一种提高D-阿洛酮糖3-差向异构酶异源表达水平的方法

一种提高d-阿洛酮糖3-差向异构酶异源表达水平的方法
技术领域
1.本发明涉及一种提高d-阿洛酮糖3-差向异构酶异源表达水平的方法，属于生物工程技术领域。


背景技术：

2.近年来，因为过度食用高糖、高脂肪类食物导致导致肥胖症、糖尿病、高血脂和高血压等慢性疾病的发病率陡增。d-阿洛酮糖是一种新型功能性稀少糖，被美国食品药物管理局(fda)认定为食品安全级gras。d-阿洛酮糖具有蔗糖甜度的70％，但热量仅为蔗糖热量的10％，且不易被消化吸收，在食品、营养保健等领域具有较高的应用潜力。
3.d-阿洛酮糖在自然界中含量极少，目前其工业化制备主要由d-阿洛酮糖3-差向异构酶(d-psicose 3-epimerase，dpease)，将d-果糖进行c3位上可逆的羟基差向异构化来生产d-阿洛酮糖。目前已发现agrobacterium tumefaciens、clostridium cellulolyticum、desmospora sp.、ruminococcus sp.等多种来源的dpease。
4.b.subtilis是一种好氧革兰氏阳性细菌，能形成芽孢，不含内毒素，是芽孢杆菌属中最早被用作基因工程宿主的菌种。b.subtilis亦被fda认定gras，同时培养简单迅速、具有良好的发酵基础和生产技术等优势，是工业用酶的理想表达宿主。但在发酵过程中，重组菌受碳分解代谢物阻遏(carbon catabolite repression,ccr)效应的影响，无法高效利用碳源。在b.subtilis中，碳分解代谢物的控制是通过整体调控蛋白碳分解代谢物蛋白a(carbon catabolite proteina，ccpa)实现的。ccpa以含有组氨酸的蛋白质的甲酰基磷酸化复合物的形式与dna结合，其中基因的顺式作用元件位于启动子区域，或位于受调控基因和操纵子的开放阅读框内，称为分解代谢物响应元件(catabolite responsive element，cre)。1990年，weickert等人根据遗传分析，推导了14bp的具有一定对称性的amyo共有序列：tgwaanc*gntnwca(用下划线标出最重要的碱基，n是任何碱基，w表示腺嘌呤或胸腺嘧啶，星号表示对称轴)(proc natl acad sci.1990,87(16):6238-42)。1997年，jeong-ho kim等人发现ccpa保护了一个以amyo共有序列对称轴为中心的26bp区域，并对其中鸟嘌呤的作用亲和力高于对称轴附近的脱氧核苷酸。因此，编码链中
–
2和+5以及模板链中+4和+10的鸟嘌呤脱氧核苷酸，以及他们在dna序列中的对称性定位，都对ccpa与amyo的结合至关重要(nucleic acids research,1997,25(17):3490-3496)。
5.通过cre区域分子改造，缓解ccr效应以提高b.subtilis的碳源利用率，提高外源蛋白dpease表达量，对于d-阿洛酮糖酶法制备行业具有及其重要的意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的是针对异源表达dpease的重组菌株b.subtilis，提供一种通过改造启动子p
amye
的cre区域来提高碳源利用率及dpe表达量的方案。
7.本发明提供一种启动子，所述启动子以核苷酸序列如seq id no.1所示的p
amye
启动子为亲本，对p
amye
启动子的cre区域的-2、+3、+4、+5、+6或+10位点进行单突变。
8.在一种实施方式中，在cre区域的+6位点单突变后，再针对-3、-6或-9位点引入碱基缺失。
9.在一种实施方式中，所述cre区域是指具有对称性的amyo类似核苷酸区域tgtaagcgttaaca。
10.在一种实施方式中，cre区域的-2位点从g突变为c，命名为g2c。
11.在一种实施方式中，cre区域的-2位点从g突变为a，命名为g2a。
12.在一种实施方式中，cre区域的-2位点从g突变为t，命名为g2t。
13.在一种实施方式中，cre区域的+3位点从g突变为c，命名为g3c。
14.在一种实施方式中，cre区域的+3位点从g突变为t，命名为g3t。
15.在一种实施方式中，cre区域的+3位点从g突变为a，命名为g3a。
16.在一种实施方式中，cre区域的+4位点从c突变为g，命名为c4g。
17.在一种实施方式中，cre区域的+4位点从c突变为a，命名为c4a。
