抗流感病毒多肽及其应用

1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及抗流感病毒多肽及其应用。


背景技术：

2.甲型流感病毒(iav)是一种上呼吸道病原体，进化速度快，常导致季节性流行病和偶发流行病。根据世界卫生组织的统计，全球每年流感病毒导致约290,000-650,000人死亡(http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/influenza)。当前，2009年甲型h1n1流感病毒和h3n2流感病毒是季节性流行的主要毒株。目前主要采用接种疫苗和服用抗病毒药物的策略来预防和治疗流感病毒。由于变异株和耐药株的不断出现大大降低了目前疫苗和疗法的功效，因此仍然需要开发针对宿主因子新的抗流感药物。
3.当前用于治疗流感病毒的药物主要是金刚烷和神经氨酸酶抑制剂，它们分别靶向该病毒的m2离子通道和神经氨酸酶。金刚烷胺是1966年批准用于临床第一个抗iav药物。起初，这种药物在抑制和预防iav感染方面均非常成功，功效高达90％。但是，自2000年以来，季节性iav亚型对这种药物的耐药性急剧增加，目前，在全球范围内传播的大多数iav亚型，尤其是最常见的h1n1和h3n2均对金刚烷类耐药。
4.神经氨酸酶抑制剂(扎那米韦和奥司他韦)是目前唯一使用的抗流感药物。临床研究表明，iav通过突变这些病毒成分已经获得了对药物的抗药性。根据cdc的数据，在2009年大流行的h1n1亚型出现之前，超过99％的h1n1分离株对奥司他韦具有抗药性。因此，制定新的抗击流感战略非常紧迫和必要。
5.抗流感病毒治疗作为救治流感感染的关键手段，但目前临床可及的有效抗病毒药物仅有神经氨酸酶抑制剂(neuraminidase inhibitors，nais)。由于nais疗效的限制和耐药情况的出现，亟需研发疗效更优和耐药率更低的新型抗流感病毒药物。


技术实现要素：

6.本发明的一个目的是提供一种蛋白质。
7.本发明提供的蛋白质，为如下1)-3)中至少一种：
8.1)含有序列表中序列3第36-43氨基酸残基的蛋白；
9.2)序列表中序列3第36-43氨基酸残基所示的蛋白；
10.3)将1)或2)所示蛋白的氨基酸末端添加标签序列得到的蛋白。
11.编码上述蛋白质的核酸分子也是本发明保护的范围。
12.含有上述核酸分子的表达盒、重组载体、重组病毒或转基因细胞也是本发明保护的范围。
13.上述蛋白质或上述的核酸分子或上述的表达盒、重组载体、重组病毒或转基因细胞在制备如下产品中的应用也是本发明保护的范围：
14.1)治疗甲型流感病毒；
15.2)抑制甲型流感病毒的复制；
16.3)抑制甲型流感病毒中np蛋白的表达；
17.3)降低甲型流感病毒的滴度；
18.4)预防或减轻甲型流感病毒引起的并发症。
19.上述应用中，所述甲型流感病毒引起的并发症为肺组织损伤或肺部炎症或体重下降。
20.本发明另一个目的是提供一种产品。
21.本发明提供的产品，包括上述蛋白质或上述的核酸分子或上述的表达盒、重组载体、重组病毒或转基因细胞。
22.上述产品具有如下至少一种功能：
23.1)治疗甲型流感病毒；
24.2)抑制甲型流感病毒的复制；
25.3)抑制甲型流感病毒中np蛋白的表达；
26.3)降低甲型流感病毒的滴度；
27.4)预防或减轻甲型流感病毒引起的并发症。
28.上述产品中，所述甲型流感病毒引起的并发症为肺组织损伤或肺部炎症或体重下降。
29.本发明发现一段抗病毒多肽p21截断体，现有流感病毒对其没有耐药性，抗病毒效果好，由于多肽分子量小相对药物来讲副作用小，且比较稳定。与对照组相比较，p21截断体多肽处理组的小鼠体重明显减轻，小鼠的肺组织中的病毒滴度明显降低。进一步证明该p21截断体多肽模拟物具有显著抑制流感病毒复制的作用。
