一种产耐热酸性纤维素酶菌株HSU-6及其应用

一种产耐热酸性纤维素酶菌株hsu
‑
6及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物领域，具体涉及一种产耐热酸性纤维素酶菌株hsu
‑
6及其应用。


背景技术：

2.能源是制约社会发展和人类进步的重要因素，处在“后石油时代”的当今社会能源问题已不容忽视；因此，开发可再生的清洁能源刻不容缓。纤维素是构成植物秸秆的主要成分之一，也是自然界中分布最广、含量最多的多糖；其每年可通过植物光合作用产生750亿吨以上，是一种来源丰富的可再生生物质能源；对其进行开发和利用已成为能源领域的研究热点。
3.纤维素由d
‑
吡喃葡萄糖经β
‑
1,4
‑
糖苷键聚合而成，其聚合度可达10000左右，是一种高聚合度多糖。同时，纤维素糖链上存在大量羟基，可形成分子内或分子间氢键，造成其难溶于水或有机溶剂，影响其开发与利用。目前，用于降解纤维素的方法主要分为物理、化学与生物学方法。物理法主要是采用超微粉碎、蒸汽爆破等方法改变纤维素的天然结构以增加其可溶性和反应活性，但这些方法耗能大、成本高，不利于纤维素的利用。化学法主要是采用强酸或强碱进行处理，其虽可有效的降解纤维素，但强酸或强碱具有非常强的腐蚀性，对反应设备要求高且对工艺要求较高，需强化后续产物中酸或碱处理工艺，对环境污染较为严重。因此，对环境友好、能耗低、常温常压下即可进行纤维素降解的生物学方法已成为纤维素资源开发与利用的重点与热点。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的问题，本发明提供一种产耐热酸性纤维素酶菌株hsu
‑
6及其应用，所述菌株产的纤维素酶能耐受40～50℃的温度，对金属离子fe
3+
、ca
2+
、cu
2+
、ni
2+
和hg
2+
及有机溶剂等具备一定的耐受力，这些特性显示该纤维素酶特别适合在工业化生产上使用。
5.本发明为实现上述目的所采用的技术方案为：
6.一株产耐热酸性纤维素酶菌株，所述菌株为蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)，于2021年5月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，菌株保藏编号为：cctcc no:m 2021599，保藏地址：中国，武汉，武汉大学。
7.进一步的，所述菌株的16s rdna序列如seq id no.1所示。
8.进一步的，所述菌株16s rdna序列的扩增引物为：
9.27f:5
′‑
agagtttgatcctggctcag
‑3′
；
10.1492r:5
′‑
tacggctaccttgttacgactt
‑3′
。
11.一种纤维素酶制备方法，将上述菌株培养发酵，并在发酵后的培养液中提取纤维素酶。
12.一种纤维素酶，所述纤维素酶采用上述方法制备而成。
13.一株产耐热酸性纤维素酶菌剂，所述菌剂包含上述菌株。
14.上述菌株或纤维素酶在生物发酵或生产去污产品中的应用。
15.进一步的，应用温度为40～50℃，ph值为4～6。
16.一种去污剂，包括上述纤维素酶，并包括fe
3+
、k
+
、ca
2+
、cu
2+
、ni
2+
或hg
2+
中的一种或多种。
17.一种去污剂，包括上述纤维素酶，同时也包括甲醇、乙醇、异丙醇、二甲基亚砜和triton x
‑
100中的一种或多种。
18.有益效果：
19.生物学上主要采用各种纤维素酶如外切葡萄糖苷酶(exo
‑
1,4
‑
β
‑
glucanase，cbh)、内切葡萄糖苷酶(endo
‑
1,4
‑
β
‑
glucanase，cmcase或eg)和β
‑
葡萄糖苷酶(β
‑
glucosidase，bg)对纤维素进行降解，以获得纤维素寡糖、纤维二糖等产物，并最终将其分解为葡萄糖用于生产生物乙醇、单细胞蛋白等。故筛选高活力、应用广泛的纤维素酶具有重要价值。本发明以反刍动物羊瘤胃为实验材料，采用刚果红选择培养基从中筛选高活力的纤维素酶，并分别用16s rdna测序技术和酶活力测定方法对筛选的菌株进行分子鉴定及其产纤维素酶酶学参数进行测定，以期为筛选适合工业化应用的纤维素酶提供菌种资源。
