一种TCR富集克隆型及其获取方法与应用与流程

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种tcr富集克隆型及其获取方法与应用。

背景技术：

新型冠状病毒(2019-novelcoronavirus，2019-ncov)感染暴发流行对全球公众健康构成了严重威胁。由2019-ncov引起的疾病被世界卫生组织(worldhealthorganization，who)正式命名为covid-19(coronavirusdisease2019)。covid-19在临床上表现为肺炎、发烧、咳嗽、肌肉疼痛、疲劳、腹泻、严重时导致死亡。who报告显示，2019-ncov已造成世界大流行。接种疫苗是有效预防病毒感染流行的手段，但是目前尚无新型冠状病毒疫苗(以下简称新冠疫苗)。针对公共快速传播的covid-19病毒，目前治疗手段仍以支持护理为主，针对covid-19的抗病毒药物、抗体、疫苗等仍在临床实验阶段，均未研发成功。大都采用与当年sars相同的方法对症治疗，用激素压制免疫系统引发的炎症反应，但这同时也会让人体会非常脆弱，难免受到损伤。迫切需要有效的疫苗开发遏制病毒在全球爆发。

t细胞(抗原)受体(tcellreceptor,tcr)为所有t细胞表面的特征性标志，以非共价键与cd3结合，形成tcr-cd3复合物。tcr的作用是识别抗原。tcr是由两条不同肽链构成的异二聚体，由α、β两条肽链组成，每条肽链又可分为可变区(v区)、恒定区(c区)、跨膜区和胞质区等几部分；其特点是胞质区很短。tcr分子属于免疫球蛋白超家族，其抗原特异性存在于v区；v区(vα、vβ)又各有三个高变区cdr1、cdr2、cdr3，其中以cdr3变异最大，直接决定了tcr的抗原结合特异性。在tcr识别mhc-抗原肽复合体时，cdr1，cdr2识别和结合mhc分子抗原结合槽的侧壁，而cdr3直接与抗原肽相结合。

技术实现要素：

为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供了一种tcr富集克隆型及其获取方法与应用。

为了实现上述目的，本发明公开了tcr富集克隆型，所述tcr富集克隆型的氨基酸序列为：caanrgsgystltf_csargergeklff。

本发明还公开了上述tcr富集克隆型的获取方法，包括以下步骤：

s1、采集治愈后病毒性感染患者的外周血单个核细胞样本；

s2、对所采集的样本进行tcr/bcrv(d)j免疫组库测序分析，找到共有的cdr3可变区；

s3、对治愈后病毒性感染患者富集程度高的细胞克隆型分布进行检测，从而可获得tcr富集克隆型。

其中，所述tcr富集克隆型在效应cd4+t记忆细胞的细胞簇中富集。

本发明还公开了所述的tcr富集克隆型在指导疫苗开发中的应用。

其中，所述疫苗为2019-ncov疫苗。

有益技术效果：本发明中的tcr富集克隆型的氨基酸序列为caanrgsgystltf_csargergeklff，所述tcr富集克隆型通过共有cdr3可变区对特异性识别的抗原表位具有积极意义，从而能够用于指导疫苗开发，为疫苗开发研究提供方向和理论依据。

附图说明

图1是本发明中一种tcr富集克隆型获取方法的流程图；

图2是本发明中tcr富集克隆型所处位置及其在tcr细胞中富集程度的示意图；

图3为免疫细胞亚群鉴定中所选用的分子标志物以及最终鉴定的免疫细胞亚群结果；

图4为在所有新冠康复患者中特异性出现的效应cd4+t记忆细胞亚群的比较结果图；

图5为新冠康复患者1不同cdr3序列的tcr克隆型细胞占比统计结果；

图6为新冠康复患者2不同cdr3序列的tcr克隆型细胞占比统计结果。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明作进一步的详细说明。

