一种基于单色多重荧光定量PCR的鉴别良恶性肺结节的方法与流程

本发明涉及肺癌检测技术领域，尤其涉及一种基于单色多重荧光定量pcr的鉴别良恶性肺结节的方法。

背景技术：

随着人们生活水平的提高，大气环境的质量却不断下降，吸烟人数的增加与空气中pm2.5含量的增多，增加了患有肺部疾病的风险。肺癌是我国肿瘤发病率和死亡率第一位的癌症，我国每年肺癌发病约78.1万，死亡病例约62.6万。肺癌占男性发病率和死亡率的第一位，女性发病率的第二位和死亡率的第一位。据全球癌症生存趋势监测报告报道，肺癌的五年生存率为21.2％，仅高于胰腺癌的五年生存率11.5％。肺癌发病隐匿，其临床表现与生长部位、浸润程度、转移以及伴癌综合征有关，但是一旦出现临床症状，多数已经是中晚期，其五年生存率较早期发现的肺癌明显下降。因此，急需一种能够在癌症早期就能判断病人预后的分子标志物，筛选出预后较差、肺癌进展较快的病人，及时使用效果更好的化疗药物，对挽救病人的生命具有重要意义。

目前，临床上常用的肺癌筛查的方法主要有，胸部标准x线照相(cxr)、多层螺旋ct、低剂量ct(ldct)、痰脱落细胞学检查、支气管内镜检查和基于痰标本、外周血标本、支气管肺泡灌洗液等的病理学检查。然而，这些检测手段均存在以下问题：①每种检查手段都有一定的局限性，都缺少能降低肺癌死亡率的客观依据；②痰细胞学检查的阳性率有待提高，新技术、新手段用于痰细胞学的检查尚需进一步研究；③临床上可用于肺癌筛查的肿瘤标志物少，且敏感性和特异性都较差；④大样本、多中心和前瞻性随机研究不多。

技术实现要素：

(一)发明目的

为解决背景技术中存在的技术问题，本发明提出一种基于单色多重荧光定量pcr的鉴别良恶性肺结节的方法，基于taqman探针法荧光定量pcr技术，利用本团队先前研究成果中的基因标志物，选择在恶性肺结节样本中相对于良性肺结节样本下调表达的4个基因，设计全新的荧光定量pcr引物和探针，对所有的4个目的基因对应的探针都使用同一荧光基团进行标记，从而达到累计放大区分的效果，进而实现在无需测序的情况下完成对良恶性肺结节的鉴别区分。

(二)技术方案

为解决上述问题，本发明提供了一种基于单色多重荧光定量pcr的鉴别良恶性肺结节的方法，包括用于多重荧光pcr检测的上、下游引物以及探针；上、下游引物分别为adgrb1-f/r、cntnap2-f/r、dip2b-f/r、lonrf2-f/r，探针分别为adgrb1-probe、cntnap2-probe、dip2b-probe、lonrf2-probe，内参基因β-actin上、下游引物分别为β-actin-f/r，探针为β-actin-probe；

上、下游引物序列具体如下：

adgrb1-f(seqidno.1)：5’-gacagtgcactttcttcc-3’

adgrb1-r(seqidno.2)：5’-caggttcctgtagagcac-3’

cntnap2-f(seqidno.3)：5’-ggctaggaaagggaaatc-3’

cntnap2-r(seqidno.4)：5’-gatgcagaagatggatga-3’

dip2b-f(seqidno.5)：5’-ggaagggaagaaaagataaatatc-3’

dip2b-r(seqidno.6)：5’-gctctgcctcaatcagta-3’

lonrf2-f(seqidno.7)：5’-cagagacaaggaaacaga-3’

lonrf2-r(seqidno.8)：5’-tggcttaaaacaacacata-3’

β-actin-f(seqidno.13)：5’-taggcacacacttccaag-3’

β-actin-r(seqidno.14)：5’-tggctcatgcctgtaatc-3’