附图说明
20.图1为菌株hsu
‑
6的菌落特征。
21.图2为菌株hsu
‑
6基于16s rdna序列构建的分子进化树。
22.图3为ph值对纤维素酶酶活力的影响。
23.图4为温度对纤维素酶酶活力的影响。
24.图5为发酵时间对纤维素酶酶活力的影响。
25.图6为金属离子对纤维素酶酶活力的影响。
26.图7为有机溶剂对纤维素酶酶活力的影响。
27.图8为有机溶剂对纤维素酶酶活力的影响。
具体实施方式
28.下面结合附图和实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。
29.1.材料与方法
30.1.1实验材料
31.1.1.1菌株初筛样品
32.本实验用于产纤维素酶菌株筛选的羊瘤胃于当地农贸市场购买，并于4℃保存备用。
33.1.1.2实验仪器
34.生物安全柜(新加坡esco，ac2
‑
4s1型)、高压灭菌锅(重庆雅马拓，sq510c型)、恒温振荡培养箱(上海旻泉，mqd
‑
b2r型)、电热三温区恒温水槽(上海匡贝实业，dk
‑
8d型)、紫外可见分光光度计(上海精密科学仪器，uv
‑
765型)、高速离心机(美国贝克库尔特公司，avantij
‑
e型)。
35.1.1.3实验试剂
36.羧甲基纤维素钠(cmc
‑
na)、3,5
‑
二硝基水杨酸、苯酚、柠檬酸、酒石酸钾钠、柠檬酸三钠、nacl、naoh、zncl2、hcl、cacl2、kcl、nicl2·
6h2o等购买于国药集团化学试剂有限公司。刚果红、蛋白胨、酵母粉、琼脂糖等购于上海生工生物工程有限公司；细菌基因组dna提取试剂盒(dp302)购自天根生化科技(北京)有限公司。
37.1.1.4 dns试剂及培养基配制
38.还原糖检测试剂dns配制如下：用电子天平称量酒石酸钾钠182g，放入烧杯中加入450～650ml的蒸馏水，用玻璃棒不断地搅拌使其充分溶解，然后按照顺序依次加入3，5
‑
二硝基水杨酸6.3g、naoh 21g和苯酚5g充分搅拌直至无颗粒性物质，冷却至室温并定容至1000ml，经过滤除菌和杂质，保存于棕色瓶子中，避光保存一周方可使用。产纤维素酶菌株的富集和发酵培养基配制如下：精确称取cmc
‑
na 10g、酵母粉5.0g、氯化钠10g、蛋白胨10g放入烧杯中并加入400ml蒸馏水进行搅拌至完全溶解，将其转移到锥形瓶中定容至1000ml，121℃，0.1mpa，灭菌20min即可。刚果红固体选择培养基如下制备：精确称量cmc
‑
na 1.88g、蛋白胨10g、k2hpo4 0.5g、酵母粉5g、mgso4.7h2o 0.25g、琼脂14g、明胶2.00g放入烧杯中并加入400ml蒸馏水进行搅拌至完全溶解，转移到锥形瓶中定容至1000ml，121℃，0.1mpa，灭菌20min。同时将配制好的1mg/ml的刚果红染液0.1mpa，115℃，灭菌30min。最后冷却至一定温度，并在培养基中加入刚果红染液5ml，混匀(不要产生气泡)倒平板，待刚果红培养基凝固后放入4℃冰箱保存。
39.1.2实验方法
40.1.2.1菌种初筛样本的制备
41.用灭菌后的手术剪从新鲜羊瘤胃上随机剪取几块组织，放入同一无菌烧杯；用手术剪将其剪碎后，放入无菌匀浆器中，加入适量无菌水后匀浆。倒出匀浆液后静置半小时，再吸取1.0ml溶液为初始菌液。
42.1.2.2产纤维素酶菌株的分离与纯化
43.从上述原始菌液中吸取0.5ml并转接至富集培养基(以羧甲基纤维素钠为唯一碳源)中，于37℃恒温培养箱中180r
·
min
‑1富集培养。培养12h后，分别吸取该富集培养液稀释至10
‑4、10
‑5和10
‑6并分别涂布于刚果红筛选培养基上，37℃恒温培养2～3d；同时，每隔24h观察刚果红培养基上是否形成透明水解圈。待有稳定的水解圈形成后，分别测量菌落直径(c)和水解圈直径(h)，并计算h/c比值；取比值大的菌株进行划线纯化，直至单菌落稳定形成。分别给纯化后的菌株进行编号，并保存备用。
