一种可用于带状疱疹后遗神经痛诊断的血液tsRNA标志物、制备及应用的制作方法

本发明涉及带状疱疹的生物诊断
技术领域：
，具体涉及一种可用于带状疱疹后遗神经痛诊断的血液tsrna标志物、制备及应用。
背景技术：
：众所周知，水痘-带状疱疹病毒(varicella-zostervirus,vzv)是引起带状疱疹(herpeszoster)的直接原因。在初次感染后，水痘-带状疱疹病毒就会寄宿在脊神经背根神经节或者脑神经。当人体免疫力下降时，它又会被再次激活，沿着神经不断迁移至周围神经纤维，最终在皮肤上表现出疱疹，并伴随着疼痛，更严重者则会发展为带状疱疹后遗神经痛，严重影响患者的生活质量，并增加医疗负担。早诊断早治疗是避免产生严重危害性和并发症的有效措施，因此，在带状疱疹后遗神经痛的早期阶段进行确诊并针对性干预治疗变得极为重要。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种可用于带状疱疹后遗神经痛诊断的血液tsrna标志物，与带状疱疹后遗神经痛表现出显著的相关性，可用于检测带状疱疹后遗神经痛。本发明提供如下的技术方案：一种可用于带状疱疹后遗神经痛诊断的血液tsrna标志物，所述tsrna血液标志物为trf-pro-agg-019，其序列如seqidno.1所示；seqidno.1：tcgaatcccagcggtgcctcca。本发明提供的血液tsrna标志物在带状疱疹后遗神经痛患者血浆中的表达显著性的低于带状疱疹但未发展成后遗神经痛的患者。上述血液tsrna标志物作为检测靶标在制备带状疱疹后遗神经痛诊断试剂中的应用。一种检测上述血液tsrna标志物的检测试剂，所述检测试剂为检测如权利要求1所述的血液tsrna标志物的特异性引物、探针或芯片。作为本发明的优选，所述特异性引物的上游引物序列如seqidno.2所示，下游引物序列如seqidno.3所示：seqidno.2：f：5’cgacgatctcgaatcccagc3’；seqidno.3：r：5’ctcttccgatcttggaggcac3’。上述检测试剂在制备带状疱疹后遗神经痛诊断试剂中的应用。一种带状疱疹后遗神经痛的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒含有上述检测试剂。作为本发明的优选，所述诊断试剂盒用于检测血液tsrna标志物的表达量。本发明的有益效果如下：本发明的血液tsrna标志物trf-pro-agg-019在带状疱疹后遗神经痛患者血浆中的表达显著性的低于带状疱疹但未发展成后遗神经痛的患者，与带状疱疹后遗神经痛表现出显著的相关性，可作为诊断带状疱疹后遗神经痛的标志物，将其应用于带状疱疹后遗神经痛诊断试剂以及诊断试剂盒的制备，用于带状疱疹后遗神经痛检测，检测成本低，检测效率高。附图说明图1是trf-pro-agg-019在a组和b组中的差异性表达。图2是trf-pro-agg-019的标准曲线。图3是trf-pro-agg-019的扩增曲线。图4是trf-pro-agg-019的熔解曲线。图5是管家基因u6的标准曲线。图6是管家基因u6的扩增曲线。图7是管家基因u6的熔解曲线。图1中，***p<0.001。具体实施方式下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。本发明的可用于诊断带状疱疹后遗神经痛的血液tsrna标志物为trf-pro-agg-019，其序列如下：seqidno.1：tcgaatcccagcggtgcctcca。1.病例筛选1.1带状疱疹后遗神经痛(phn)患者定义为发生带状疱疹且持续疼痛时间至少大于1个月的患者。带状疱疹患者定义为皮肤出现典型疱疹，沿神经分布，伴有烧灼感或神经痛。所有受试者均签署知情同意书。1.2选择2018年12月至2019年12月在嘉兴市第一医院疼痛科就诊住院的带状疱疹患者共50例分为两组，分别是a组和b组：a组为发生带状疱疹但后期未发展为带状疱疹后遗神经痛的患者，血浆25份；b组为发生带状疱疹但后期发展为带状疱疹后遗神经痛的患者，血浆25份；其中各组5份用于ngs分析，其余各组20份用于qrt-pcr分析验证。1)患者纳入如下标准(需同时满足)：(1)发疹前有轻度乏力、低热、食欲不振等全身症状，自觉灼热感或神经痛，触之有明显的痛觉敏感，也可无前驱症状即发疹；(2)病变皮肤出现簇集成群水疱，沿一侧周围神经呈带状分布；(3)可有明显的神经痛，可为钝痛、抽搐痛或跳痛，常伴有烧灼感，多为阵发性，也可为持续性伴局部淋巴结肿大；(4)经带状疱疹相关针对性治疗有效；(5)美国麻醉医师学会(asa)分级ⅰ、ⅱ级；(6)签署知情同意书者，并接受后续电话随访。2)排除标准(符合任一条件即可)：(1)发热等其他全身或局部感染者；(2)交感系统疾病者；(3)经药物或其他物理治疗者；(4)精神类疾病者；(5)误诊者(如心绞痛、肋间神经痛、胆结石、胆囊炎、阑尾炎等)；(6)其他疾病者(如接触性皮炎、丹毒、虫咬皮炎、脓疱疮、大疱性类天疱疮等)；(7)经后续治疗排除带状疱疹诊断者。