附图说明
30.图1为抗流感病毒多肽初的筛选。
31.图2为western blot鉴定含有8个氨基酸的多肽模拟物抑制细胞内iav的复制。
32.图3为免疫荧光实验检测含有8个氨基酸的多肽模拟物抑制细胞内iav的复制。
33.图4为含有8个氨基酸的多肽模拟物抑制小鼠体内iav的复制，比例尺为100μm。
具体实施方式
34.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
35.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
36.病毒经10日龄无特定病原体的鸡胚或者mdck细胞进行扩繁并储存在-80℃超低温冰箱中备用。所有关于活病毒的实验都是在3级生物安全实验室中进行的。
37.细胞：hek293t细胞(人胚胎肾细胞系)，a549细胞(人肺腺癌上皮细胞系)和hela细胞是从国家细胞系储存中心获得并储存于液氮中备用。
38.所有细胞均在37℃的温度下，在含有10％胎牛血清，100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem培养基中维持和培养。
39.实验动物：5-6周龄c57/bl6雌鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
40.商品化试剂：多肽模拟物由南京金斯瑞生物合成有限公司进行合成，sirnas oligo模拟物购买自苏州吉玛基因股份有限公司；rapure total rna kit提取试剂盒从
magen公司采购；rna反转录试剂:5
×
mlv buffer、mlv反转录酶、dntps、rna酶抑制剂采购自promega公司；sybr green pcr mastermix购买自roche公司；舒泰50购自virbrac公司；磷酸盐缓冲液(pbs)、lipofectamine 3000转染试剂购自invitrogen公司；、100
×
青链霉素和edta-胰酶购自迈晨科技有限公司；dmem培养基、澳洲胎牛血清和opti-mem购买自life technologies公司；tpck-trypsin购自sigma公司；7.5％bsa、30％丙烯酰胺溶液、temed由北京索莱宝公司提供；tris、甘氨酸、过硫酸铵、sds来自amresco公司生产；6
×
protein loading buffer购自全式金公司；蛋白marker由thermo公司生产；0.45μm pvdf膜、ecl显色试剂盒购买自milipore公司。4％组织固定液、免疫染色通透液(triton x-100)、免疫染色封闭液、免疫染色一抗稀释液、免疫荧光染色二抗稀释液、western一抗稀释液、ripa裂解液、pmsf蛋白酶抑制剂、β-actin一抗、辣根过氧化物酶hrp标记的山羊抗小鼠igg二抗和hrp标记的山羊抗兔igg二抗都是由碧云天生物技术有限公司提供；fitc标记的山羊抗小鼠igg荧光二抗由abcam公司提供；np一抗由genscript公司生产。p21蛋白抗体由cst公司提供。
41.配制试剂
42.(1)细胞培养试剂和溶液：
43.dmem细胞生长培养液(含有10％胎牛血清)：由445ml dmem培养基，50ml胎牛血清，5ml双抗(1万iu/ml)配制而成。
44.细胞维持培养液(不含血清、病毒感染时使用)：由495ml dmem培养基，5ml双抗(1万iu/ml)配制而成。
45.细胞冻存液：由9ml胎牛血清，1ml二甲基亚砜(dmso)配制而成。
