施旺细胞的制备方法及应用与流程

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种施旺细胞的制备方法及应用。

背景技术：

成熟分化的神经元细胞曾被认为不具有自发再生能力，目前观点认为轴突再生障碍和神经前体细胞分化与宿主细胞所处的微环境有关。诸多研究表明，施旺细胞(schwann，scs)是影响神经微环境的重要因素。施旺细胞的胞核呈长卵圆形，其长轴与轴突平行，核周有少量胞质。由于施旺细胞包在轴突的外面，故又称神经膜细胞，它的外面包有一层基膜。施旺细胞最外面的一层胞膜与基膜一起往往又称神经膜，光镜下可见此膜。当周围神经损伤时，施旺细胞发生形态行为学的改变，分泌多种神经营养因子、改善神经细胞微环境，引导轴突再生。施旺细胞在神经再生方面具有重要作用，许多外周神经鞘由施旺细胞组成。神经损伤时，施旺细胞还具有吞噬作用。同时，施旺细胞构建神经再生通道帮助神经修复。损伤的神经轴通过芽生穿过施旺细胞构建的通道到达目标器官或组织。但是如果缺乏施旺细胞与神经轴的连接，神经轴就会死亡，神经修复也不会发生。因此施旺细胞对周围神经修复、再生具有重要作用，并且不可或缺。虽然早在1995年就发现移植施旺细胞和支架成分能促进轴突再生，但这需要足量的施旺细胞提供神经营养物质和趋化因子，如何获得满足移植数量的施旺细胞是亟待解决的问题。成体施旺细胞采集通常需要自体样本手术采集，容易导致神经周围组织甚至神经组织的二次损伤，而且采集到的数量有限，体外分离和培养均比较困难。

随着细胞研究的发展，发现干细胞具有多向分化能力潜能，来源相对简单，且干细胞移植近年被尝试用于治疗神经系统疾病。例如文献报道，脂肪源性间充质干细胞(adscs)经多步诱导可以体外定向分化成施旺细胞，分化后的施旺细胞能促进神经元的轴突生长，且新生长的轴突具备兴奋传递的功能。目前，脂肪源性间充质干细胞分化为施旺细胞常采用化学法和与施旺细胞共培养法来实现，但是这两种方法都存在一定的弊端。化学诱导法需要添加多种生长因子等活性成分，诱导成本非常昂贵，为了达到好的效果还需要预诱导，程序繁琐。共培养法是利用施旺细胞与脂肪源性间充质干细胞共培养的原理，但是施旺细胞在体外很难培养，常常受到成纤维细胞的污染。

技术实现要素：

基于此，有必要提供一种效率以及纯度较高的施旺细胞的制备方法。

一种施旺细胞的制备方法，包括以下步骤：

获取干细胞；

提高所述干细胞中缝隙连接蛋白43的表达量；

诱导培养缝隙连接蛋白43的表达量提高后的所述干细胞分化为施旺细胞。

本发明的施旺细胞的制备方法将蛋白表达调控和细胞诱导结合起来，通过提高干细胞中缝隙连接蛋白43(cx43)的表达量改变干细胞的细胞学特性，以提高施旺细胞的制备效率及细胞性能，增强施旺细胞对神经损伤的再生修复作用。cx43的表达量提高后的干细胞经过诱导分化后能呈现出更成熟的施旺细胞的形态特征，且所需时间比蛋白表达量未提高的对照组少，纯度也更高。与对照组相比，cx43表达量提高的干细胞分化所得的施旺细胞，能更高地表达s100β、gfap、p75ntr等施旺细胞特征标记基因，以及分泌更多的bdnf、ngf等神经营养因子，从而能更好地发挥施旺细胞调控组织微环境的作用，有利于促进后续的轴突再生和神经修复。