探针序列具体如下：

adgrb1-probe(seqidno.9)：5’fam-caccacaaacacggatgcttca-3’bhq1

cntnap2-probe(seqidno.10)：5’fam-aagtacctggttcatcgcactg-3’bhq1

dip2b-probe(seqidno.11)：5’fam-ttgcagccagaatgtagcctt-3’bhq1

lonrf2-probe(seqidno.12)：5’fam-cacaacctccaaagagaaacgcat-3’bhq1

β-actin-probe(seqidno.15)：5’texasred-aattatctgtagaggtatggcttctcacc-3’bhq2。

本发明提供的一种基于单色多重荧光定量pcr的鉴别良恶性肺结节的方法，检测步骤如下：

s1、提取血浆游离dna；

s2、通过葡糖基转移酶t4-β-gt，将含叠氮修饰基团的糖udp-6-n3-glucose的修饰基团转移到5-羟甲基胞嘧啶的羟甲基上；

s3、在叠氮基团标记的5-羟甲基胞嘧啶上添加一分子生物素二苯基环辛炔-四聚乙二醇-生物素；

s4、将含有5-羟甲基胞嘧啶标记的dna片段结合在固相材料链霉素亲和素免疫磁珠上；

s5、利用缓冲液多次洗涤所述固相材料去除未结合的dna片段；

s6、将结合在链霉亲和素免疫磁珠上的dna洗脱下来，作为模板；

s7、对上述dna进行多重荧光定量pcr扩增；

s8、收集荧光信号，选择上述荧光基团的荧光检测模式，选择内参基因β-actin为参照，对待测样品进行编板设置；

s9、结果判定：待测样品荧光扩增曲线呈现良好的对数增长，若待测样品cq-texasred-cq-fam＞1.55，为良性，若cq-texasred-cq-fam＜1.55，则判断为恶性。

优选的，在s3中，通过点击化学方法在叠氮基团标记的5-羟甲基胞嘧啶上添加一分子生物素二苯基环辛炔-四聚乙二醇-生物素。

优选的，在s4中，通过固相亲和反应将含有5-羟甲基胞嘧啶标记的dna片段结合在固相材料链霉素亲和素免疫磁珠上。

优选的，在s5中，所述缓冲液为含有tris-hcl、edta、nacl和表面活性剂tween20的缓冲液。

优选的，在s7中荧光定量pcr扩增的反应体系具体如下：2×taqprohsu+probemastermix，所述pcr检测上、下游引物终浓度为0.4μm，所述探针终浓度为0.2μm，所述dna为1μl，其余用超纯水加至总体积20μl。

优选的，在s7中荧光定量pcr扩增的反应程序为：消化污染阶段为37℃2min，预变性阶段为95℃30sec，扩增阶段95℃20sec，60℃30sec，扩增45个循环。

本发明的上述技术方案具有如下有益的技术效果：

本发明提供了一种基于单色多重荧光定量pcr的鉴别良恶性肺结节的方法，基于taqman探针法荧光定量pcr技术，利用本团队先前研究成果中的基因标志物，设计全新的荧光定量pcr引物和探针，对所有的4个目的基因对应的探针都使用同一荧光基团进行标记，从而达到累计放大区分的效果，进而实现在无需测序的情况下完成对良恶性肺结节的鉴别区。

附图说明

图1为本发明提出的一种基于单色多重荧光定量pcr的鉴别良恶性肺结节的方法中pcr扩增曲线图。

图2为本发明提出的一种基于单色多重荧光定量pcr的鉴别良恶性肺结节的方法中的肺结节良恶性区分auc曲线图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。

实施例1

根据本团队先前研究成果中恶性肺结节样本相对于良性肺结节样本下调表达的区域片段，利用beacondesigner8软件设计荧光pcr的组靶标，本发明提出的一种基于单色多重荧光定量pcr的鉴别良恶性肺结节的方法，包括用于多重荧光pcr检测的上、下游引物以及探针；上、下游引物分别为adgrb1-f/r、cntnap2-f/r、dip2b-f/r、lonrf2-f/r，探针分别为adgrb1-probe、cntnap2-probe、dip2b-probe、lonrf2-probe，内参基因β-actin上、下游引物分别为β-actin-f/r，探针为β-actin-probe；

上、下游引物序列具体如下：

adgrb1-f(seqidno.1)：5’-gacagtgcactttcttcc-3’

adgrb1-r(seqidno.2)：5’-caggttcctgtagagcac-3’

cntnap2-f(seqidno.3)：5’-ggctaggaaagggaaatc-3’

cntnap2-r(seqidno.4)：5’-gatgcagaagatggatga-3’

dip2b-f(seqidno.5)：5’-ggaagggaagaaaagataaatatc-3’

dip2b-r(seqidno.6)：5’-gctctgcctcaatcagta-3’

lonrf2-f(seqidno.7)：5’-cagagacaaggaaacaga-3’

lonrf2-r(seqidno.8)：5’-tggcttaaaacaacacata-3’