44.1.2.3产纤维素酶菌株的分子鉴定
45.选取菌株hsu
‑
6(h/c比值大的菌株之一)为研究材料，观察其菌落特征；再用基因组dna抽提试剂盒提取其基因组dna并检测其纯度。合成细菌通用引物27f:5
′‑
agagtttgatcctggctcag
‑3′
和
46.1492r:5
′‑
tacggctaccttgttacgactt
‑3′
，并用这对引物扩增菌株hsu
‑
6的16s rdna序列，验证纯度后委托上海生工生物工程有限公司测序。获得该菌株的16s rdna序列后于16s ribosomal rna sequences数据库(ncbi数据库子库)进行序列比对。从比对结果中挑选序列一致性高的代表序列，用软件clustal x 2.1和mega 6.06进行同源性分析及构建分子进化树，以确定菌株hsu
‑
6的种属。
47.1.2.4葡萄糖标准曲线的绘制
48.配制1mg/ml的标准葡萄糖溶液，并测定其与dns溶液混匀后在波长540nm处的吸光值，重复3次，求平均值后绘制葡萄糖标准曲线。本文测得的标准液葡萄糖浓度(y)与吸光值(z)的回归方程是z＝12.868y
‑
0.2372，r2＝0.9995；线性度良好，可用于后续酶活力定量实验。
49.1.2.5粗酶液制备
50.从
‑
80℃冰箱中取出保存的hsu
‑
6菌株，于刚果红培养基上划线复苏；再从复苏的平板上挑取一个菌株hsu
‑
6的单克隆菌落转接于发酵培养基中培养12h；然后按照1.0％接种量接种于新发酵培基中，并置于28℃摇床中180r
·
min
‑1发酵3d。取发酵液于4℃冷冻离心机中12 000r
·
min
‑1离心10min，将离心获得的上清液作为粗酶液。
51.1.2.6纤维素酶最佳反应ph值
52.取6支干净的玻璃试管，分别加入2.0ml不同ph值3、4、5、6、7和8缓冲液配制的1％cmc
‑
na底物，再加入1.0ml粗酶液并混匀，
53.然后置于40℃恒温水浴锅中反应20min。向反应液中加入2.0ml dns试剂，混合均匀后于沸水中煮10min；其冷却至室温后定容至10ml，并于540nm处测量其吸光值，重复3次。同时，取灭活的粗酶液为对照组，测量相同条件的吸光值，计算酶活力。纤维素酶活力的定义为一定条件下，每毫升粗酶液每小时水解cmc
‑
na底物产生1μmol葡萄糖所需的酶量。
54.1.2.7纤维素酶最佳反应温度
55.参考参照在1.2.6确定的最佳反应ph值下，以步骤1.2.6的方法测定该纤维素酶在不同反应温度30、40、50、60和70℃下的酶活力。
56.1.2.8发酵时间对酶活力的影响
57.参考步骤1.2.5中的方法，在不同发酵时间2、3、4、5、6和7d分别取发酵液制备粗酶液，并在步骤1.2.6和1.2.7确定的最佳反应ph值和温度下，测定发酵液的酶活力。
58.1.2.9金属离子对酶活力的影响
59.加入终浓度为1mmol
·
l
‑1的cacl2、hgcl2、kcl、nicl2和cucl2等金属离子处理，参照步骤1.2.7方法测定不同金属离子对此纤维素酶的影响。
60.1.2.10纤维素酶对高温的耐受能力
61.将发酵5d后的粗酶液分别置于30、40、50、60和70℃等温度下处理0.5、1和2h，然后参照步骤1.2.7确定的最佳反应ph值和温度，测定该纤维素酶在不同温度处理下的酶活力。同时，以未经耐热处理的粗酶液为对照组，比较该纤维素酶对不同温度的耐受能力。
62.1.2.11纤维素酶对有机溶剂的耐受能力
63.在纤维素酶活力测定体系中分别加入终浓度为1％和15％(v/v)的甲醇、异丙醇、乙醇、triton x
‑
100和二甲基亚砜等有机试剂，参照步骤1.2.7方法测定其酶活力；同时，以加入等量反应缓冲液处理的纤维素酶为对照组，比较该纤维素酶对不同有机试剂的耐受能力。
64.2.结果与分析
65.2.1产纤维素酶菌株hsu
‑
6的分子鉴定
66.采用刚果红筛选培养基自羊瘤胃内筛选到一株编号为hsu
‑