在其中一个实施例中，通过外源转入缝隙连接蛋白43基因以提高所述干细胞中缝隙连接蛋白43的表达量。

在其中一个实施例中，所述外源转入缝隙连接蛋白43基因的方法包括以下步骤：使用含有缝隙连接蛋白43基因的病毒载体转染所述干细胞。

在其中一个实施例中，所述含有缝隙连接蛋白43基因的病毒载体通过以下步骤制备得到：将缝隙连接蛋白43基因与穿梭载体连接并线性化，然后与病毒载体共转化感受态细胞，筛选提取得到含有缝隙连接蛋白43基因的病毒载体。

在其中一个实施例中，所述病毒载体为腺病毒载体。

在其中一个实施例中，所述干细胞为脂肪源性间充质干细胞。

在其中一个实施例中，诱导所述干细胞分化为施旺细胞的方法包括以下步骤：将所述干细胞于含有β-巯基乙醇的培养基中培养12～36小时，然后于含有反式维甲酸的培养基中培养12～36小时，再于施旺细胞培养基中培养4～9天。

在其中一个实施例中，所述施旺细胞培养基中包含以下组分：8wt％～15wt％无动物源成分血清替代品、4ng/ml～6ng/mlpdgf-aa、8ng/ml～12ng/mlbfgf、180ng/ml～220ng/mlheregulin和3mol/l～8mol/lforskolin。

在其中一个实施例中，所述β-巯基乙醇的浓度为0.5mmol/l～1.5mmol/l，所述反式维甲酸的浓度为30ng/ml～40ng/ml。

本发明还提供了一种核酸分子在用于制备施旺细胞中的应用，所述核酸分子编码缝隙连接蛋白43。

附图说明

图1为实施例1中倒置相差显微镜下的脂肪源性间充质干细胞的细胞形态图；

图2为实施例2中流式细胞仪鉴定培养得到的脂肪源性间充质干细胞的细胞表面标志物cd44、cd45和cd90的结果；

图3为实施例3中构建的载体padtrack-cx43-cmv的结构示意图；

图4为实施例4中实时荧光定量pcr检测cx43腺病毒载体感染48小时(cx43-48h)、96小时(cx43-96h)和7天(cx43-7d)的脂肪源性间充质干细胞以及空白对照组(wt-48h)和阴性对照组(nc-48h)的脂肪源性间充质干细胞中cx43的表达水平；

图5为实施例5中分化诱导7天后的施旺细胞状态，左图为源于转染空白对照载体肪源性间充质干细胞分化所得的施旺细胞，右图为源于转染cx43腺病毒载体脂肪源性间充质干细胞分化所得的施旺细胞；

图6为实施例6中实时荧光定量pcr检测施旺细胞标记基因s100β、gfap、p75ntr的表达水平；其中，adscs为未分化的脂肪源性间充质干细胞，nc-scs为源于转染空白对照载体脂肪源性间充质干细胞分化所得的施旺细胞，cx43-scs为源于转染cx43腺病毒载体脂肪源性间充质干细胞分化所得的施旺细胞；

图7为实施例7中elisa检测施旺细胞的bdnf和ngf分泌水平；其中，adscs为未分化的脂肪源性间充质干细胞，nc-scs为源于转染空白对照载体脂肪源性间充质干细胞分化所得的施旺细胞，cx43-scs为源于转染cx43腺病毒载体脂肪源性间充质干细胞分化所得的施旺细胞。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明一实施例的一种施旺细胞的制备方法，包括以下步骤s1～s3：

s1、获取干细胞；

s2、提高干细胞中缝隙连接蛋白43的表达量；

s3、诱导培养缝隙连接蛋白43的表达量提高后的干细胞分化为施旺细胞。

细胞缝隙连接广泛存在于中枢神经系统中，传递相邻细胞间的电化学信息，对神经发育及神经功能维持具有重要的调控作用。缝隙连接是由缝隙连接蛋白(connecxin，cx)组合形成连接子，在相邻细胞膜之间衔接而成的膜通道结构。目前已发现20余种cx，其中cx43被证实可通过多种途径发挥抑制细胞凋亡、促进创面愈合、保护神经元的作用，但是其是否可用于施旺细胞的制备中并发挥何种作用仍未可知。通过研究发现，化学诱导施旺细胞所需要添加的全反式维甲酸和bfgf可以明显提高cx43的表达；丙戊酸能有效地诱导脂肪源干细胞向施旺细胞分化，有可能是通过上调cx43表达实现的；cx43能调控细胞内的camp水平，而camp对施旺细胞的分化至关重要；移植cx43基因沉默的施旺细胞，神经生长因子表达降低，脑损伤修复受阻。以上研究结果提示cx43在施旺细胞的分化、脑神经损伤修复中可能有重要作用。