18.在一种实施方式中，cre区域的+4位点从c突变为t，命名为c4t。
19.在一种实施方式中，cre区域的+5位点从g突变为c，命名为g5c。
20.在一种实施方式中，cre区域的+5位点从g突变为a，命名为g5a。
21.在一种实施方式中，cre区域的+5位点从g突变为t，命名为g5t。
22.在一种实施方式中，cre区域的+6位点从t突变为a，命名为t6a。
23.在一种实施方式中，cre区域的+6位点从t突变为g，命名为t6g。
24.在一种实施方式中，cre区域的+6位点从t突变为c，命名为t6c。
25.在一种实施方式中，cre区域的+10位点从c突变为g，命名为c10g。
26.在一种实施方式中，cre区域的+10位点从c突变为t，命名为c10t。
27.在一种实施方式中，cre区域的+6位点的t突变成a，并在-3位点引入碱基缺失，命名为t6aδ3。
28.在一种实施方式中，cre区域的+6位点的t突变成a，并在-6位点引入碱基缺失，命名为t6aδ6。
29.在一种实施方式中，cre区域的+6位点的t突变成a，并在-9位点引入碱基缺失，命名为t6aδ9。
30.本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体携带上述的启动子。
31.在一种实施方式中，所述表达载体还包括目的基因；所述目的基因在启动子的下游。
32.在一种实施方式中，所述重组质粒以枯草芽孢杆菌表达载体为骨架，包括但不限于pht01，或pht304,或phy300plk，或pma09，或pdg1663质粒。
33.在一种实施方式中，所述的目的基因为编码d-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因dpe。
34.在一种实施方式中，所述基因dpe的核苷酸序列如seq id no.2所示。
35.携带上述重组质粒的微生物细胞。
36.本发明提供了一种提高目的基因表达量的方法。
37.在一种实施方式中，所述方法为利用上所述启动子诱导目的基因的表达。
38.本发明还提供了一种制备dpease的方法，所述方法为将上述微生物细胞接种至培养基，35～38℃，180～220r
·
min-1
培养1.5～2.5h后，转至31～34℃，180～220r
·
min-1
发
酵45～50h。
39.本发明提供了上述方法制备得到的dpease在制备d-阿洛酮糖方面的应用。
40.本发明提供了上述表达载体及微生物细胞在表达dpease并用于制备d-阿洛酮糖方面的应用。
41.有益效果：
42.将p
amye
的cre区域上相对保守的-2、+3、+4、+5、+6、+10位点进行突变(图1)，以及在+6位点引入点突变(t突变成a)并分别在-3、-6和-9位点引入碱基缺失。同时构建删除cre区域的突变体δcre作为对照。在相同的发酵时间内，直接删除cre区域的δcre突变体菌体几乎不生长，除c10a外，其他突变后的启动子菌浓和酶活均高于原始菌株。设计构建的cre区域突变体，大多对缓解ccr效应有正面效果，本发明具有良好的工业应用潜力。
附图说明
43.图1是启动子p
amye
的cre区域。
具体实施方式
44.1、lb培养基(g/l)：酵母粉5.0，胰蛋白胨10.0，nacl 10.0。
45.2、tb培养基(g
·
l-1
)：酵母粉24.0，甘油5.0，胰蛋白胨12.0，k2hpo4·
3h2o，kh2po42.31。
46.实施例1：cre突变体的构建
47.(1)构建重组质粒phy300plk-p
amye-dpe
48.合成了含有p
amye
启动子(seq id no.1)和d-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因dpe(seq id no.2)的基因片段，其中p
amye
启动子在基因dpe的上游并调控基因dpe的表达，将基因片段插入到穿梭载体phy300plk并在枯草芽孢杆菌中表达，获得重组质粒phy300plk-p
amye-dpe。
49.(2)构建突变质粒
50.设计定点突变的突变引物，以携带p
amye
启动子和编码d-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因dpe的重组质粒phy300plk-p
amye-dpe为模板，在cre区的不同位点引入突变。
51.以突变体g2c为例，构建方法如下：