2.rna抽提及质量检测2.1样品的rna抽提1)所用试剂如下：trizollsreagent(invitrogenlifetechnologies)；氯仿上海化学试剂有限公司；异丙醇上海化学试剂有限公司；100％乙醇(上海化学试剂有限公司)；75％乙醇(以depc处理的水配置)；冰醋酸(国药集团化学试剂有限公司)；无rna酶的水；无rna酶的糖原(invitrogenlifetechnologies)。2)匀浆从-70℃冰箱中取出血浆样品，解冻后于4℃12,000×g离心10分钟，去除可能存在的杂质，取250ul血浆液体，转至1.5ml的离心管中，750μl的trizollsreagent试剂，手动剧烈振荡管体至混匀。3)两相分离匀浆后样品于15到30℃孵育5分钟，以便核酸蛋白复合体完全解离。每750μl的trizollsreagent试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12,000×g离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相。rna全部被分配于水相中。水相的体积大约使匀浆时加入的trizollsreagent的60％。4)rna沉淀将水相转移到新离心管中，并加入500μl异丙醇，混匀以沉淀其中的rna。混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃12,000×g离心10分钟。此时离心前不可见的rna沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。5)rna清洗移去上清液，750μl的trizollsreagent试剂匀浆的样品中加入至少1ml的75％乙醇，清洗rna沉淀。振荡后，4℃7,500×g离心5分钟。6)重新溶解rna沉淀去除乙醇溶液，空气中干燥rna沉淀5-10分钟，切勿真空离心干燥。注意rna沉淀不要完全干燥，否则将大大降低rna的可溶性。部分溶解的rna样品a260/280比值将小于1.6。溶解rna时，先加入无rna酶的水用枪反复吹打几次，然后55到60℃孵育10分钟。获得的rna溶液保存于-70℃。2.2rna质量检测1)所用试剂如下te：10mm，tris-hclph8，1mmedta(tris-hcl，edta华美生物工程公司)；0.2mmops，ph7.0(mops华美生物工程公司)；0.02m乙酸钠(乙酸钠上海化学试剂有限公司)；0.01medta(edta华美生物工程公司)；甲醛上海化学试剂有限公司；甲醛上样染液(ambion)；goldview染料上海赛百胜基因技术有限公司；琼脂糖生工生物工程有限公司。2)紫外吸收测定法使用nd-1000测定rna浓度和纯度，测量前先用溶解rna用的depc水调零，操作方法如下：(1)滴加1uldepc水或者rna样品至测量基座的表面；(2)液滴会自动在上下基座之间形成液柱并自动完成测定，rna浓度及质量的各种参数将在电脑中自动生成文件；(3)一次测定完成后，用柔软的擦镜纸擦去上下基座表面上的样本液，便可进行下一个样品的测量；(4)测定结果(电脑自动生成的excel和jpeg文件附于实验报告文件夹中)：i、浓度测定260nm处读值为1表示40ngrna/ul。样品rna浓度计算公式为：a260x40ng/ul；具体计算如下：rna溶于20μldepc水中，取1ul用于测定，测得a260＝65.003：rna浓度＝65.003x40ng/ul＝2600.12ng/ul；取1ul测量以后，剩余样品rna为19μl，剩余rna总量为：19μlx2600.12ng/ul＝49.4μg；ii、纯度检测rna溶液的a260/a280的比值是一种rna纯度检测方法，比值范围1.8到2.1。即使比值超出这个范围，rna样品也一样可以用于一些普通实验中如northern杂交，rt-pcr和rna酶保护实验。3)变性琼脂糖凝胶电泳(1)制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，加入10ml的10×mops电泳缓冲液和18ml的37％甲醛溶液(12.3m)，10×mops电泳缓冲液如下表1所示：表1.10×mops电泳缓冲液灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×mops电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米；(2)准备rna样品取1μgrna，加1倍体积的甲醛上样染液，加eb于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育5分钟使样品变性；(3)电泳上样于胶孔中，5-6v/cm电压下电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm；(4)紫外透射光下观察并拍照28s和18s核糖体rna的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提rna的物种类型)，上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的rna(trna和5s核糖体rna)组成。