46.(2)western blot实验相关试剂和溶液：
[0047]5×
tris-甘氨酸蛋白电泳液：在去离子水中充分溶解94g的甘氨酸，15.1g的tris，5g的sds，最后用去离子水定容到5l。在需要使用的实验开始前，用去离子水将电泳液稀释至1l。
[0048]
10
×
转印缓冲液：分别称720.65g的甘氨酸，151.4g的tris，充分溶解于去离子水里，最后定容至5l。使用前用去离子水稀释至1l，其中添加20％甲醇。
[0049]
1.5m tris-cl(ph 8.8)：于超纯水中充分溶解72.66g的tris，用浓盐酸调节ph值至8.8，用去离子水定容到400ml，最后用滤纸过滤。
[0050]
1m tris-cl(ph 6.8)：于超纯水中充分溶解48.44g的tris，用浓盐酸调节ph值至6.8，用去离子水定容到400ml最后用滤纸过滤。
[0051]
10％过硫酸铵：称1g的过硫酸铵，加入10ml超纯水，充分溶解后放置于4℃保存。
[0052]
10％sds：使用100ml超纯水溶解10g的sds，68℃水浴助溶，室温保存。
[0053]6×
sample buffer(蛋白上样缓冲液)：分别称取16mg溴酚蓝，3.72g dtt，4gsds，加入12ml甘油，在1m tris-cl(ph 6.8)中充分溶解最终定容至40ml，分装后于-20℃保存。
[0054]
pbst：取pbs粉末按说明书的要求溶于2l的去离子水中，并加入1ml tween-20。
[0055]
5％脱脂奶：2.5g脱脂奶粉溶解到50ml pbst中。
[0056]
10％sds-page分离胶：将5.9ml去离子水、5ml 30％丙烯酰胺、3.8ml 1.5m tris-hcl(ph8.8)、0.15ml 10％sds和0.15ml 10％过硫酸铵(aps)依次加入烧杯中混匀后，快速加入0.006ml temed混匀，配制15ml的分离胶。
[0057]
sds-page浓缩胶：将4.1ml去离子水、1ml 30％丙烯酰胺、0.75ml 1.5m tris-hcl
(ph6.8)、0.06ml 10％sds和0.06ml 10％过硫酸铵依次加入烧杯中混匀后，快速加入0.006ml temed混匀，制备成6ml分离胶。
[0058]
质粒转染
[0059]
(1)提前标记好每个ep管。向每个离心管中加入200μl jet-prime buffer。
[0060]
(2)向离心管中加入2μg待转染质粒，吹打或震荡离心管中的混合液，使其混匀，随后瞬离10s.
[0061]
(3)然后将4μl的jet-prime转染试剂自下向上缓慢加入到离心管中，混匀并瞬离10s，室温静置离心管30min，使质粒与转染试剂充分孵育。
[0062]
(4)取出前一天铺好的6孔细胞板，将质粒和转染试剂混合液轻轻加入细胞板，轻摇混匀。
[0063]
(5)继续培养细胞，在相应时间点进行后续试验。
[0064]
质粒pcmv-gfp的核苷酸序列为序列表中序列1。
[0065]
蛋白p21的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列2，该蛋白的氨基酸序列为序列表中序列3。
[0066]
实施例1、抗流感病毒多肽的获得
[0067]
一、抗流感病毒多肽初步判断
[0068]
1、构建宿主蛋白p21截断体的表达质粒
[0069]
利用基于转录组测序的rnai文库筛选影响iav复制的宿主蛋白，对其中抑制iav复制最为显著的宿主蛋白p21进行深入研究。为了鉴定p21蛋白序列中发挥抗iav功能的主要区域，构建了一系列p21截短体，在其序列n端融合gfp标签，然后将其分别转染到感染了iav病毒的细胞中，评估核蛋白np的表达水平。
