一种缓控释抗菌米糠蛋白复合膜及其制备方法和应用

本发明涉及食品包装技术领域，具体涉及一种缓控释抗菌米糠蛋白复合膜及其制备方法和应用。

背景技术：

目前食品包装大多为不可降解的塑料制品，对生活环境有着巨大的挑战。随着国际禁塑令的推行，可降解的包装材料以及天然无毒的可食用包装材料逐渐成为食品包装领域的研究热点。很多研究者开始选用天然高分子材料作为成膜基材制成可食性薄膜来代替传统的塑料包装：一方面，以天然高分子材料为基材制备安全可食用、环保可降解的生物薄膜的研究逐渐兴起；另一方面，抗菌包装的推出，使食品质量更加可靠，将原本添加在食品中的抗菌剂转移到食品包装材料中，成为食品包装领域研究的主流方向。因此，研究开发具有缓控释特性的抗菌生物可降解材料，并应用于食品包装，实现实时、长效抗菌，可为新型食品抗菌包装提供一种新的思路。

蛋白基抗菌膜通常是在蛋白质中添加抗菌剂、交联剂和乳化剂等制备成具有阻隔、抗菌、可降解和包装功能的食品保鲜膜。但是蛋白膜特殊的基质组成和结构使其阻水性差，并且添加剂的控释作用较差，使得蛋白膜在食品包装领域的应用受限。研究表明蛋白质可以与多糖、脂质、淀粉等通过物理共混、化学交联及静电、疏水相互作用制备成复合膜，可有助于蛋白膜和机械性能和理化性质，如良好的柔韧性和抗拉伸强度、透气透湿性、缓释性等具有广阔的应用前景和深远的研究意义。羧甲基壳聚糖是在壳聚糖分子骨架上引入羧甲基(-ch2cooh)而得到的两亲性聚合物(具有-nh2及-cooh)产物，在水中溶解度极大，具有稳定的化学性质、良好的吸湿保湿性及成膜性，但羧甲基壳聚糖膜的机械性能较差，水溶性强也限制了其作为食品包装的应用，其可通过与米糠蛋白结合，形成稳定的结构进而提高复合膜的机械强度以及稳定性等性能。

其次，膜基质间的相互作用也会影响蛋白膜阻水性和抗菌性。蛋白膜中的抗菌剂、交联剂、乳化剂等会因分子间静电、疏水、水合和氢键等相互作用影响蛋白膜的阻水性和抗菌性。原因可能是这些物质与蛋白质之间的相容性差，导致成膜液中颗粒直径较大，影响了膜的界面黏合性和致密性。为进一步降低成膜液的颗粒直径，提高组分之间的相互作用，研究者们将基质成分制备为纳米粒子，再采用共混的方式延流成膜，可显著提高复合膜的阻水性。

关于缓控释技术，研究者提出纳米胶囊等控释技术可能会延缓抗菌剂如山梨酸钾的释放。纳米胶囊中的抗菌成分的与食品接触需要经过二次迁移，即从纳米胶囊内迁移到膜基质中，再从膜基质迁移到食品中，由此起到缓控释作用。研究发现菜籽蛋白纳米凝胶具有良好的吸水溶胀能力，且能够抵抗不同ph和离子强度，及冻干与稀释的能力。依据纳米抗菌凝胶具备吸水溶胀和抗菌剂控释的特性，通过将米糠蛋白制备成纳米凝胶后再与米糠蛋白共混，有望协同增强酰化米糠蛋白基膜的阻水性和抗菌性。

目前国内外对改性米糠蛋白并结合纳米凝胶制备抗菌膜的研究较少，并且在食品包装材料的应用也有待开发。将稻米加工中副产物米糠蛋白用于缓控释抗菌膜的研究，是米糠低值产品的高值化利用，既能减轻环境负担,缓解白色污染，又能合理利用自然资源，具有一定的研究意义和生态价值。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种缓控释抗菌米糠蛋白复合膜及其制备方法和应用。

为实现这一目的，本发明提供如下方案：

一种缓控释抗菌米糠蛋白复合膜，由以下原料制成：米糠酰化蛋白、羧甲基壳聚糖和助剂，所述的米糠酰化蛋白(acylatedricebranprotein,arbp)和羧甲基壳聚糖(carboxymethylchitosans，cmcs)的质量比2:1～8:1。