在18s和28s核糖体带之间一般可以看到一片弥散的eb染色物质，可能是由mrna和其它异型rna组成。rna制备过程中如果出现dna污染，将会在28s核糖体rna带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带。rna的降解表现为核糖体rna带的弥散。3.rna前处理与cdna合成3.1试剂rtstartmtrf&tirnapretreatmentkit(cat#as-fs-005,arraystar)；rtstartmfirst-strandcdnasynthesiskit(3’and5’adaptor)(cat#as-fs-003,arraystar)。3.23’末端去乙酰化处理a)按照下表2配置去乙酰化反应液：表2.去乙酰化反应液inputrna≤5μgdeacylationreaction缓冲液(5×)3ulrnase抑制剂1μl无核酸酶水xμl总体积/样本15μlb)涡旋混合，37℃孵育40分钟；c)依次加入19μldeacylationstopbuffer，涡旋混合，室温孵育5分钟，终止去乙酰化反应。3.3去除3’-cp与添加5’-pd)将上一步骤的反应液置于冰上，依次加入下表3中的试剂：表3.待加入试剂terminalenzymereaction缓冲液(10×)5μl10mmatp5μlterminalenzymemix3u(1μl)无核酸酶水5μl总体积/样本50μle)涡旋混合，37℃孵育40分钟；f)70℃孵育5分钟以终止反应；g)重新抽提rna。3.4去甲基化处理h)融解除demethylase和reversetranscriptase外的所有试剂，涡旋混合，置于冰上。在使用前从冰箱将两种酶取出，简单离心，以待使用；i)按照下表4配置去甲基化反应液：表4.去甲基化反应液无核酸酶水xμldemethylationreaction缓冲液(5×)10μl脱甲基酶5μlrnase抑制剂1μlinputrna≤5μg总体积/样本50μlj)进行去甲基化反应：在37℃水浴锅中孵育2小时，然后加入40μlnuclease-freewater与10μldemethylationstopbuffer(5×1)，终止去甲基化反应；k)重新抽提rna。3.5连接3′接头1)在200μl无rna酶的pcr管中依次加入下列表5的试剂：表5.待加入试剂无核酸酶水variable样本rna0.5-3μl3’adaptor0.5μlrnaspike-in0.5μl总体积3.5μlm)在热循环仪中70℃孵育2分钟，然后将pcr管移至冰上；n)添加下列表6的反应试剂：表6.待加入反应试剂3’ligationreactionbuffer(2x)5μl3’ligationenzymemix1.5μl总体积10μlo)在热循环仪中25℃孵育1小时；注意：延长孵育时间和降低孵育温度(18h；16℃)可以增大甲基化修饰rna比如pirna的连接效率，但同时也可能形成串联产物。3.6反转录引物(reversetranscriptionprimer)杂交此步反应对抑制接头二聚体的形成十分关键。反转录引物可与多余的3’接头杂交，从而将单链dna接头转化为双链dna分子。而双链dna分子不是t4rnaligase1的底物，因此多余的3’接头不会与5’接头连接；注意：如果总rna起始量为100ng，将反转录引物用无酶水1:2稀释。p)向步骤o的pcr管里加入下列表7的试剂：表7.待加入的试剂无核酸酶水2.3μlreversetranscriptionprimer0.5μl总体积12.8μlq)在热循环仪中依次75℃孵育5min，37℃孵育15min,25℃孵育15min。3.7连接5′接头r)在20μl无酶水中重悬5’接头；注意：如果总rna起始量为100ng，将5′接头用无酶水1:2稀释；s)在单独的无核酸酶的200μlpcr管中加入0.6nμl的5’接头。(n为实验所处理的样本数目)在热循环仪中70℃孵育2分钟，然后立即在冰上冷却；注意：将剩余的5’重悬接头储存在-80℃冰箱。为了避免rna降解，请在接头变性后30分钟内使用接头；t)向步骤q中的pcr管中依次加入下列表8中的反应物，充分混合：表8.待加入的反应物5′adaptor(denatured)0.5μl5′ligationreactionbuffer0.5μl5′ligationenzymemix1.2μl总体积μlu)热循环仪25℃孵育1小时。