一种苹果果胶来源的中性低聚糖的制备方法

1.本发明属于天然产物提取技术领域，具体涉及一种苹果果胶来源的中性低聚糖的制备方法。


背景技术：

2.苹果果胶是一种由同型半乳糖醛酸(hg)、鼠李糖半乳糖醛酸i(rg
‑
i)、鼠李糖半乳糖醛酸ii(rg
‑
ii)、木糖半乳糖醛酸(xg)、阿拉伯半乳糖醛酸(ag)组成的多糖。果胶寡糖被认为是一类新的益生元，与商业益生元相比，果胶低聚糖可包括多达13种不同类型的来源于果胶的糖成分，可以增加双歧杆菌和乳酸杆菌的数量。
3.商业的益生元菊粉，低聚木糖，低聚半乳糖等都是中性低聚糖。现有研究表明阿拉伯糖(dp 2
–
11)和低聚半乳糖(dp 2
–
9)从果胶中提取的低聚糖具有体外益生元特性，而 hg(39％de)和鼠李糖乳糖醛酸主链低聚糖不具有双歧性(appl environ microb,2011,77: 5747
‑
5754)，表明中性低聚糖相比于含有酸性糖的低聚糖具有更好的益生元潜力。
4.cn110755439a公开了一种多糖益生元及其制备方法和应用，它通过长松萝提取多糖益生元，有效调节了肠道中有益菌群生长，从而有效改善了人体肠道内部的菌群的平衡性。 cn111713706a公开一种海红香米胚芽米皮制的高血压、高血糖益生元配方，它通过海红香米胚芽米皮提取益生元，这对二型糖尿病患者治疗效果较佳，也是绿色营养保健食品，既能满足人们日常的营养价值需要，又无毒副作用。但目前用苹果果胶制备中性糖低聚糖的的研究较少。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种苹果果胶来源的中性低聚糖的制备方法。
6.本发明采用的技术方案如下：
7.一种苹果果胶来源的中性低聚糖的制备方法，包括如下步骤：
8.(1)将苹果果胶(购自sigma
‑
aldrich(shanghai,china))放入100ml醋酸钠缓冲液中至终浓度为10mg/ml，加入30mg果胶酶(购自sigma
‑
aldrich(shanghai,china))，在40℃条件下水解60min，然后放入90℃水浴中至果胶酶失活15min，接着离心取上清液，将该上清液经0.45μm滤膜过滤，获得滤液后进行冷冻干燥；
9.(2)将步骤(1)所得的物料溶解在去离子水中，先用10kda超滤管分离,收集到< 10kda的第一组分，再用3kda的超滤管继续分离该第一组分获得<3kda的第二组份，接着用1kda的超滤管进一步分离第二组份获得1
‑
3kda的第三组分，然后将收集到的第三组分进行冷冻干燥；
10.(3)将上述第三组分溶解于醋酸钠缓冲液中，加到已经用同样的醋酸钠缓冲液预平衡的deae
‑
sepharose cl
‑
6b中；依次用含有0m、0.1m和0.6m nacl的醋酸钠缓冲溶液依次进行梯度洗脱，依次获得第一洗脱组分、第二洗脱组分和第三洗脱组分，将第一洗脱组分用
0.5
‑
1kda透析袋脱盐后冷冻干燥，得到第一脱盐组分
11.(4)将第一脱盐组分溶解于水中，负载于经乙腈和水预处理过的石墨碳柱上，然后依次用等体积的水、10％乙腈和50％乙腈进行洗脱，获得10％乙腈洗脱液后进行旋蒸和冷冻干燥；
12.(5)将步骤(4)所得的物料用xbridge c18柱进一步洗脱分离，得出峰时间为 1.5
‑
1.7min的馏分，即成；其中洗脱流速：15ml/min，流动相：a，甲醇/水(v/v)5:95，b 30:70，梯度洗脱时间：10min，100％a
‑
100％b，操作温度：室温，检测器：紫外检测器。
13.在本发明的一个优选实施方案中，所述醋酸钠缓冲液的ph为4。
14.进一步优选的，所述醋酸钠缓冲液的浓度为0.1m。
15.在本发明的一个优选实施方案中，所述离心的条件为8000rpm，10min。
16.在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(3)中，用含有0m、0.1m和0.6m nacl 的醋酸钠缓冲溶液依次进行梯度洗脱，每一梯度的洗脱时间为450min，洗脱流速为1 ml/min。
17.在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(4)中，将第一脱盐组分溶解于水中，负载于经6ml乙腈和6ml水预处理过的石墨碳柱上。
18.进一步优选的，所述步骤(4)中，依次6ml水、6ml 10％乙腈和6ml 50％乙腈进行洗脱。
19.在本发明的一个优选实施方案中，所述醋酸钠缓冲液的ph为4，所述离心的条件为 8000rpm，10min。
20.进一步优选的，所述步骤(3)中，用含有0m、0.1m和0.6m nacl的醋酸钠缓冲溶液依次进行梯度洗脱，每一梯度的洗脱时间为450min，洗脱流速为1ml/min；所述步骤(4)中，将第一脱盐组分溶解于水中，负载于经6ml乙腈和6ml水预处理过的石墨碳柱上。
21.更进一步优选的，所述醋酸钠缓冲液的浓度为0.1m，所述步骤(4)中，依次6ml 水、6ml 10％乙腈和6ml 50％乙腈进行洗脱。