本发明提供了一种tcr富集克隆型，所述tcr富集克隆型的氨基酸序列为：caanrgsgystltf_csargergeklff。

其中，所述tcr富集克隆型富集在效应性cd4+t记忆细胞的细胞簇中。

如图1所示，本发明还提供了上述tcr富集克隆型的获取方法，包括以下步骤：

s1、采集治愈后病毒性感染患者的外周血单个核细胞样本；

s2、对所采集的样本进行tcr/bcrv(d)j免疫组库测序分析，找到共有的cdr3可变区；

s3、对治愈后病毒性感染患者富集程度高的细胞克隆型分布进行检测，从而可获得所述tcr富集克隆型。

所述tcr富集克隆型获取方法具体包括：

1、外周血单个核细胞的采样和tcr测序

分别抽取正常对照人和新冠康复患者2ml外周血，分离外周血单个核细胞(pbmcs)制成单细胞悬液，其中单细胞悬液浓度约为1000个/μl，根据单细胞悬液浓度取约20000～25000个细胞加入chromium单细胞建库芯片。将单个细胞裂解，并经过逆转录，芯片内形成的单细胞液滴破碎并纯化，在通用型引物的作用下进行pcr扩增，进而将得到的cdna产物用于构建基因表达和tcr测序的文库，然后在illuminanovaseq6000平台上对cdna文库进行tcr测序。

2、单细胞聚类分析

将单细胞rna测序的原始数据与人类参考基因组hg38进行比对，并使用cellranger3.0.1pipeline(10×genomics公司产品)进行量化以生成表达矩阵，同时，利用seurat软件包(版本号3.1.2)对细胞进行综合聚类分析，根据表达矩阵对细胞计数数据进行归一化处理，并用normalizedata函数进行对数变换，利用“findvariablegenes”函数，获得2000个高度可变的基因进行主成分分析(pca)，选取30个pbmcs进行umap(降维可视化)分析，然后将seurat中的findclusters函数的聚类参数分辨率设置为0.3以识别细胞亚群。在这些细胞亚群中，利用seurat软件包中的findmarkers和findalmarkers函数，应用单细胞差异基因表达分析mast方法鉴定差异表达基因(degs)。显著性degs通过平均表达的对数倍变化(avg.logfc)和校正的p值(p.val.adj.)来鉴定，用于定位鉴定富集型cdr3序列来源于免疫细胞亚群的种类。

3、tcr鉴定

基于tcrv(d)j测序，利用10×genomics公司开发的loupev(d)j浏览器(v3.0.0)对克隆型进行鉴定和计算。通过鉴定和计算所有不同组合tra和trb的cdr3序列形成的克隆型的丰度，以不同cdr3序列克隆型细胞在总细胞数中的占比超过3％为阈值，筛选和鉴定富集型的tcr克隆，并得到对应的富集型cdr3序列。同时，由于每个细胞上都具有唯一的识别标签，通过该标签，可以区分不同cdr3序列的细胞来源于不同的免疫细胞亚群。

鉴定过程及结果

获得的单细胞测序数据通过聚类分析后，最终分离得到20个不同的细胞亚群，对这些细胞亚群进行归类鉴定以及进一步的tcr克隆型鉴定，具体如下：

a、免疫细胞亚群的鉴定结果

通过不同免疫细胞亚群的细胞表面标志物cellmarker基因的表达来鉴定外周血单个核细胞中的不同免疫细胞亚群。图3示出了所选用的cellmarker以及最终鉴定的免疫细胞亚群结果，由图3可知，效应cd4+t记忆细胞亚群的阳性分子标志物包括：cd3d+prprc+cd4+il7r+klrb1+nkg7+gnly+，效应性cd8+t细胞的阳性分子标志物包括cd3d+prprc+cd8a+sell+il7r+klrb1+nkg7+gzmk+cd27+klrd1+。这表明本发明成功筛选得到效应cd4+t记忆细胞亚群和效应性cd8+t细胞。