3.8反转录反应v)在无核酸酶的200μlpcr管加入下列表9的反应物：表9.待加入的反应物adaptorligatedrna15μlfirst-strandsynthesisreactionbuffer4μlrnaseinhibitor0.5μlreversetranscriptase0.5μl总体积20μlw)热循环仪50℃孵育1小时，然后立即在冰上冷却，反应产物可直接用于pcr扩增反应。注意：如果未打算立即进行pcr扩增，热循环仪70℃孵育15分钟以终止rt反应。然后将样本置于-20℃冰箱保存。4.ngs高通量测序和分析4.1高通量测序测序实验前，我们使用nanodropnd-1000提取并测定总rna样品的纯度和浓度。总rna样本经过预处理，去除一些干扰rna-seq文库构建的rna修饰。再将每个样本的总rna依次连接到3'和5'小rna适配器上。然后利用illumina公司的rt引物和扩增引物合成并扩增cdna。随后，从page凝胶中提取并纯化～134-160bppcr扩增片段。最后，用agilent2100生物分析仪对完成的文库进行定量。之后将文库变性、稀释至装载量1.3ml、装载浓度1.8pm。稀释后的文库载入试剂盒。根据制造商的说明，使用nextseq500/550v2kit在illuminanextseq500系统上进行了50个周期的测序。4.2生物学信息分析首先对原始的illumina读取进行处理，生成了三组各5个样本的cdna文库。进行实验样本质控时，我们发现n组的其中一个样本在该组中存在的组内差异较大，考虑后决定将其剔除。之后，将测序读取段分别用cutadapt进行5’端和3’端的修整，并且丢弃非读取段(长度<14nt或长度>40nt)，并以fasta格式进行记录。trna衍生片段的丰度是通过它们的测序计数来评估的，以每百万总比对读数(cpm)来标准化，并将cpm低于20的序列从分析中剔除。4.3数据分析我们以foldchange>1.5,p<0.05作为条件来进行筛选差异表达的trna衍生片段。同时，我们使用off-linebasecaller软件v1.8进行图像分析和调用。主成分分析(pca)、venn图、层次聚类、散点图和火山图等分析图均在r语言中执行，用于对所表达的trna衍生片段进行统计分析和绘图。使用spss25.0进行计算。数据分布的正态性采用kolmogorovsmirnov(ks)检验。正态分布的变量用单因素方差分析进行比较，数值用均数±标准差(sd)表示。对于分布异常的变量，采用mannwhitneyu检验进行比较，非正态分布的变量以中位数(四分位间距)表示。所有p值均为双侧且p<0.05为差异有统计学意义。通过对深度测序的ngs的数据进行进一步分析发现，a组与b组的受试者血浆中trf-pro-agg-019片段表达存在差异，结果见表10所示。表10.trf-pro-agg-007的ngs数据分析结果(n＝5)组别trf名称类型长度(nt)foldchangelog2fcp值up/downavsbtrf-pro-tgg-019trf-3b220.019269727-5.697519980.026095254down从上表中可以看出，带状疱疹但后期未发展为带状疱疹后遗神经痛的患者即a组，与带状疱疹且后期发展为带状疱疹后遗神经痛的患者，即b组的p值为0.026095254，小于0.05，存在显著性差异，说明书a组患者和b组患者血浆中tsrna标志物trf-pro-agg-019的表达存在显著性差异。5.合成的cdna用于实时定量pcr验证采用qrt-pcr技术对更多的临床血浆样本进行trf-pro-agg-019的定量分析，以对上述ngs的数据分析结果进行验证，共进行了40个临床样本(50例样本中ngs分析外的其余样本)的qrt-pcr验证，其中a组20例、b组20例，结果如图1所示。从图1中可以看出，相较于a组而言，trf-thr-agt-019在b组中均显著下调，***p<0.001。这一结果表明，trf-pro-agg-019可作为带状疱疹后遗神经痛诊断的生物标志物。具体的qrt-pcr过程如下。5.1试剂：2xpcrmastermix(arraystar)；仪器：洁净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；引物设计软件：primer5.0；quantstudiotm5real-timepcrsystem(appliedbiosystems)。5.2设计引物所用trf-pro-agg-019的特异性引物的上游引物序列如seqidno.2所示，下游引物序列如seqidno.3所示：seqidno.2：f：5’cgacgatctcgaatcccagc3’；seqidno.3：r：5’ctcttccgatcttggaggcac3’。退火温度为60℃，产物长度42bp。