β-actin-f(seqidno.13)：5’-taggcacacacttccaag-3’

β-actin-r(seqidno.14)：5’-tggctcatgcctgtaatc-3’

探针序列具体如下：

adgrb1-probe(seqidno.9)：5’fam-caccacaaacacggatgcttca-3’bhq1

cntnap2-probe(seqidno.10)：5’fam-aagtacctggttcatcgcactg-3’bhq1

dip2b-probe(seqidno.11)：5’fam-ttgcagccagaatgtagcctt-3’bhq1

lonrf2-probe(seqidno.12)：5’fam-cacaacctccaaagagaaacgcat-3’bhq1

β-actin-probe(seqidno.15)：5’texasred-aattatctgtagaggtatggcttctcacc-3’bhq2。

本发明中，探针的设计尤为关键，探针可以在引物扩增的片段之间进行选择，但自身不可形成引物二聚体，否则会导致假阴性检测结果，用于多重荧光定量进行检测时。

实施例2

本发明提出的一种基于单色多重荧光定量pcr的鉴别良恶性肺结节的方法，检测步骤如下：

1、提取血浆cfdna：

从肺癌患者术前样本中提取10ng血浆cfdna，可通过本领域技术人员熟知的任何适用于提取血浆cfdna的方法进行抽提。

2、5-羟甲基胞嘧啶标记：

制备总体积为25μl的标记反应混合液：t4噬菌体β-葡糖基转移酶(β-gt)、带有叠氮修饰基团的二磷酸尿苷葡萄糖(udp-6-n3-glu)、10×buffer、和上述21μl的纯化产物。将混合液在37℃孵育2小时；向反应产物中加入2.5μl的二苯基环辛炔-四聚乙二醇-生物素，在37℃孵育2小时；向反应混合物中加入10μg的shearedsalmonspermdna(鲑鱼精dna)，使用bio-rad的microbio-spin30column对上述反应混合液进行纯化，将纯化产物定容至50μl。

3、固相富集含有标记的5-羟甲基胞嘧啶的dna片段：

首先进行磁珠准备步骤：取出5μl的链霉素亲和素免疫磁珠c1streptadvinbeads(lifetechnoiogy)吹打均匀后置于磁力架上，待澄清后吸走上清液，加50μl的2*buffer1(1mph7.5tris，0.5medta，5mnacl，tween20)在旋转架上孵育3min后，置于磁力架上待澄清后吸走上清液，再加50μl的2*buffer1吹打均匀重悬磁珠；然后将磁珠与上述纯化定容的标记产物1:1混合(各50μl)，在旋转混匀仪中室温混匀30分钟，使其充分结合；分别用100μl的buffer1(1x)，buffer2(1x),buffer3，andbuffer4洗脱，每种buffer洗涤两次，每次洗时置于旋转架上5min(旋转之后先瞬离一下避免损失盖上液体)。

3、多重荧光定量pcr扩增：

将结合在磁珠上的dna洗脱下来作为扩增模板，根据实施例1中的多重荧光pcr检测的上、下游引物以及探针，对4个探针添加同一荧光标记fam基团；同时设计内参actb基因引物和探针，探针用texasred荧光标记；在同一管内进行5重荧光定量pcr检测，具体反应体系见表1：

表1

pcr反应条件见表2：

表2

4、收集荧光信号：分别选择fam、texasred荧光检测模式，选择内参基因β-actin为参照，对待测样品进行编板设置；扩增曲线如图1所示。

5、结果判定：待测样品荧光扩增曲线呈现良好的对数增长，若待测样品cq-texasred-cq-fam＞1.55，为良性，若cq-texasred-cq-fam＜1.55，则判断为恶性。40例样本(20例良性肺结节，20例恶性肺结节)前期检测auc结果如图2所示。

本发明提供了一种基于多重荧光定量pcr技术的鉴别良恶性肺结节的方法，基于taqman探针法荧光定量pcr技术，利用本团队先前研究成果中的基因标志物，设计全新的荧光定量pcr引物和探针，对所有的4个目的基因对应的探针都使用同一荧光基团进行标记，从而达到累计放大区分的效果，进而实现在无需测序的情况下完成对肺癌检测。

应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。