进一步地，所述助剂为增塑剂-甘油；分散剂-吐温20，纳米添加剂-米糠蛋白纳米凝胶(arbpng)；抗菌剂-姜黄素(cur)以及溶剂～水。

进一步地，复合膜两种原料即arbp与cmcs的质量比为1:1～4:1，即所述的米糠酰化蛋白和羧甲基壳聚糖的质量比1:1～4:1。

本发明还提供了一种缓控释抗菌米糠蛋白复合膜的制备方法，主要包括以下步骤：

(1)将米糠酰化蛋白加入蒸馏水中充分搅拌至完全溶解，制备成米糠酰化蛋白溶液；

(2)将羧甲基壳聚糖加入蒸馏水中充分搅拌至完全溶解，制备成羧甲基壳聚糖溶液；

(3)在磁力搅拌下将步骤(1)制备的米糠酰化蛋白溶液与步骤(2)制备的羧甲基壳聚糖溶液混合，调节ph至6～8，水浴加热20～40min后，冷却，将甘油、吐温20逐滴分散到溶液中，20～25℃下搅拌均匀，得到混合溶液；

(4)在磁力搅拌下将米糠蛋白纳米凝胶加入步骤(3)制备的混合溶液中并充分搅拌均匀，制备得复合成膜液；

(5)将步骤(4)制备的复合成膜液经真空脱气后倒在模具上，脱模后得到缓控释抗菌米糠蛋白复合膜。

步骤(1)中，米糠酰化蛋白的制备具体包括：

在米糠蛋白水溶液中，加入米糠蛋白质量10～15％的丁二酸酐(即琥珀酸酐)反应，得到改性米糠蛋白，低温0～10℃透析48h后冻干制备成米糠酰化蛋白。

所述的米糠酰化蛋白溶液中米糠酰化蛋白的质量浓度为1～5％，优选为3％。

步骤(2)中，所述的羧甲基壳聚糖溶液中羧甲基壳聚糖的质量浓度为1～5％，优选为3％。

步骤(3)中，所述的米糠酰化蛋白与羧甲基壳聚糖的质量比为1:1～4:1，水浴温度为60～80℃，甘油的添加量为米糠酰化蛋白与羧甲基壳聚糖总质量的20～25％，吐温20的添加量为米糠酰化蛋白)与羧甲基壳聚糖总质量的5～6％。

步骤(4)中，米糠蛋白纳米凝胶的制备具体包括：

将姜黄素溶解在去无水乙醇中，在磁力搅拌下将溶液滴加到米糠酰化蛋白水溶液，水浴(80～95℃)加热，20～40min，冷却至室温，离心除去悬浮液中的游离姜黄素，过滤收集滤液，冷冻干燥得到米糠蛋白纳米凝胶。

米糠蛋白纳米凝胶的添加量为步骤(3)中米糠酰化蛋白与羧甲基壳聚糖总质量3～10％。

步骤(5)中，真空脱气5～10min，倒模量为25g，制备复合膜方法为流延法。

所述的脱模操作为：将模具置于通风橱干燥12～36h后揭下，并置于相对湿度rh＝45～65％，15～35℃的干燥器中平衡36～60h。最优选的，将模具置于通风橱干燥24h后揭下，并置于相对湿度rh＝55％，25℃的干燥器中平衡48h。

所述制备的复合膜，抗菌剂姜黄素释放具有缓控释特性。

所述制备的复合膜，采用液体培养实验，通过比浊法对其抗菌活性进行评定。

所述制备的复合膜，依据不同温度下抗菌膜在三种食品模拟体系中抗菌剂的释放量，评价该复合膜缓控释性能。

与现有技术相比，本发明具有操作简单、制备方便的特点，本发明提供的可食性抗菌复合膜具有良好的抗菌性和机械性能，可完全降解且具有一定缓控释性能，实现抗菌的长效性和时效性，有效延长食品的货架期，原料来源广泛，具备优异的生物相容性、安全性、可降解性，本发明在食品包装中的应用为食品包装工业发展提供了一种新的思路，具有深远的发展前景。

本发明将米糠蛋白采用丁二酸酐琥珀酰化改性得到米糠酰化蛋白，以米糠酰化蛋白与羧甲基壳聚糖为主要膜基材原料，甘油作为增塑剂，吐温20为分散剂，同时添加的负载姜黄素的米糠纳米凝胶，通过以上膜基材原料按照特定的配比组合，各原料成分之间相互协同作用，可使复合膜具有优良的抗菌性和机械性能，且实现复合膜中抗菌剂的缓控释效果，本发明生产的复合膜质地均匀，性能稳定。由于膜基材为食源性原料，具有安全性高且环保低能耗等特点，是一种有效且具有广阔应用前景的新型食品包装膜，对食品包装领域的发展有深远的影响。