所用内参基因u6的上游引物序列如seqidno.4所示，下游引物序列如seqidno.5所示：seqidno.4：f:5’gcttcggcagcacatatactaaaat3’；seqidno.5：r:5’cgcttcacgaatttgcgtgtcat3’。退火温度60℃，产物长度89bp。5.3制备用于绘制标准曲线的梯度稀释dna模板实时定量pcr时各样品加样量均为2μl，然而由于受rna浓度定量误差和rna逆转录效率误差等的影响，每个样品的2μl体积的cdna其含量并不完全相同，为校正此差异，我们使用管家基因u6(不同样品间表达量基本恒定)作为内参。1)针对每一需要测量的基因(即trf-pro-agg-007)和管家基因(即内参基因u6)，选择一确定表达该基因的cdna模板进行pcr反应，反应体系如表11所示；表11.pcr反应体系2×mastermix5μl10um的pcr特异引物f0.5μl10um的pcr特异引物r0.5μlcdna2μl加水至总体积为10μl轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心，设置pcr反应：95℃，10min；40个pcr循环(95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光))；2)pcr产物与100bpdnaladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测pcr产物是否为单一特异性扩增条带；3)将pcr产物进行10倍梯度稀释：设定pcr产物浓度为1，分别稀释为：1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7，1×10-8，1×10-9，这几个梯度浓度的dna。5.4进行realtimepcr反应4)将所有cdna样品分别配置realtimepcr反应体系。体系配置如下表12所示：表12.realtimepcr反应体系2×mastermix5μl10um的pcr特异引物f0.5μl10um的pcr特异引物r0.5μl加水至总体积为8μl轻弹管底将溶液混合，5000rpm短暂离心；5)加样(1)将8ul混合液加到384-pcr板对应的每个孔中；(2)再加入对应的2μlcdna；(3)小心粘上sealingfilm封口膜，并短暂离心混合；(4)在设置pcr程序前将准备好的pcr板放在冰上；6)将上述384-pcr板置于realtimepcr仪上进行pcr反应：(1)所有的指标均按以下程序进行：95℃，10min；40个pcr循环(95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光))；(2)为了建立pcr产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按(95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒)；并从60℃缓慢加热到99℃(仪器自动进行-ramprate为0.05℃/秒)进行。5.5结果与计算各样品的目的基因和管家基因分别进行realtimepcr反应。根据绘制的梯度稀释dna标准曲线，各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成。每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量，其中，trf-pro-agg-019的标准曲线、扩增曲线和溶解曲线分别见图2、3、4，管家基因u6的标准曲线、扩增曲线和溶解曲线分别见图5、6、7。序列表<110>嘉兴市第一医院<120>一种可用于带状疱疹后遗神经痛诊断的血液tsrna标志物、制备及应用<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>22<212>dna<213>trf-pro-agg-019的dna序列(dna序列)<400>1tcgaatcccagcggtgcctcca22<210>2<211>20<212>dna<213>trf-pro-agg-019的上游引物的dna序列(引物)<400>2cgacgatctcgaatcccagc20<210>3<211>21<212>dna<213>trf-pro-agg-019的下游引物的dna序列(引物)<400>3ctcttccgatcttggaggcac21<210>4<211>25<212>dna<213>u6基因的上游引物的dna序列(引物)<400>4gcttcggcagcacatatactaaaat25<210>5<211>23<212>dna<213>u6基因的下游引物的dna序列(引物)<400>5cgcttcacgaatttgcgtgtcat23当前第1页12