6的菌株，其能产纤维素酶(图1)。由图1结果可知，菌株hsu
‑
6可在以cmc
‑
na为唯一碳源的刚果红固体培养基上产生稳定、明显的水解透明圈；其产生的透明圈直径(h)为44.5mm，菌株hsu
‑
6菌落直径(c)为
8.5mm，两者比值h/c约为5.2；革兰氏染色发现该菌株是一种革兰氏阳性杆菌。
67.用细菌鉴定通用引物27f和1492r对提取的菌株hsu
‑
6基因组上16s rdna序列进行扩增和测序，将测序后的结果在ncbi数据库的nucleotide blast工具中进行比对分析，从比对结果中选择序列一致性99％以上的序列构建菌株hsu
‑
6的分子进化树(图2)。从构建的进化树结果知，菌株hsu
‑
6与bacillus cereus strain nbrc 15305等蜡样芽孢杆菌位于相同的进化树分支上；综合菌落特征、革兰氏染色和分子进化树分析结果，可将菌株hsu
‑
6鉴定是蜡样芽胞杆菌hsu
‑
6(bacillus cereus strain hsu
‑
6)。
68.2.2ph值对纤维素酶酶活力的影响
69.为探究该纤维素酶的最佳反应ph值，用不同ph值缓冲液测试该纤维素酶的酶活力(图3)。从测定的实验结果可知，菌株hsu
‑
6产纤维素酶在ph值3.0时，酶活力约为3.3u
·
ml
‑1；随着ph升高至4.0，其酶活力也迅速升至6.3u
·
ml
‑1；当ph值继续升高时，其酶活力不再继续升高，反而缓慢下降；当ph值升至7.0、8.0时，该酶酶活力降低至4.1u
·
ml
‑1及以下。以上结果表明，该纤维素酶的最适反应ph值为4.0。
70.2.3温度对纤维素酶酶活力的影响
71.在上述确定的最佳反应ph值4.0时，测定菌株hsu
‑
6产纤维素酶在30～70℃温度下的酶活力(图4)。由实验结果可知，反应温度在30～40℃时，该纤维素酶酶活力随温度升高而升高，并在40℃时达到最大值7.5u
·
ml
‑1；当反应温度继续上升，其酶活力不再继续上升反而下降，并在70℃时达到最低值4.8u
·
ml
‑1。该实验结果表明，此纤维素酶的最适反应温度为40℃。
72.2.4发酵时间对纤维素酶酶活力的影响
73.在上述确定的最佳反应ph值和温度下，测定不同发酵时间产纤维素酶的酶活力(图5)。从实验测定结果知，发酵2d时该发酵液纤维素酶酶活力可达8.3u
·
ml
‑1；随着发酵时间的增加，发酵液中纤维素酶酶活力也缓慢升高，并在发酵第5d时达到最大酶活力9.1u
·
ml
‑1；当发酵时间继续增加至6、7d时，该发酵液中纤维素酶酶活力下降至7.5u
·
ml
‑1，保持相对稳定。
74.2.5金属离子对纤维素酶酶活力的影响
75.在最适反应ph值4.0和最佳反应温度40℃时，测定不同金属离子对该纤维素酶酶活力的影响(图6)。从测定的实验数据看，fe
3+
离子对该纤维素酶酶活力略有提高；k
+
和ca
2+
离子可略微降低该纤维素酶酶活力至93.9％和92.5％；cu
2+
、ni
2+
和hg
2+
离子可显著降低该酶活力至80.2％、79.8％和76.1％。实验结果表明，该纤维素酶对金属离子有一定的耐受能力。
76.2.6纤维素酶对高温的耐受能力
77.将该纤维素酶粗酶液分别置于30～70℃温度下处理不同时间，测定其对不同温度的耐受能力(图7)。从测定的实验结果看，在30～50℃温度范围内，处理1或2h有利于维持该纤维素酶酶活力；而在60或70℃时，处理1或2h会迅速降低该酶酶活力，并使其降至正常酶活力的10％左右。故该纤维素酶能耐受40～50℃温度，是一种耐热纤维素酶。
78.2.7纤维素酶对有机溶剂的耐受能力
79.以最适ph和温度值条件下测定的纤维素酶活力为100％，比较添加1％和15％(v/v)两个浓度的有机溶剂对该纤维素酶酶活力的影响(图8)。从图8结果知，当有机溶剂浓度
为1％时，甲醇、异丙醇和二甲基亚砜(dmso)对该纤维素酶酶活力的影响不大，乙醇会使酶活力轻微减小，但triton x
‑
100会使酶活力小幅度升高。当有机溶剂浓度增加至15％时，甲醇、乙醇、异丙醇和二甲基亚砜会使该纤维素酶酶活力小幅度减小，但酶活力皆在85％以上；而triton x