[0070]
通过构建一系列宿主蛋白p21截断体的表达质粒(gfp-p21，gfp-1-76，gfp-36-100，gfp-70-140，gfp-70-164)，具体方法如下：
[0071]
质粒gfp-p21为将序列表中序列2所示的p21蛋白编码基因替换质粒pcmv-gfp的hindiii酶切位点和bsmbi酶切位点间的片段得到的质粒；该质粒表达n端融合gfp的p21蛋白；
[0072]
质粒gfp-1-76为将序列表中序列2第1-228位所示的p21蛋白截短体1-76的编码基因替换质粒pcmv-gfp的hindiii酶切位点和bsmbi酶切位点间的片段得到的质粒；该质粒表达n端融合gfp的p21蛋白截短体1-76(p21蛋白截短体1-76的氨基酸序列为序列3第1-76位)；
[0073]
质粒gfp-36-100为将序列表中序列2第106-300位所示的p21蛋白截短体36-100的编码基因替换质粒pcmv-gfp的hindiii酶切位点和bsmbi酶切位点间的片段得到的质粒；该质粒表达n端融合gfp的的p21蛋白截短体36-100(p21蛋白截短体36-100的氨基酸序列为序列3第36-100位)；
[0074]
质粒gfp-70-140将序列表中序列2第208-420位所示的p21蛋白截短体70-140的编码基因替换质粒pcmv-gfp的hindiii酶切位点和bsmbi酶切位点间的片段得到的质粒；该质粒表达n端融合gfp的p21蛋白截短体70-140(p21蛋白截短体70-140的氨基酸序列为序列3第70-140位)；
[0075]
质粒gfp-70-164将序列表中序列2第70-166位所示的p21蛋白截短体70-164的编
码基因替换质粒pcmv-gfp的hindiii酶切位点和bsmbi酶切位点间的片段得到的质粒；该质粒表达n端融合gfp的p21蛋白截短体70-164(p21蛋白截短体70-164氨基酸序列为序列3第70-164位)。
[0076]
2、抗流感病毒多肽的筛选
[0077]
(1)a549细胞铺细胞板：在进行质粒转染实验前24h左右将a549细胞(国家细胞系储存中心获得并储存于液氮中备用)从大细胞瓶中传至6孔板，计算好实验所需的细胞孔数，同时多铺一孔细胞用于计数，注意观察。待细胞长至细胞孔80％-90％时，将细胞孔中的培养液轻轻移除，使用pbs轻轻洗涤细胞一次，弃去洗液；
[0078]
(2)质粒转染：用jetprime转染试剂(polyplus公司21y0910l5)分别将1微克的质粒gfp-p21，gfp-1-76，gfp-36-100，gfp-70-140，gfp-70-164转到a549细胞中，4小时后更换新的细胞培养基，得到转染不同质粒的细胞；
[0079]
(3)病毒的稀释：将h5n1亚型病毒(记载在如下文献中，文献中的名称为a/anhui/1/2005(h5n1)，chen h.h5n1 avian influenza in china.sci china c life sci.2009may；52(5):419-27.doi:10.1007/s11427-009-0068-6.epub 2009may 27.pmid:19471864.)的尿囊液从-80℃冰箱中取出置于4℃化开，使用细胞计数仪按照常规细胞计数的方式进行细胞计数，按照moi＝0.1对所需病毒的感染量进行计算，按照计算结果对h5n1亚型病毒的尿囊液用含有1％(体积百分含量)双抗无血清dmem培养基进行稀释，得到稀释后h5n1亚型病毒(浓度为1*105)；
[0080]
