技术特征：
1.体外高效扩增nk和转染nkg2d活化nk细胞的方法，其特征在于：包括具体方法为：s1：nk细胞体外高效扩增技术优化及nk免疫生物学特性检测；流式细胞仪检测cd3
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cd16+cd56+nk细胞亚群含量以及nk细胞上cd62l、激活性受体nkg2d、自然细胞毒受体nkp30、nkp44、nkp46、颗粒酶b、穿孔素的表达情况；s2：应用rt
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pcr方法检测肿瘤细胞及肿瘤组织中nkg2d配体mica，ulbp 1,2,3的mrna表达；s3：nkg2d克隆载体的构建；从nk细胞中经rt
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pcr技术获得nkg2d cdna，与pgem
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teasy连接及转化大肠杆菌后，构建nkg2d克隆载体，进行dna序列测定；s4：nkg2d真核表达载体的构建；应用限制性内切酶将nkg2d基因从克隆载体上切下来，连接到荧光真核表达载体pegfp
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n1上，构建pegfp
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n1/nkg2d真核表达载体；s5：真核表达载体在cho细胞中的表达及鉴定；将筛选出的pegfp
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n1/nkg2d质粒通过脂质体转染到cho细胞中，经g418筛选，克隆，rt
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pcr鉴定nkg2d mrna的表达，荧光显微镜、western blot和免疫组化方法鉴定nkg2d蛋白的表达；s6：真核表达载体转染nk细胞及对nk细胞生物学功能影响。2.根据权利要求1所述的体外高效扩增nk和转染nkg2d活化nk细胞的方法，其特征在于：所述nk细胞体外高效扩增方案标准操作流程：s1：包被：t 175培养瓶中8mldpbs加入组合细胞因子，置于37℃培养箱中，包被2小时；s2：第一天：细胞制备；a：抽取抗凝外周血50ml，800g，15min室温离心；b：自体血浆制备：取上清血浆，置于水浴锅中56℃，30min；然后
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20℃静置10min；最后4℃，1100g，离心15min，4℃保存备用；c：取上述离心后下部细胞成分，加d
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pbs至50ml，混匀，加到2个装有20ml医疗级淋巴细胞分离液的50ml离心管中，800g，15min室温离心；d：取细胞层，加入培养基至50ml，600g 10min，弃上清液；e：分离出的pbmc加入40ml组合细胞因子，制成细胞悬液，加入到弃掉包被液的培养瓶中，加入2ml血浆，置于饱和湿度、37℃、5.0％co2培养箱中培养；f：nk培养液配置方法：活化培养基为500ml增殖培养基中加入组合细胞因子，增殖培养基为每1000mlnk
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ex培养基加入组合细胞因子，先使用完活化培养基，再使用增殖培养基；s3：第四天：加入40mlnk活化培养基重悬，种入原培养瓶，加入4ml血浆，加入本试剂盒组合细胞因子；s4：第六天：补加70mlnk活化培养基，加入4ml血浆，加入组合细胞因子；s5：第八天：将培养瓶中细胞完全吹打下来，加入剩下血浆，转移到1个培养袋，建议补至400ml；s6：第十天：视细胞生长状态，每个培养袋补加nk培养液400ml；s7：第十一天：视细胞生长状态，每个培养袋补加nk培养液700ml；送检第三方做细菌、真菌、支原体、内毒素检测同时做好自检；s8：第十五天：收集nk细胞悬液1500ml，1500rpm
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8min离心后弃去上清液，250ml离心管集2管每管生理盐水200ml洗涤1500rpm
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8min1次，再用50ml离心管生理盐水100ml洗涤1200rpm
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8min 1次，按照200ml生理盐水+8ml 20％血清白蛋白重悬细胞，封装好后送病
房，同时留样封存以备日后检测。3.根据权利要求1所述的体外高效扩增nk和转染nkg2d活化nk细胞的方法，其特征在于：所述nk免疫生物学特性检测包括nk细胞检测前处理、nk细胞表面受体的检测、颗粒酶b和穿孔素的检测。4.根据权利要求3所述的体外高效扩增nk和转染nkg2d活化nk细胞的方法，其特征在于：所述nk细胞检测前处理先收集培养nk细胞，在流试管中加入3％乙酸溶液0.38ml，即取冰乙酸3ml，加蒸馏水至100ml混合，然后所需检测的细胞0.02ml，立即吹入稀释液中，并将吸管壁的血洗入稀释液内，轻轻摇匀；用小滴管自上述摇匀的稀释液中吸取少量液体加入血细胞计数池内，静置1～2分钟，在显微镜下用低倍镜计数4个大方格的白细胞总数；进行细胞计数后，将细胞浓度调整为5
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106/ml。5.根据权利要求3所述的体外高效扩增nk和转染nkg2d活化nk细胞的方法，其特征在于：所述nk细胞表面受体的检测标记抗体的方法为：各取50ul培养的细胞加入每只流式检测管中，每组共9管，在避光条件下按照以下的顺序标记抗体，加入每种抗体10ul，标记抗体后，将每个流式检测管充分振荡后混匀，置于4℃避光环境中30分钟，使抗体与细胞发生充分的反应；将充分孵育后的标本加入pbs缓冲液2ml，振荡混匀后，1000rpm 20℃离心10分钟，弃上清，再加入pbs缓冲液2ml，1000rpm 20℃离心10分钟，弃上清，用300μl的pbs缓冲液重悬细胞，加入100μl 3％中性甲醛固定液后进行流式细胞仪检测。6.根据权利要求3所述的体外高效扩增nk和转染nkg2d活化nk细胞的方法，其特征在于：所述颗粒酶b和穿孔素的检测取50ul培养的细胞加入1支流式检测管中，在避光条件下分别标记cd56抗体，加入每种抗体10ul；标记抗体后，将各流式检测管充分振荡混匀，置于4℃避光环境中30分钟，使抗体与细胞发生充分的反应；加入pbs于试管中混匀，4℃1000rpm 20℃离心10分钟，弃上清，重悬细胞；加入100ul破膜剂1，室温下避光反应15min；加入破膜剂2，室温下反应5min，用pbs洗涤1次，1000rpm 20℃离心10分钟，去上清；每一管加入加入10ul穿孔素抗体及颗粒酶b抗体，置于4℃避光环境中30分钟，1000rpm 20℃离心10分钟，去上清；荧光显微镜下确认抗体标记；将孵育后的标本加入pbs缓冲液2ml，振荡混匀后，1000rpm 20℃离心10分钟，弃上清，再加入pbs缓冲液2ml，1000rpm 20℃离心10分钟，弃上清，用300μl的pbs缓冲液重悬细胞，加入100μl 3％中性甲醛固定液后进行流式细胞仪检测。7.根据权利要求1所述的体外高效扩增nk和转染nkg2d活化nk细胞的方法，其特征在于：所述真核表达载体转染nk细胞及对nk细胞生物学功能影响包括：s1：将pegfp
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n1/nkg2d质粒通过脂质体转染到nk细胞中，免疫组化方法检测nkg2d蛋白在nkg2d转染前后的变化；s2：mtt方法检测nk细胞转染前后的增殖情况及对肿瘤细胞的杀伤情况；s3：rt
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pcr技术检测杀伤相关分子，即抗病毒分子ifn
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γ、细胞增殖分子il
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2、溶膜分子perforin和诱导细胞凋亡分子家族tnf超家族tnf
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a、fas/fasl、trail、tweak的转录水平，并同时设置β
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actin为rt
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pcr系统的内参照。
技术总结
本发明属于生物医药领域，细胞治疗技术范畴，具体是体外高效扩增NK和转染NKG2D活化NK细胞的方法。包括具体方法为：NK细胞体外高效扩增技术优化及NK免疫生物学特性检测；应用RT
技术研发人员：徐健 李陶 张扬
受保护的技术使用者：浙江圣希澳医学科技有限公司
技术研发日：2021.05.24
技术公布日：2021/9/3