本发明的施旺细胞的制备方法将蛋白表达调控和细胞诱导结合起来，通过提高干细胞中缝隙连接蛋白43(cx43)的表达量改变干细胞的细胞学特性，以提高施旺细胞的制备效率及细胞性能，增强施旺细胞对神经损伤的再生修复作用。cx43的表达量提高后的干细胞经过诱导分化后能呈现出更成熟的施旺细胞的形态特征，且所需时间比蛋白表达量未提高的对照组少，纯度也更高。与对照组相比，cx43表达量提高的干细胞分化所得的施旺细胞，能更高地表达s100β、gfap、p75ntr等施旺细胞特征标记基因，以及分泌更多的bdnf、ngf等神经营养因子，从而能更好地发挥施旺细胞调控组织微环境的作用，有利于促进后续的轴突再生和神经修复。

在一个具体示例中，通过外源转入缝隙连接蛋白43基因以提高干细胞中缝隙连接蛋白43的表达量。可以理解，也可以通过增强内源缝隙连接蛋白43基因的表达水平来提高干细胞中缝隙连接蛋白43的表达量。缝隙连接蛋白43基因的geneid为2697，cdna编码区序列为nm_000165.5。

在一个具体示例中，外源转入缝隙连接蛋白43基因的方法包括以下步骤：使用含有缝隙连接蛋白43基因的病毒载体转染干细胞。

在一个具体示例中，含有缝隙连接蛋白43基因的病毒载体通过以下步骤制备得到：将缝隙连接蛋白43基因与穿梭载体连接并线性化，然后与病毒载体共转化感受态细胞，筛选提取得到含有缝隙连接蛋白43基因的病毒载体。

在一个具体示例中，上述病毒载体为腺病毒载体。可选地，上述病毒载体也可以是慢病毒载体。

在一个具体示例中，腺病毒载体为padeasy-1载体，穿梭载体为padtrack-cmv载体。例如，将cx43基因序列连接到穿梭载体padtrack-cmv中，所得padtrack-cx43-cmv线性化后，与腺病毒载体padeasy-1共同在感受态中转化；涂板，挑选克隆鉴定，摇菌过夜并制备纯化的质粒；用脂质体转染法将重组腺病毒载体padeasy-1/padtrack-cx43-cmv转入293细胞包装病毒；转染后7～14d，将细胞反复冻融，短暂离心样品，收集含病毒颗粒的上清液，上清液浓缩，过滤离心，得到已浓缩的重组腺病毒。可以理解，具体载体不限于此，可根据需要选择。

在一个具体示例中，上述干细胞为成体干细胞，进一步优选为脂肪源性间充质干细胞。脂肪源性间充质干细胞是来源于脂肪组织的一种具有多向分化潜能的成体干细胞，其来源相对简单，满足样本来源广泛的要求，适于临床研究和使用。

在一个具体示例中，脂肪源性间充质干细胞的获取方法包括以下步骤：从脂肪组织体外分离脂肪源性间充质干细胞，传代至第3～5代后收集细胞。

具体的，从脂肪组织体外分离脂肪源性间充质干细胞的方法包括以下步骤：脂肪组织剪碎后加入3～5倍体积的0.05wt％～0.1wt％的ⅰ型胶原酶，放入37℃孵育箱中消化60～120min；加入含8v/v％～12v/v％fbs的dmem/f12中和，离心后重悬洗涤沉淀；用150～250目的细胞筛过滤，收集滤液，接种于培养瓶中，5％co2、37℃培养箱培养；48h后换液并去除未贴壁细胞，以后每3天换液1次；细胞汇合度达70％～90％时用0.25wt％胰酶消化传代，收获p1代脂肪源性间充质干细胞。