(4)感染病毒：将上述(3)得到的稀释完成的病毒液按照moi＝0.1加入到上述(2)得到的洗涤好的装有转染不同质粒的细胞的6孔细胞板(细胞浓度为1*106)中，放置于37℃、5％co2培养箱中进行培养，待病毒吸附1h后，将细胞孔中的液体换成含有1％(体积百分含量)双抗无血清dmem培养基；
[0081]
(5)收样：使用sample buffer(6
×
sample buffer(蛋白上样缓冲液)：分别称取16mg溴酚蓝，3.72g dtt，4gsds，加入12ml甘油，在1m tris-cl(ph 6.8)中充分溶解最终定容至40ml，分装后于-20℃保存。)裂解上述细胞样品，瞬时离心后使用细胞超声仪将细胞样品进行超声(变幅杆：2，功率《250w)，离心(12000r 15min)收集上清液，同时用1
×
的7.4ph值的pbs重悬沉淀，得到重悬液；
[0082]
(6)western blot鉴定：
[0083]
配胶：提前洗干净玻璃板、梳子、胶条的等。按照配方先配制10％分离胶，用水封住胶面，待分离胶凝固后，倒掉水加入5％浓缩胶，插上合适的梳子，待胶凝固后，将其置于电泳槽中组装好电泳槽中，向内层电泳槽中加满新配置的电泳液，拨出梳子后，外层电泳槽补满电泳液；
[0084]
煮样：分别取上述20μl步骤(5)中制备的超声裂解后上清液以及pbs沉淀重悬液，加入4μl 6
×
蛋白上样缓冲液，100℃金属浴煮样10min；
[0085]
上样：加入10μl蛋白样品至上样孔中，另外在样品孔的两侧各加入10μl蛋白marker；
[0086]
电泳：将电泳仪的程序设置为恒压65v电泳30min，恒压120v电泳1h，恒压55v；注意观察电泳至溴酚蓝跑出胶底部后，完成电泳，轻轻取出蛋白胶，同时使用蒸馏水冲洗蛋白胶以去除残留的电泳液；
[0087]
转印：提前将滤纸、海绵浸泡于预冷过的转印液中，待电泳结束后，小心卸下胶块，参考蛋白胶上的marker，根据目的蛋白的大小进行切胶，同时测量出蛋白胶的长宽以裁剪合适大小的pvdf膜，将pvdf膜浸于无水甲醇中进行活化；在转印夹中按照海绵、4层滤纸、蛋白胶、pvdf膜、4层滤纸、海绵的顺序依次铺放好，注意每一层均需要用玻璃棒赶尽气泡，最后将转印夹夹好放于转印槽中，倒入足量转印液，250ma恒流转印1h；
[0088]
封闭：待转印完成后，取出pvdf膜，观察pvdf膜上是否有清晰的marker条带来判断转膜是否成功。将膜放置于5％脱脂乳中，水平摇床上室温封闭1h或4℃过夜；
[0089]
一抗的孵育：封闭完成后，将pvdf膜用pbst迅速涮洗干净，将干净的膜放置于用一抗稀释液稀释过的np单抗(genscript公司a01506-40)和gfp单抗(santa cruz公司sc-9996))，于4℃水平摇床上孵育过夜；
[0090]
二抗的孵育：一抗孵育完成后回收一抗，使用pbst洗膜三次，每次5min，然后加入5％脱脂乳10000倍稀释hrp标记的igg(碧云天a0208)，水平摇床室温孵育1h；
[0091]
显色：孵育完二抗后，使用pbst洗膜三次，每次10min，提前开启tanon 5200全自动化学发光图像曝光仪。洗膜完成后，在pvdf膜上加上适量显色液直至完全覆盖膜表面，避光显色2min；
[0092]
曝光：用镊子将pvdf膜从发光液中取出，将膜放置于曝光仪中曝光，曝光时间按照蛋白表达量的多少而定，保存曝光图片并分析结果。
[0093]
结果如图1a所示，经分析np蛋白表达量，综合wb图中1-76、36-100、70-140三段np蛋白的表达量，发现p21的36-70氨基酸序列具有显著抗病毒活性，主要发挥抗流感病毒的生物学功能，以下进一步缩小范围研究。
[0094]
二、确定发挥抗甲型流感病毒iav的最小氨基酸序列
[0095]
1、构建宿主蛋白p21截断体的表达质粒
[0096]