22.本发明的有益效果是：本发明构建了一种有效的中性低聚糖的分离纯化方法，能够从苹果果胶中分离纯化出不含有半乳糖醛酸和鼠李糖的中性低聚糖，其糖成分主要含有甘露糖，阿拉伯糖，葡萄糖，半乳糖和木糖，且低聚糖的聚合度在3
‑
13之间，与菊粉的平均分子量相近。
附图说明
23.图1为本发明实施例1的流程示意图。
24.图2为本发明实施例2的hplc结果图。
25.图3为为本发明实施例2中的平均分子量测定结果图。
26.图4为为本发明实施例2中的uplc
‑
hilic
‑
esi
+
‑
ms结果图。
具体实施方式
27.以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
28.实施例1
29.如图1所示，一种苹果果胶来源的中性低聚糖的制备方法，包括如下步骤：
30.(1)将苹果果胶放入100ml醋酸钠缓冲液(ph 4.0，0.1m)中至终浓度为10mg/ml，加入30mg果胶酶，在40℃条件下水解60min，然后放入90℃水浴中至果胶酶失活15min，接着8000rpm离心10min取上清液，将该上清液经0.45μm滤膜过滤，获得滤液后进行冷冻干燥；
31.(2)将步骤(1)所得的物料溶解在去离子水中，先用10kda超滤管分离,收集到< 10kda的第一组分，再用3kda的超滤管继续分离该第一组分获得<3kda的第二组份，接着用1kda的超滤管进一步分离第二组份获得1
‑
3kda的第三组分，然后将收集到的第三组分进行冷冻干燥；
32.(3)将上述第三组分溶解于醋酸钠缓冲液中，加到已经用同样的醋酸钠缓冲液预平衡的deae
‑
sepharose cl
‑
6b中；依次用含有0m、0.1m和0.6m nacl的醋酸钠缓冲溶液依次进行梯度洗脱，每一梯度的洗脱时间为450min，洗脱流速为1ml/min，依次获得第一洗脱组分、第二洗脱组分和第三洗脱组分，每一管收集9ml洗脱液，测定每管的总糖含量，合并成四个主要的样品(pool i
‑
vi)，将第一洗脱组分对应的样品pool i用0.5
‑
1 kda透析袋脱盐后冷冻干燥，得到第一脱盐组分；
33.(4)将第一脱盐组分溶解于水中，负载于经6ml乙腈和6ml水预处理过的石墨碳柱上，然后依次用6ml水、6ml 10％乙腈和6ml 50％乙腈进行洗脱，获得10％乙腈洗脱液后进行旋蒸和冷冻干燥；
34.(5)将步骤(4)所得的物料用xbridge c18柱进一步洗脱分离，得出峰时间为1.6min 的馏分c1，即成；其中洗脱流速：15ml/min，流动相：a，甲醇/水(v/v)5:95，b 30:70，梯度洗脱时间：10min，100％a
‑
100％b，操作温度：室温，检测器：紫外检测器。
35.实施例2馏分c1的结构鉴定
36.1、单糖成份测定：利用pmp衍生化的方法，hplc测定组分中的单糖成分。
37.pmp衍生化的方法具体如下：首先是样品的水解过程，用100μl的三氟乙酸(4m) 和100μl样品(5mg/ml)混合均匀，氮气吹30min，迅速盖上盖子，110℃水解4h，冷却后加入200μl的甲醇溶液，氮气吹扫，此过程重复三次，直至吹干，加入100ul的水复溶。pmp衍生化过程，100μl的水解样品和100μl naoh(0.6m)混合均匀，从中取出50μl的样品，加入50μl的pmp溶液(0.5mol/l甲醇是被用作溶剂)70℃加热100 min，冷却后，加入50μl hcl(0.3m)中和，蒸发干燥。加水1ml复溶，三氯甲烷1ml， 12000rpm离心，分层，取水相，此过程重复三次，过0.22um的水系膜。标准样品与水解样品实验过程一致，在同一条件下同时进行。
38.hplc条件：柱子hc
‑
c18,流动相a：0.1m磷酸盐缓冲溶液(ph＝6.7):乙腈＝85： 15(v/v,％)，流动相b:1m磷酸盐缓冲溶液(ph＝6.7):乙腈＝60：40(v/v,％)，流速为1 ml/min,温度为25℃，紫外检测为245nm,梯度洗脱，0
‑
10min，100％至90％a，10
‑
30min， 90％至80％a，30
‑
45min，80％a，45.01
‑
55min，100％a。
39.结果如图2所示。
40.2、平均分子量测定：色谱条件：tskgel gmpwxl，流动相：水，流速：0.5ml/min，柱温35℃，时间：55min，结果如图3所示。
41.3、uplc
‑
hilic
‑
esi
+
‑
ms：色谱条件：流速0.3ml/min，柱温35℃，进样量:1μl，强、弱针洗溶剂分别为20/80(v/v)乙腈/水和75:25(v/v)乙腈/水。流动相a:含0.1％甲酸的乙腈，流动相b:含10mm乙酸铵和0.1％甲酸的水。梯度洗脱条件:0
‑
1min，80％a； 1
‑
25min，80％
‑
50％a；25
‑
30min，50％
‑
80％a，30
‑
35min 80％a，结果图4所示。
42.此外，馏分c1的聚合度分析如下表1所示：
[0043][0044]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。