附图说明

图1为不同配比arbp/cmcs复合膜对大肠杆菌生长曲线的影响图；

图2为不同arbpng添加量的复合膜内cur在3％乙酸溶液中的释放规律图；

图3不同arbpng添加量的复合膜内cur在50％乙醇溶液中的释放规律图；

图4不同arbpng添加量的复合膜内cur在95％乙醇溶液中的释放规律图；

图55％ng-arbp/cmcs复合膜中cur在不同温度与ph下的释放规律图。

图6实施例1中制备的复合膜的扫描电子显微镜图，a为arbp/cmcs复合膜扫描电镜图；b为5％ng-arbp/cmcs复合膜的扫描电镜图。

具体实施方式

下面结合具体实例及附图，进一步阐述本发明，但本发明的实施方式不仅限于此。

以下实施例中如无特殊说明，所使用原料均来源于市售，所采用方法均为本领域技术人员公知的常规操作方法。

实施例1

本实施例用于说明一种缓控释抗菌米糠蛋白复合膜的制备方法。

一种缓控释抗菌米糠蛋白复合膜的制备方法，其中膜基材原料为羧甲基壳聚糖(购买于sigma公司)和米糠酰化蛋白，抗菌剂为姜黄素(购买于麦克林公司)，助剂甘油、吐温20购买于麦克林公司，米糠蛋白纳米凝胶为实验室制备，具体包括：

(a)米糠蛋白质的酰化改性：首先将米糠蛋白溶液(2％)加入磷酸缓冲液中，恒温搅拌同时滴加琥珀酸酐(15％)，滴加完毕后继续恒温(40℃)搅拌并用1.0m的naoh维持ph在8.0，反应时间30min，反应结束后透析(透析袋的截留分子量为3.5kd，4℃，24h)，并在-80℃的冰箱内冷冻12h，然后转移到-40℃的冷冻干燥机里冻干48h左右，得到呈灰色海绵状的酰化改性米糠蛋白，粉碎后得酰化改性米糠蛋白粉末。

(b)纳米抗菌凝胶的构建：采用自组装法制备纳米抗菌凝胶。将姜黄素溶解在去离子乙醇中，在磁力搅拌下将溶液滴加到10ml的酰化米糠蛋白溶液(ph6.8，1mg/ml)中配成浓度为30％(w/w)。将混合物在水浴环境下加热(90℃，30min)，然后快速冷却至室温25℃。离心除去纳米凝胶悬浮液中的游离姜黄素，使用0.1μm过滤器(millipore，usa)，收集滤液，冷冻干燥得到米糠蛋白纳米凝胶。

一种缓控释抗菌米糠蛋白复合膜的制备方法，包括以下步骤：

(1)将上述制备的3g米糠酰化蛋白粉末(即步骤(a)中的酰化改性米糠蛋白粉末)在500r/min的磁力搅拌下溶解在100ml蒸馏水中，制备浓度为3％的arbp溶液。

(2)将3g羧甲基壳聚糖粉末在500r/min的磁力搅拌下溶解在100ml蒸馏水中，制备浓度为3％的cmcs溶液。

(3)在500r/min磁力搅拌下，将上述制备的arbp溶液与cmcs溶液按照质量比1:1、2:1、3:1和4:1混合，arbp和cmcs的总质量为3g，调节ph至7，80℃水浴加热30min后快速冷却至室温25℃，再将600mg甘油与150mg吐温20按8ml/h速度缓慢加入到刚制备好的复合溶液中。

(4)将上述制备的含有抗菌剂姜黄素的米糠蛋白纳米凝胶(arbpng)(即步骤(b)得到的米糠蛋白纳米凝胶)按照(arbp和cmcs的总质量为3g)3％、5％和10％的质量分数分别加入到复合溶液中，室温25℃、500r/min搅拌8小时，制成不同的ng-arbp/cmcs复合成膜液。

(5)将步骤(4)获得的不同复合成膜液真空脱气5min，称取25g倒入模具中，在25℃通风橱下自然风干24h后揭膜，即制备获得含有不同比例arbpng的缓控释抗菌米糠蛋白复合膜。