质粒gfp-36-43为将序列表中序列2第106-129位所示的p21蛋白截短体36-43的编码基因替换质粒pcmv-gfp的hindiii酶切位点和bsmbi酶切位点间的片段得到的质粒；该质粒表达n端融合gfp的p21蛋白截短体36-43(p21蛋白截短体36-43的氨基酸序列为序列3第36-43位)；
[0097]
质粒gfp-44-50为将序列表中序列2第130-147位所示的p21蛋白截短体的编码基因替换质粒pcmv-gfp的hindiii酶切位点和bsmbi酶切位点间的片段得到的质粒；该质粒表达n端融合gfp的p21蛋白截短体44-50(p21蛋白截短体44-50的氨基酸序列为序列3第44-50位)；
[0098]
质粒gfp-51-60为将序列表中序列2第151-177位所示的p21蛋白截短体的编码基因替换质粒pcmv-gfp的hindiii酶切位点和bsmbi酶切位点间的片段得到的质粒；该质粒表达n端融合gfp的p21蛋白截短体51-60(p21蛋白截短体51-60的氨基酸序列为序列3第51-60位)；
[0099]
质粒gfp-61-69为将序列表中序列2第181-69位所示的p21蛋白截短体的编码基因替换质粒pcmv-gfp的hindiii酶切位点和bsmbi酶切位点间的片段得到的质粒；该质粒表达n端融合gfp的p21蛋白截短体61-69(p21蛋白截短体61-69的氨基酸序列为序列3第61-69位)。
[0100]
2、抗流感病毒多肽的筛选
[0101]
(1)a549细胞铺细胞板：与上述一中的2相同；
[0102]
(2)质粒转染：用jetprime转染试剂分别将1微克的质粒gfp-36-43,gfp-44-50,gfp-51-60,gfp-61-69转到a549细胞中，4小时后更换新的细胞培养基，得到转染不同质粒的细胞。
[0103]
(3)病毒的稀释：与上述一中的2相同；
[0104]
(4)感染病毒：与上述一中的2相同；
[0105]
(5)收样：与上述一中的2相同；
[0106]
(6)western blot鉴定：与上述一中的2相同；
[0107]
结果如图1b所示，p21蛋白第36-43位(对应质粒gfp-36-43)具有显著的体外抗iav活性。
[0108]
因此，p21蛋白第36-43位截短体p21(36-43)为目标多肽，其氨基酸序列为序列表中序列3第36-43位。
[0109]
实施例2、多肽模拟物p21(36-43)抑制细胞内iav的复制
[0110]
为了进一步确认该氨基酸序列的应用价值，人工合成了序列3第36-43位所示的多肽模拟物p21(36-43)，并在a549细胞中验证了其对iav复制的影响。
[0111]
1、多肽模拟物p21(36-43)抑制细胞内iav的复制
[0112]
(1)a549细胞铺细胞板：在进行感染实验前24h左右将a549细胞从大细胞瓶中传至6孔板，计算好实验所需的细胞孔数，同时多铺一孔细胞用于计数，注意观察。待细胞长至细胞孔80％-90％时，将细胞孔中的培养液轻轻移除，使用pbs轻轻洗涤细胞一次，弃去洗液。
[0113]
(2)病毒的稀释：将h5n1亚型病毒的尿囊液从-80℃冰箱中取出置于4℃化开，使用细胞计数仪按照常规细胞计数的方式进行细胞计数，按照moi＝0.1对所需病毒的感染量进行计算，按照计算结果对h5n1亚型病毒的尿囊液用含有1％(体积百分含量)双抗无血清dmem培养基进行稀释，得到稀释后h5n1亚型病毒(浓度为1*105)；
[0114]
(3)感染病毒：将上述(2)得到的稀释完成的病毒液按照moi＝0.1加入到上述(1)得到的洗涤好的装有细胞的6孔细胞板(细胞浓度为1*106)中，放置于37℃、5％co2培养箱中进行培养，待病毒吸附1h后，将细胞孔中的液体换成含有1％(体积百分含量)双抗无血清dmem培养基；
