植物乳杆菌1201及其在制备抑制鼠伤寒沙门氏菌产品中的应用

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种物乳杆菌1201及其在制备抑制鼠伤寒沙门氏菌产品中的应用。


背景技术：

2.鼠伤寒沙门氏菌感染引起的疾病已成为社会上的主要健康问题，有研究表明鼠伤寒沙门氏菌经口进入消化道后，会增加肠道中病原菌的含量，破坏肠道菌群的平衡，并通过竞争和占领使肠道菌落定殖，从而引起固有层炎症。而高脂饮食日趋普遍，亦有研究表明高脂饮食可促进鼠伤寒沙门氏菌在肠道的定植，所以鼠伤寒沙门氏菌感染可被高脂饮食加重。目前，抗生素主要用于预防和治疗鼠伤寒沙门氏菌感染，但是过量使用抗生素很容易导致病原菌的耐药性，使其难以再次治疗。当下还没有无副作用的抑制鼠伤寒沙门氏菌的方法。
3.植物乳杆菌作为肠道革兰氏阳性益生菌，可调节肠道菌群平衡，抑制有害菌的生长，在肠道免疫作用中占有重要地位。
4.本发明所述的植物乳杆菌1201，2021年1月12日保存于武汉市中国典型培养物保藏中心(china center for type culture collection，简称cctcc m，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，邮编：430072)，保藏编号为cctcc m2021050。