52.1)单引物扩增pcr：以g2c的上游引物或下游引物分别单独进行pcr扩增反应，反应体系：12.5μl 2
×
super pfx mastermix、25ng模板和0.5μl g2c-f/0.5μl g2c-r，用水补齐至25μl。反应程序：98℃预变性3min 30s，然后进行3个循环(98℃，30s；55℃，30s；72℃，1min)，4℃保温；得到2份pcr产物。
53.2)反应结束后，将步骤1)获得的2份pcr产物混匀，依次在98℃预变性3min 30s；然后进行15个循环(98℃，30s；55℃，30s；72℃，1min/kb)；72℃复性5min后，在4℃保温；得到扩增产物。
54.3)取步骤2)获得的7.5μl扩增产物，加入1.5μldpn i和1μl cutsmart混匀，在37℃水浴处理9h，消化体系中的模板用于后续转化。转化产物转化入escherichia coli jm109感受态细胞，涂布至lb固体培养基(含30μg
·
ml-1
氨苄青霉素)上，37℃过夜培养。挑选阳性克隆，提取质粒，进行测序验证。
55.4)将步骤3)中测序正确的质粒，电转至b.subtilis感受态中进行表达，获得含有突变体g2c的重组枯草芽孢杆菌。
56.同样的，构建突变体δcre、g2c、g2a、g2t、g3c、g3t、g3a、c4g、c4t、c4a、g5c、g5a、g5t、t6a、t6g、t6c、c10g、c10a、c10t、t6aδ3、t6aδ6和t6aδ9。
57.表1引物序列
[0058][0059][0060]
实施例2：重组枯草芽孢杆菌的摇瓶发酵
[0061]
1)摇瓶发酵：将步骤1制备的重组枯草芽孢杆菌的单菌落或者甘油管以2
‰
接种率接入10ml lb(含30μg
·
ml-1
四环素)中，在37℃，200r
·
min-1
的条件下培养12h。获得的种子
液以5％的接种率接入tb(含30μg
·
ml-1
四环素)培养基中，37℃，200r
·
min-1
培养2h后，转至33℃，200r
·
min-1
发酵48h。
[0062]
2)粗酶液的制备：摇瓶发酵结束后，在4℃，8000g下离心15min，弃置上清，收集菌体。用一定体积20mm的hepes(ph 7.5，含0.1mm的co
2+
)缓冲液重悬菌体。4℃下高压匀浆1000bar破壁，将菌液循环破壁三次。4℃将破壁后获得的悬液在8000g离心20min，取上清即为粗酶液。
[0063]
实施例3：突变体酶活以及催化d-果糖的平衡转化率
[0064]
菌浓测定：用去离子水稀释菌液，混匀后均匀取样，将样品放置在1cm玻璃比色皿中，读取600nm波长下吸光值，确保吸光值在0.2-0.8的有效范围内。菌浓(od
600
)＝吸光值(0.2-0.8)
×
稀释倍数。
[0065]
酶活测定：在60℃，ph 7.5的条件下，以缓冲液配制的800μl的100g
·
l-1
的d-果糖为底物，添加200μl的用缓冲液稀释后的实施例2获得的粗酶液，混合均匀后精准反应10min，沸水浴10min终止反应。将样品在12000g离心5min，取上清，加去离子水稀释上清至合适的倍数，再用0.22μm的滤膜过滤处理，除去杂质，经高效液相色谱(hplc)检测d-阿洛酮糖和d-果糖的含量。
[0066]
d-果糖的平衡转化：在60℃，ph 7.5的条件下，以缓冲液配制的8ml的100g
·
l-1
的d-果糖为底物，添加2ml的用缓冲液稀释后的实施例2获得的粗酶液，混合均匀后反应4h，沸水浴10min终止反应。将样品在12000g离心5min，取上清，加去离子水稀释上清至合适的倍数，再用0.22μm的滤膜过滤处理，除去杂质，经高效液相色谱(hplc)检测d-阿洛酮糖和d-果糖的含量以及平衡转化率。
[0067]
缓冲液：20mm的hepes，ph 7.5，含0.1mm的co
2+
。
[0068]
hplc色谱条件如下：agilent 1200hplc色谱仪，shodextmasahipaknh2p-504e色谱柱，柱温设定在35℃，agilent示差检测器，agilent自动进样器，流动相75％乙腈(有机膜抽滤后超声处理5min)，流动相流速为0.8ml
·
min-1
。根据d-阿洛酮糖的吸收峰面积和标准品峰面积计算dpe的酶活以及催化d-果糖的平衡转化率。
[0069]
表2重组菌株在摇瓶中发酵48h后菌体量与ccdpe酶活情况
[0070][0071][0072]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。