[0115]
(4)添加多肽模拟物：分别向(3)得到的感染病毒的6孔板中加入多肽模拟物p21(36-43)，使其终浓度分别为5，10，15微摩。
[0116]
(5)收样：使用sample buffer裂解上述细胞样品，瞬时离心后使用细胞超声仪将细胞样品进行超声，离心收集上清，同时用pbs重悬沉淀；
[0117]
2、western blot鉴定
[0118]
与实施例1对应的方法相同，以不添加p21(36-43)为对照。
[0119]
结果如图2上图所示，可以看出，该多肽p21(36-43)以剂量依赖性方式抑制np蛋白的表达，表明多肽p21(36-43)以剂量依赖性方式抑制病毒复制水平。
[0120]
3、免疫荧光ifa鉴定
[0121]
前期操作同上述1的(1)-(4)，之后进行以下操作：
[0122]
洗涤：轻轻甩去孔中的培养液，使用pbs清洗一遍，动作轻柔避免细胞脱落，弃去孔中的pbs；
[0123]
固定：每孔中加入适量的按照无水乙醇：丙酮＝3：2比例配成的固定液，室温固定20min；
[0124]
洗涤：将孔中的固定液甩干，使用pbs洗涤3遍，每洗一遍就将其放在摇床上震荡洗涤3-5min；
[0125]
封闭：每孔加入适量5％脱脂乳制成的封闭液，放置于37℃恒温培养箱中封闭1h，使用pbs洗涤3遍，每洗一遍就将其放在摇床上震荡洗涤3-5min；
[0126]
一抗孵育：只用pbs将np单克隆抗体(abcam公司ab20343)稀释5000倍，每孔加入适量稀释好的一抗，4℃过夜；
[0127]
洗涤：轻轻甩去孔中的培养液，使用pbs清洗三遍，动作轻柔避免细胞脱落，弃去孔中的pbs。
[0128]
二抗孵育：将fitc标记的羊抗小鼠igg(kpl/seracare)用pbs稀释400倍，每孔加入适量稀释好的二抗，使用锡箔纸避光，37℃温箱孵育1h；
[0129]
洗涤：弃去孔内液体，使用pbst洗涤3遍，每洗一遍就将其放在摇床上震荡洗涤3-5min；
[0130]
观察结果：在荧光显微镜下观察细胞的情况，与阳性对照对比，有较为明亮的绿色荧光则将其判定为阳性。
[0131]
免疫荧光实验结果如图3所示，比例尺为10μm，可以看出，在用多肽模拟物p21(36-43)处理的a549细胞中，np蛋白的表达被显著抑制。
[0132]
按reed-muench法计算tcid50。
[0133]
半数感染量按reed-muench法公式计算，
[0134][0135]
log10 tcid50＝高于50％感染率的病毒稀释度对数+相应距离比
×
稀释系数的对数
[0136]
其中10倍倍比稀释的修正系数为1。
[0137]
结果如图2下图所示，可以看出，该多肽p21(36-43)以剂量依赖性方式使细胞上清中的病毒滴度相应降低。
[0138]
实施例2、抗流感病毒多肽p21(36-43)在动物模型中抗病毒的验证
[0139]
选择6-8周龄、雌性b57/cl6雌性小鼠，每个实验组6只小鼠，分别滴鼻接种相同剂量的h5n1亚型病毒iav(a/anhui/1/2005(h5n1)，50tcid
50
/50μl剂量每只小鼠。
[0140]
选择6-8周龄、雌性b57/cl6雌性小鼠，分为2组，实验组和对照组，每组6只，用生理盐水按说明书稀释麻醉剂(舒泰50)，将稀释后的麻醉剂给上述各组小鼠肌肉注射，50μl/只。
[0141]
具体如下：
[0142]
1、攻毒
[0143]
多肽药物处理组：待实验组小鼠陷入麻醉，以50tcid
50
/50μl的剂量将h5n1亚型病毒经鼻腔途径接种雌鼠，50μl/只；
[0144]
对照组：待对照组小鼠陷入麻醉，以50tcid