技术实现要素：

5.针对现有技术中的不足与难题，本发明旨在提供物乳杆菌1201在制备抑制鼠伤寒沙门氏菌产品中的应用。
6.本发明通过以下技术方案予以实现：
7.本发明的目的之一是提出一种植物乳杆菌，其为植物乳杆菌1201，2021年1月12日保存于武汉市中国典型培养物保藏中心(china center for type culture collection，简称cctcc m，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，邮编：430072)，保藏编号为cctcc m2021050。
8.本发明的第二个目的是提出一种抑制鼠伤寒沙门氏菌的益生菌菌剂，其活性成分包括权利要求1所述的植物乳杆菌。
9.所述益生菌菌剂可由植物乳杆菌1201制备而成，以一种处于稳定期的新鲜活菌菌体形式存在，可用于缓解鼠伤寒沙门氏菌感染诱导肠道炎症。
10.本发明第三个目的是提出一种抑制鼠伤寒沙门氏菌的益生菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：
11.(1)植物乳杆菌1201 mrs液体培养基37
±
1℃厌氧培养24
±
2h，到达稳定期的菌体，所述植物乳杆菌1201的保藏号为cctcc m2014170；
12.(2)离心收集步骤(1)中菌体，用无菌1
×
pbs洗涤2
‑
4次；
13.(3)用无菌1
×
pbs调整步骤(2)所得菌体浓度到1
‑2×
108cfu/ml。
14.在应用时，将向上述所得菌体中加入适宜辅料制成的药物或食物或保健品。
15.本发明的第四个目的是提出植物乳杆菌在制备抑制伤寒沙门氏菌的产品中的应用，用于制备抑制鼠伤寒沙门氏菌感染的药物或保健品或食品。
16.本发明的第五个目的是提出所述植物乳杆菌在制备预防或者治疗由伤寒沙门氏菌引起的结肠炎的产品中的应用。
17.优选的，所述产品为保健品、功能性食品或药物
18.进一步优选的，所述食品为饮料、酸奶、果冻等多种乳杆菌可生存的食品，只要植物乳杆菌可生存的食品中都可以，具体根据实际需要。
19.优选的，植物乳杆菌1201的菌剂剂量为1
×
108cfu/kg，根据具体情况计算使用，即每kg动物、人体所用菌剂中含植物乳杆菌1201达108cfu。
20.与现有技术相比，本发明筛选到一株植物乳杆菌1201，保藏编号为cctcc m2021050。该植物乳杆菌1201通过调节tlr4/nf
‑
κb炎症通路，调控炎症因子的表达，达到有效防治鼠伤寒沙门氏菌感染诱导肠道炎症的功效。
附图说明
21.图1为不同组小鼠粪便中鼠伤寒沙门氏菌含量变化；
22.图2为不同组小鼠脾脏、肠系膜淋巴结、空肠组织中鼠伤寒沙门氏菌含量变化；
23.图3为不同组小鼠结肠组织he染色染色切片；
24.图4为不同组小鼠血清中tlr4/nf
‑
κb炎症通路差异；
25.图5为不同组小鼠空肠组织炎症因子表达差异；
26.图6为不同组小鼠结肠组织炎症因子表达差异。
具体实施方式
27.下面结合附图，对本发明作进一步地说明。
28.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
29.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york：cold spring harbor laboratory press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
30.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
31.实施例1
32.菌体的活化：将保存于甘油中的植物乳杆菌1201旋涡混匀后吸取10μl涂布于mrs固体培养基中，37℃厌氧培养24h，挑取单菌落接种于4ml液体mrs培养基中，37℃厌氧培养
24h，按1％接种量接种于10ml mrs液体培养基中，37℃厌氧培养24h，达到稳定期。
33.mrs培养基配制：蛋白胨5g/l，牛肉膏5g/l，胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，葡萄糖20g/l，无水乙酸钠5g/l，柠檬酸氢二胺2g/l，磷酸氢二钾2g/l，硫酸镁0.58g/l，硫酸锰0.25g/l，吐温
‑
80 1ml/l，ph6.3
±
0.1，121℃、15分钟灭菌。
34.实施例2
35.植物乳杆菌菌剂的制备：将活化好的处于稳定期的植物乳杆菌1201离心，收集新鲜菌体，用无菌1
×
pbs洗涤3次，用无菌1
×
pbs调菌体浓度到108cfu/ml，制成实验所需菌剂，备用。
36.实施例3鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠模型的构建及实验设计：
37.km小鼠在无菌鼠房内适应一周后，md、md2、md3组(n＝8)小鼠给予正常日粮和正常饮水，hfd、hfd2、hfd3组(n＝8)小鼠给予60％大卡高脂饮食和正常饮用水。然后，分别向md和hfd组(n＝8)灌胃200μl 1xpbs，md2和hfd2组(n＝8)灌胃100μl 1xpbs和100μl 1x108cfu/ml鼠伤寒沙门氏菌atcc 13311，md3和hfd3组(n＝8)灌胃100μl 1x108cfu/ml植物乳杆菌a19和100μl 1x108cfu/ml鼠伤寒沙门氏菌atcc 13311。灌胃菌株后3h，6h，24h，48h，72h，96h收集小鼠粪便。灌胃4d后，将小鼠用乙醚安乐死，在无菌环境中收集小鼠血清，脾脏，肠系膜淋巴结，结肠，盲肠，空肠和结肠内容物备用。另取结肠组织，生理盐水迅速冲洗干净，标本于10％福尔马林溶液浸泡，做he染色。
38.实验结果：
39.(1)明显降低小鼠粪便中鼠伤寒沙门氏菌含量
40.高脂饮食组小鼠粪便中鼠伤寒沙门氏菌含量均大于正常饮食组，经过灌胃植物乳杆菌1201菌剂干预96h后，干预组小鼠较感染组小鼠粪便中鼠伤寒沙门氏菌含量有明显的降低，如图1所示。说明本发明可有效降低小鼠粪便中鼠伤寒沙门氏菌。
41.(2)明显抑制鼠伤寒沙门氏菌在小鼠体内定植
42.经过灌胃植物乳杆菌1201菌剂干预96h后，干预组小鼠较感染组小鼠空肠、脾脏、肠系膜淋巴结中鼠伤寒沙门氏菌含量有明显的降低，如图2所示，干预组小鼠较感染组小鼠脏器中鼠伤寒沙门氏菌含量有效降低，说明本实施例的植物乳杆菌1201菌剂可抑制鼠伤寒沙门氏菌在小鼠体内定植。
43.(3)显著改善小鼠病理学情况
44.将不同组小鼠组结肠组织制成病理学切片，感染组小鼠结肠组织与自然对照组进行对比，从图3可以看出，感染组结肠出现明显的粘膜下层边缘模糊，炎症细胞浸润。本发明组(植物乳杆菌菌剂处理组)结肠肌层平滑，炎症现象明显减少。说明了本发明菌剂可有效缓解鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠的结肠组织炎症，具有修复致病菌诱导的肠道损伤的功效。
45.(4)菌剂显著调节鼠伤寒沙门氏菌感染诱导的tlr4/nf
‑
κb信号通路
46.取小鼠血清，检测tlr4/nf
‑
κb信号通路相关蛋白tlr4，myd88，ikk
‑
β，iκb
‑
α，nf
‑
κb的表达水平。
47.由图4可以看出，本发明中干预组小鼠较感染组小鼠蛋白表达水平得到显著调节，下调了tlr4，myd88，ikk
‑
β，nf
‑
κb表达水平，并上调了iκb
‑
α的表达水平。说明了本发明菌剂可通过调节tlr4/nf
‑
κb信号通路相关蛋白，从而达到保护机体抗炎症的目的。
48.(5)菌剂显著调节鼠伤寒沙门氏菌感染诱导的结肠组织炎症因子的表达
49.将结肠组织进行rna提取，反转录操作后，检测炎症因子ifn
‑
γ，il
‑
1β，tnf
‑
α，il
‑
6，il
‑
17a，il
‑
10，il
‑
22，tgf
‑
β的表达水平。
50.由图5和图6可以看出，本发明中干预组小鼠较感染组小鼠炎症因子表达水平得到显著调节，下调了促炎症因子ifn
‑
γ，il
‑
1β，tnf
‑
α，il
‑
6，il
‑
17a表达水平，同时下调了抑炎症因子il
‑
10，il
‑
22，tgf
‑
β的表达水平。说明了本发明菌剂可通过调节细胞因子表达水平，从而达到保护机体抗炎症的目的。
51.以上所述仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。