在一个具体示例中，上述诱导干细胞分化为施旺细胞的方法包括以下步骤：将干细胞于含有β-巯基乙醇的培养基中培养12～36小时，然后于含有反式维甲酸的培养基中培养12～36小时，再于施旺细胞培养基中培养4～9天。诱导得到的p0代施旺细胞可待汇合度达70％～90％时用0.25wt％胰酶消化传代，以施旺细胞培养基重悬p1代施旺细胞，接种至重组人层黏连蛋白、重组人纤黏连蛋白、重组人神经调节蛋白-1β包被的培养瓶中。可以理解，诱导干细胞分化为施旺细胞的方法不限于此，只要提高了干细胞中缝隙连接蛋白43的表达量，采用其他已知的诱导方法也能够提高施旺细胞的制备效率及细胞性能。

在一个具体示例中，β-巯基乙醇的浓度为0.5mmol/l～1.5mmol/l，反式维甲酸的浓度为30ng/ml～40ng/ml。进一步优选地，β-巯基乙醇的浓度为1mmol/l，反式维甲酸的浓度为35ng/ml。

在一个具体示例中，上述施旺细胞培养基中包含以下组分：8wt％～15wt％无动物源成分血清替代品、4ng/ml～6ng/mlpdgf-aa、8ng/ml～12ng/mlbfgf、180ng/ml～220ng/mlheregulin和3mol/l～8mol/lforskolin。进一步优选地，上述施旺细胞培养基中的无动物源成分血清替代品的浓度为10wt％、pdgf-aa的浓度为5ng/ml、bfgf的浓度为10ng/ml、heregulin的浓度为200ng/ml和forskolin的浓度为5mol/l。

以下为具体实施例。

实施例1脂肪源性间充质干细胞(adscs)的制备

取白色脂肪组织放入含有pbs的培养皿中。在培养皿中用pbs清洗三遍，除去肉眼可见的血丝及血管。脂肪组织剪碎成1mm³，加入50ml的离心管中，加入5倍体积的0.075％的ⅰ型胶原酶，震荡混匀后放入37℃孵育箱中消化90min，每15min震荡一次。消化成糊状后向离心管中加入同体积的dmem/f12(含1％双抗，10％fbs)，混匀后，1500rpm/min，离心15min。离心后取出，弃去上层未消化的脂肪组织及上层液体，向沉淀中加入5mldmem/f12重悬，然后1500rpm/min离心15min。向沉淀中加入3mldmem/f12重悬，用200目的细胞筛过滤，收集滤液，以2×10⁵/ml接种于75cm²培养瓶中。5％co2、37℃培养箱培养。48h后换液并去除未贴壁细胞，以后每3天换液1次。细胞汇合度达80％时用0.25％胰酶消化传代。

选取传代后的第3代细胞置于倒置显微镜下观察细胞形态，如图1所示。

实施例2脂肪源性间充质干细胞(adscs)的鉴定

流式细胞仪鉴定cd44、cd45和cd90等细胞表面标志：0.25％胰酶消化细胞，加入100μlpbs缓冲液洗涤细胞，1000r/min(离心半径18cm)，离心5min，去上清；分别加入cd44、cd45和cd90抗体2μl，室温避光孵育30min，加入100μlpbs缓冲液洗涤去除多余抗体，流式细胞仪上机检测。

流式细胞仪分析结果如图2所示，结果表明，实施例1培养的第3代脂肪源性间充质干细胞表面标志具有较高的均一性，标志间充质干细胞的cd90和cd44强阳性表达，而标志造血干细胞的cd45为阴性，提示成功分离出纯度较高的脂肪源性间充质干细胞。

实施例3pad-cx43-gfp重组腺病毒的构建及鉴定

根据cx43基因(geneid:2697)的cdna编码区序列(nm_000165.5)设计，将cx43序列片段连接到穿梭载体padtrack-cmv中，构建载体padtrack-cx43-cmv，如图3所示。