50
/50μl的剂量将h5n1亚型病毒经鼻腔途径接种雌鼠，50μl/只。
[0145]
2、给药
[0146]
多肽药物处理组小鼠：在接种iav后，每隔48小时腹腔注射0.3ml体积的多肽模拟物p21(36-43)溶液(p21(36-43)溶液浓度为15mg/kg以小鼠体重给药)，第一次注射为接种iav后第1天(以接种iav当天记作第1天)，共注射7次；
[0147]
对照组小鼠：在接种iav后，每隔48小时腹腔注射0.3ml的相应的生理盐水(0.9％nacl)，共注射7次，第一次注射为接种iav后第1天(以接种iav当天记作第1天)，共注射7次；
[0148]
多肽模拟物p21(36-43)溶液为将多肽模拟物p21(36-43)溶解在生理盐水得到的溶液，浓度为6.0*10-4
m/l。
[0149]
3、检测
[0150]
1)tcid50检测
[0151]
随后每天监测小鼠体重变化，并检测感染后第五天(以接种iav当天记作第1天)在指定时间点处死小鼠，取小鼠肺脏，利用tcid
50
检测肺脏病毒滴度。
[0152]
(1)提前12-24h将mdck细胞(实验室液氮储存)铺至96孔细胞板，待细胞生长到密度80％-90％左右时，弃去细胞上清，用pbs洗涤细胞3次。
[0153]
(2)用含0.25％bsa和1％双抗的dmem维持培养基(低致病性iav需添加终浓度为2μg/ml的tpck-trypsin)将肺脏研磨后的上清液进行10
1-10
10
的10倍倍比稀释。
[0154]
(3)分别在3个细胞孔中加入100μl的相同稀释度的上清液液进行感染。以37℃5％co2的条件进行培养。在病毒感染后的36-48h之内，取细胞上清进血凝试验。同时进行间接免疫荧光(ifa)检测。
[0155]
间接免疫荧光检测(ifa)
[0156]
(1)清洗：轻轻甩掉细胞瓶中的细胞上清液，使用pbs清洗3遍。
[0157]
(2)固定：提前按照乙醇：丙酮＝3:2的比例配置固定液，并于-80℃预冷。向每个细胞孔加入50μl预冷的固定液，室温静置15min。
[0158]
(3)清洗：轻轻甩掉固定液，使用pbs缓冲液洗涤细胞3遍。
[0159]
(4)一抗孵育：用pbs稀释np单克隆抗体(abcam公司ab20343)至5000倍，每孔加入30μl，放37℃温箱孵育1h(或4℃过夜)。
[0160]
(5)清洗：轻轻甩去孔内一抗，用pbs缓冲液洗涤细胞，重复洗涤3次。
[0161]
(6)二抗孵育：提前用pbs将fitc标记的羊抗小鼠igg(kpl/seracare)稀释到400倍，每孔加入30μl，在37℃温箱避光孵育1h。
[0162]
(7)清洗：轻轻甩去孔内二抗，用pbst(1000ml pbs中添加0.5ml吐温-20)，洗涤细胞，在摇床上轻晃洗涤3min后再弃去洗液，清洗3次。
[0163]
(8)结果观察：在荧光显微镜下发绿色荧光的细胞被认为是病毒感染的阳性细胞，该孔为阳性孔。按reed-muench法计算tcid50。
[0164]
参考上述实施例1。
[0165]
2)ihc染色:取小鼠肺脏组织，利用组织细胞固定液进行固定，由我院病理实验室进行免疫组化切片染色。
[0166]
结果如图4所示，a图中上图为小鼠体重变化图，下图为小鼠肺脏病毒滴度，b图为
免疫组化ihc染色结果，可以看出，与对照组相比较，多肽药物处理组的小鼠体重明显减轻，小鼠的肺组织中的病毒滴度明显降低(图4a)。组织病理学分析表明，多肽处理的小鼠减弱了肺组织损伤和炎症(图4b)。
[0167]
上述结果表明，p21的第36-43位氨基酸序列(即截短体p21(36-43))在抑制iav复制中起重要作用，并且基于该序列合成的多肽模拟物对iav有一定的治疗效果。