其中效应cd4+t记忆细胞亚群为在所有新冠康复患者中特异性出现的细胞亚群，其在健康对照人外周血中数量极低(见图4)。由于效应cd4+t记忆细胞主要是对细胞因子驱动的细胞毒性免疫应答产生反应，以抵抗再次发生的感染，因此，与正常人(健康对照人)相比，效应cd4+t记忆细胞亚群的出现和急剧增加表明新冠患者对新冠病毒的再次感染具备了特异性的免疫细胞亚群。

b、特异性tcr克隆型cdr3序列的鉴定

tcr为t细胞表面的抗原受体，用于t细胞特异性的识别抗原，是t细胞识别抗原产生免疫应答的第一个关键分子。tcr由其中的v-(d)-j-c基因重排形成不同组合，从而形成不同的克隆型，其中tcr高变区，vβ基因上的互补决定区3(cdr3，由v、d、j三个区组成)是最主要的t细胞特异性识别抗原和免疫应答特征，因此，若检测到某一个tcrvβ家族cdr3区的克隆化改变，就标志着t细胞对某一抗原发生了特异性应答。成熟的t细胞在外周血中组成多样性的t细胞库，同时也形成一个多样性的t细胞cdr3受体库。

对于是否形成具有相同cdr3序列的克隆化细胞亚群，根据单细胞tcr测序结果的序列比对，统计具有相同cdr3序列的细胞在总细胞中所占的比例，以占比超过3％为阈值判断形成了克隆化。最终在2名新冠患者(新冠康复患者1和新冠康复患者2)中鉴定出6对富集型的cdr3序列细胞克隆(见图5和图6中前三组结果，图中柱高表示每对富集型的cdr3序列的细胞占比，其中氨基酸序列的序列表将表1)。通过cdr3序列所在细胞标签，其中caanrgsgystltf_csargergeklff序列、cavggnekltf_cassqgtgrssplhf序列来源于新冠康复患者特异性出现的效应cd4+t记忆细胞亚群，caanrgsgystltf_csargergeklff序列的细胞占比达到6.59％(见图5中序号①的柱形结果)，cavggnekltf_cassqgtgrssplhf序列的细胞占比分别达到6.86和5.58％(分别对应图6中序号④和⑤的柱形结果，合计12.44％)；casssggsyiptf_casslagghetqyf序列、cavnsyntdklif_catsreedntyeqyf序列以及caasavggaqklvf_catsrgtlygytf序列来源于效应性cd8t细胞中，占比分别为6.12％、3.48％和4.11％(分别对应图5中序号②和序号③以及图6中序号⑥的柱形结果)。

图2示出了本发明中tcr富集克隆型所处位置及其在tcr细胞中富集程度。由图2可知，本发明中的tcr克隆型的cdr3序列在总体细胞中的占比达到6.59％，由于每个细胞上都具有唯一的识别标签，通过该标签，最终确定富集本发明中的cdr3序列的细胞来源于治愈后病毒性感染患者特异性存在的效应cd4⁺t记忆细胞的细胞簇。

由于效应cd4+t记忆细胞通过tcr特异性识别外源性靶细胞或分子被抗原递呈细胞加工并通过表面mhc-ii分子呈递的抗原多肽，快速触发效应cd4+t记忆细胞杀伤外源性靶细胞的免疫功能。鉴于本发明中鉴定的tcr序列为在治愈的新冠病毒感染患者中所鉴定发现的共有的cdr3克隆型，且该克隆型特异出现在康复患者较正常人所特有的效应性效应cd4+t记忆细胞内，因此推断其对识别新冠病毒抗原或新冠病毒感染的细胞等具有特异性。

而且，本发明通过蛋白质相互作用预测结果表明所述tcr富集克隆型通过共有的cdr3可变区对特异性的识别新冠病毒的抗原表位具有积极作用，因此，该tcr富集克隆型能够用于指导疫苗开发，并为疫苗开发研究提供方向和理论依据，特别是应用于指导2019-ncov疫苗开发。

表1氨基酸序列的序列表

以上对本发明所提供的一种tcr富集克隆型及其获取方法与应用进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。