‑
100会使酶活力明显升高，这说明该纤维素酶对有机溶有一定耐受能力。
80.纤维素是一种来源丰富的可再生生物质能源，可用于能源、饲料等行业，具有重大开发价值；而纤维素酶在纤维素开发与利用中发挥举足轻重的作用，故从植物、动物肠道、反刍动物瘤胃等筛选纤维素酶高产菌株一直是微生物领域研究的热点。
81.反刍动物瘤胃内存在着原生动物、细菌和古细菌等微生物群落，在纤维素分解过程中发挥重要作用，是高产纤维素酶菌株筛选的重要来源。本发明以黄山当地饲养的羊瘤胃为材料，从中筛选出一株产纤维素酶菌株hsu
‑
6，经分子鉴定为蜡样芽孢杆菌。后续通过酶活力参数测定，发现菌株hsu
‑
6产纤维素酶的最适ph值是4.0，且在ph值4.0～6.0范围内维持比较高的酶活力，是一种酸性纤维素酶；酸性纤维素酶在畜牧业、能源和环境保护行业等具有重要应用价值，故本发明筛选的纤维素酶具有重要应用价值。同时，本发明还发现该纤维素酶能耐受40～50℃的温度，对金属离子fe
3+
、ca
2+
、cu
2+
、ni
2+
和hg
2+
及有机溶剂等具备一定的耐受力，这些特性显示该纤维素酶特别适合在工业化生产上使用，故菌株hsu
‑
6值得开发与利用。后续可采用现代分子生物学技术对该纤维素酶的编码基因和蛋白氨基酸序列进行研究与分析，为构建该纤维素酶高产大肠杆菌菌株奠定基础。
82.本发明从羊瘤胃中筛选出一株产耐热酸性纤维素b.cereus菌株hsu
‑
6，其产纤维素酶的最适ph值和温度分别是4.0和40℃，是一种耐热酸性纤维素酶；且对有机溶剂也有一定耐受能力。该菌株产纤维素酶的粗酶液在最适条件下的酶活力可达9.1u
·
ml
‑1，可为纤维素的体外降解提供新纤维素酶资源。
83.菌株hsu
‑
6的16s rdna序列如seq id no.1所示。
84.>hsu
‑685.tggattaagagcttgctcttatgaagttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccataagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggataacattttgaaccgcatggttcgaaattgaaaggcggcttcggctgtcacttatggatggacccgcgtcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtgctagttgaataagctggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggtggtttcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactgggagacttgagtgcagaagaggaaagtggaattccatgtgtagcggtgaaatgcgtagagatatggaggaacaccagtggcgaaggcgactttctggtctgtaactgacactgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgaagttaacgcattaagcactccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgaaaaccctagagatagggcttctccttcgggagcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccatcattaagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacggtacaaagagctgcaagaccgcga
ggtggagctaatctcataaaaccgttctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtggggtaacc。