甲醛固定，行he和masson染色。右肺液氮保存，待测tgf-β1等相关指标。检测血清hyp和纤溶酶原激活物抑制剂-1(pai-1)含量。(2)大鼠肺组织he染色结果大鼠肺组织he染色结果见图4，he染色光镜下正常组大鼠未见明显病变，肺内结构清晰，肺血管分支均无异常，肺泡间隔未见增厚，无炎症、水肿及纤维化表现，肺泡腔内无明显渗出，管腔内未见炎性细胞、分泌物或脱落上皮。模型组肺泡间隔明显增厚，肺泡结构破坏，部分肺泡腔消失；肺泡中可见巨噬细胞、单核细胞等炎性细胞浸润。阳性对照吡非尼酮组和中、高剂量cq15组肺泡间隔增厚，肺泡结构基本正常，肺泡腔内渗出明显减少；其中中剂量cq15组与阳性对照吡非尼酮组效果相当，高剂量cq15组效果明显优于吡非尼酮组。(3)大鼠肺组织masson胶原纤维染色结果大鼠肺组织masson胶原纤维染色结果见图5，图5可见：模型组可见间质胶原纤维显著增多且广泛着蓝色，局部形成蓝色的纤维团块，呈中到重度肺纤维化改变；cq15中剂量组和高剂量组及吡非尼酮组蓝色胶原纤维显著减少，胶原分布及染色面积较模型组显著减少，并且cq15中剂量效果与吡非尼酮相当；高剂量效果明显优于吡非尼酮。提示：cq15对博莱霉素诱导的肺纤维化大鼠具有较显著地抑制胶原、改善肺纤维化症状作用。(4)cq15对肺纤维化大鼠血清hyp和pai-1的影响elisa检测血清hyp和pai-1含量，结果见表2。表2可见：博来霉素诱导后大鼠血清hyp含量较正常组明显增加，阳性对照吡非尼酮组和cq15低、中、高剂量组较模型组显著降低。胶原的另一个生化指标pai-1，模型组较正常组明显增加，吡非尼酮组和cq15低、中、高剂量组较模型组则降低，其中cq15中剂量组抑制效率优于吡非尼酮组，高剂量效果明显优于吡非尼酮。以上实验结果提示：cq15可显著下调博来霉素诱导的肺纤维化血清胶原含量。表2肺纤维化大鼠血清hyp和pai-1含量结果与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01。(5)cq15对肺纤维化大鼠肺组织tgf-β1、mmp-9和timp-1的影响对各组大鼠肺组织tgf-β1、mmp-9和timp-1进行免疫组化染色，经软件半定量分析，结果见图6。图6可见：模型组大鼠高表达tgf-β1、mmp-9，低表达timp1。经cq15干预后，可见cq15低中高剂量组和阳性对照吡非尼酮组tgf-β1、mmp-9表达均有不同程度的下降，timp1表达上调，，肺纤维化干预作用cq15中剂量组与吡非尼酮相当，高剂量组明显优于吡非尼酮。提示：cq15给药后，能显著下调与胶原沉积密切相关的tgf-β1和mmp-9水平，上调timp1，从而显著减轻纤维化症状。当前第1页12