实施例2

本实施例用于说明一种缓控释抗菌米糠蛋白复合膜的性能表征。

将实施例1中制得的缓控释抗菌米糠蛋白复合膜在温度25℃、湿度为55％环境下贮藏48h后进行各项性能测定(以纯米糠酰化蛋白膜作为对照)。

1.膜厚度的测定

利用螺旋测微仪对膜的厚度进行测量，分别测量其厚度，计算平均值即为膜厚度，按照一定的规律，在待测膜上随机取5个点，结果准确到0.001mm。

2.拉伸强度(ts)与断裂伸长率(eb)测定

采用拉力测试仪(labthinkc610m，山东)对缓控释抗菌米糠蛋白复合膜的机械性能进行分析。将待测膜制成15mm×150mm的矩形条，每次测试保证探头间距为60mm，测试速率为100mm/min，每个样品重复三次，取平均值。

3.水溶性测定(ws)

将复合膜截成1cm×4cm的长方形，于105℃下干燥至恒重记录质量m1，然后将其放置锥形瓶中，加入40ml的蒸馏水，室温下放置24h，于105℃条件下干燥24h，称重量记为m2。水溶性按下式计算：

溶解度(％)＝(m1-m2)/m2；

4.光学性能测定

复合膜的光学性能检测，采用色差仪对其色度进行测定，读数以cie1976色度空间值l*(暗→亮:0→100)，a*(绿－→红+)，b*(蓝－→黄+)表示。总色差以δe表示。其中ls、as和bs为标准白板的值，分别为94.22、-1.32和-0.59。

上述ts、eb与ws性能具体测试结果如表1所示，纯arbp膜ts值最小，不同arbp与cmcs的添加量可有效改善复合膜的ts和eb，随着arbp比例的增加其ts和eb均呈现出先增加后降低的趋势，当w(arbp):w(cmcs)为3:1时，其ts与eb均达到同组中的最大值，比纯arbp膜的ts(5.03mpa)提高了104.6％，其eb值比纯arbp膜的eb(43.33％)提高了31.8％，这可能是由于arbp分散均匀，成膜液均一稳定，从而增强复合膜的延展性与拉伸性能；另一方面arbp中的极性基团(-oh、-nh2)可以和cmcs分子中的极性基团(-oh、-nh2)形成分子间相互作用如氢键，使复合膜之间具有很强的作用力，导致拉伸强度增大，此时分子间连接紧密，韧性好，因此具有较强的eb。但当arbp的比例继续增大时，复合膜的ts与eb降低，这可能是由于arbp在高含量时容易在基体中出现团聚影响蛋白质分子网络结构，且与cmcs的相容性变差，导致膜的ts和eb性能降低。同时，arbp的比例也会影响复合膜的水溶性，其水溶性随着arbp的比例增加而逐渐降低且优于纯arbp膜的ws，其原因可能是由于cmcs与arbp结合形成分子间氢键、静电引力等进而影响其微观结构如形成高度稳定的网络结构，使其溶解度减小。

表1不同配比的arbp/cmcs复合膜的ts、eb及ws性能测试结果

包装材料的色彩感官影响着被包装物的消费接受程度，因此复合膜颜色的修饰具有很重要的作用。由表2可知，对比标准白板，arbp膜的颜色总色差δe为18.64，而当w(arbp):w(cmcs)为3:1时，复合膜的总色差降低为17.05，并且亮度l值两者相差较小，其他arbp与cmcs比例组成的复合膜色差均大于纯arbp膜，由此得出w(arbp):w(cmcs)为3:1的复合膜具有良好的光学性能，满足食品包装的要求。

表2不同配比的arbp/cmcs复合膜的光学性能测试结果

实施例3

本实施例用于说明缓控释抗菌米糠蛋白复合膜对大肠杆菌的抗菌活性。

采用实施例2中综合性能较好的复合膜，即w(arbp)：w(cmcs)为3:1，arbpng添加量为3％、5％和10％，进行本实施例的抗菌实验测试(其中以无arbpng的复合膜做对照)。

采用比浊法测试复合膜对大肠杆菌的抗菌活性。将复合膜膜样品按2×2cm²片切成薄片，放入含有20ml蛋白胨溶液(0.1％，w/v)、大肠杆菌浓度为10³cfu/ml的离心管中。离心管在ts-2102c振荡器中孵育；在37℃和150rpm下震荡24小时。每隔2h收集0.5ml的培养液，加入96孔板中，采用酶标仪在600nm下的吸光值，无膜培养基做空白，实验重复三次取平均值。

复合膜的抗菌结果如图1所示，与纯arbp膜相比，添加arbpng的复合膜具有较高的抑菌活性。且随着arbpng的添加量的增加，24h内复合膜吸光值增长缓慢，说明姜黄素(cur)首先经arbpng释放进入膜基材中，再由复合膜释放进入培养液，从而实现缓控释抗菌效果，并且添加10％arbpng的复合膜抗菌持续性要强于其他组复合膜，说明添加arbpng后可有效提高抗菌剂的释放时间，延长复合膜的抗菌周期，提高抗菌剂的抗菌性能。

实施例4

本实施例用于说明缓控释抗菌米糠蛋白复合膜在不同食品体系中的缓控释效果。

使用不同的食物模拟物来代表真实的食物表面条件进行释放测试。3个标准食品模拟的选择：3％醋酸溶液(代表酸性食物,如果汁、碳酸饮料和果酱)，50％的乙醇溶液(代表水包油乳液，如牛奶)和95％乙醇溶液(代表脂肪含量高的食物，如食用油和肉类)。将复合膜样品切成2×2cm²片，室温下浸泡于50ml食品模拟溶液中。分别于适当的间隔取出1ml溶液，测定姜黄素的释出量，同时在相应的溶液中加入1ml的新鲜食品模拟溶液。用紫外-可见分光光度计(uv-2600，日本岛津)在425nm波长下测定姜黄素释放值。所有的测量重复三次。

复合膜在四种不同模拟食品体系中的释放曲线如图2-4所示，cur在95％乙醇溶液中释放速率最低，三种复合膜中cur释放率均低于45％，在3％乙酸溶液中释放速率最快且在8h时释放率均超过50％，这可能是由于cmcs在乙酸溶液中易分解，并且arbpng具有ph响应，在酸性条件下易分解，导致cur的释放速度加快，在95％乙醇溶液中arbp与arbpng较稳定几乎不发生溶胀行为，cur在膜质中不容易被释放，因此具有较低的释放速率。此外，复合膜与50％乙醇溶液亲和性较高，复合膜会发生溶胀和渗透行为，膜质间网络结构破坏程度较大，导致cur前期释放速率较快。

实施例5

本实施例用于说明缓控释抗菌米糠蛋白复合膜在不同温度和ph下抗菌剂的缓控释效果。

将含有5％arbpng的复合膜(5％ng-arbp/cmcs)切成2×2cm²片，将裁好的膜片分别置于50mlph为3.5、5.0、7.4的食品体系模拟液(磷酸缓冲液)中，置于4℃、25℃、40℃不同温度环境下，分别于0.5h的间隔取出1ml溶液，测定姜黄素的释出量，同时在相应的溶液中加入1ml的新鲜食品体系模拟液。用紫外-可见分光光度计(uv-2600，日本岛津)在425nm波长下测定姜黄素释放值。所有的测量重复三次。

食品模拟体系温度和ph值是影响cur向食品中迁移扩散释放的重要因素。在不同温度4℃、25℃、40℃、不同ph3.5、5.0、7.4的食品模拟体系中cur的释放曲线(见图5)。由图5可知，复合膜中cur初期释放速率随食品模拟体系温度增加而增加，当温度恒定时，cur在ph3.5，5.0，7.4的模拟液中其释放率随ph降低而升高。ph值明显影响了其扩散过程，这与复合膜以及arbpng的溶胀有关，在ph3.5时，薄膜的溶胀性高，薄膜内部蛋白质空间结构变得疏松，扩散加快，活化能越低，膜易分解，导致了cur具有高的释放率。同时在相同ph下，温度对cur的释放影响显著，40℃时，复合膜具有最快的释放速率，而在4℃时，cur的释放速率明显降低，且复合膜对温度的敏感度要高于ph。

总体来讲，在不同食品体系中，复合膜内cur呈现出不同的释放速率，并且arbpng的添加可有效延缓复合膜中cur的释放，达到缓控释的目的,进一步探究了温度与ph对cur释放速率的影响，因此在包装不同食品时，可根据不同食品的ph以及储藏温度来选择复合膜的使用，实现延长食品货架期，有效抗菌的效果。

本发明的实施方式不限于此，按照本发明的上述内容，利用本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，本发明还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更，均落在本发明权利保护范围之内。