将环状的真核表达载体padtrack-cx43-cmv线性化后,与腺病毒载体padeasy-1共同在电感受态的大肠杆菌bj5183中进行电转化。将电转化后的混合物在300μl细菌培养基中重悬，37℃孵育10～20min后，涂在卡那霉素细菌培养板上，37℃中过夜培养。然后挑取最小的菌落，在含25mg/ml卡那霉素的细菌培养基中培养。将1μl正确重组的质粒再次转化入感受态大肠杆菌dh10b中，摇菌过夜并制备纯化的质粒。

应用脂质体转染法将重组腺病毒载体padeasy-1/padtrack-cx43-cmv转入包装细胞293细胞。转染后7～14d，将细胞反复冻融、震荡后，短暂离心样品，将含病毒颗粒pad-cx43-gfp的上清液移入新的离心管中-80℃保存。消化接种293细胞，培养24小时后加入以上原代病毒液100μl，培养约72小时，直至90％以上细胞变圆、漂浮，收集感染后的293细胞及上清，反复冻融5次，4℃10000r/min，离心20分钟，上清用0.22μm膜过滤后以1ml/管分装于ep管中。

在盛样管中装入含10％甘油的pbs20ml，浸泡过夜，在盛样管中加入去离子水离心洗涤3次，用70％乙醇浸泡过夜，将20ml待浓缩样本加入带100k滤膜上样管，4℃3000r/min离心45分钟，弃去滤液，在上样管中加入10mldmem培养液，4℃3000r/min离心30分钟。重复洗涤一次。上样管中即为已浓缩的重组腺病毒。

实施例4腺病毒转染adscs以获得改良的adscs

将实施例1中培养的adscs传代于dmem/f12培养液中培养24小时备用，培养条件均为37℃，5％co2。ad-cx43-gfp重组腺病毒按照感染强度(moi)4、8、20、50、100梯度分别感染adscs，并以ad-gfp组adscs以及空白对照组adscs作为对照，48小时后感染效率超过80％，且细胞毒性最小的moi值为最佳moi值，用于后续实验。

pad-cx43-gfp腺病毒载体以moi＝100来感染实施例1中培养得到的adscs，48小时、96小时和7天三个时间点(cx43-48h、cx43-72h以及cx43-7d)，并设置空白对照组(wt-48h)和阴性对照组(nc-48h)，空白对照组wt-48h为不转染病毒培养48小时，nc-48h为转染ad-gfp的腺病毒培养48小时。

提取各组细胞总rna，再逆转录成cdna，以gapdh作为内参，通过实时荧光定量pcr检测腺病毒感染后的各组adscs中cx43的表达水平。荧光定量pcr所用引物序列如下所示：

cx43-f：aagggaaagagcgaccctta

cx43-r：gctggtccacaatggctagt

gapdh-f：ccatgttcgtcatgggtgtgaacca

gapdh-r：gccagtagaggcagggatgatgttc

结果如图4所示，可以看出adscs在腺病毒感染48小时后，其cx43的表达量提高2.9倍；感染96小时后，cx43的表达量提高3.5倍；感染7天后，cx43的表达量提高3.4倍。由此，可证明adscs感染腺病毒后其cx43能够稳定持续高表达。

实施例5脂肪源性间充质干细胞向施旺细胞的诱导分化

转染对照序列(ad-gfp)的脂肪源性间充质干细胞(nc-adscs)和稳定高表达cx43的脂肪源性间充质干细胞(cx43-adscs)分别用0.25％的胰蛋白酶消化，并调整细胞密度为2×10⁵/ml，按照每孔2ml、2×10⁵/ml进行铺板。24h后更换为含1mmol/lβ-巯基乙醇(β-mercaptoethanol，β-me)的dmem/f12培养基，培养24h。然后去除培养基，用pbs清洗一遍，更换为含35ng/ml反式维甲酸(retinoidacid，ra)的dmem/f12培养液，培养24h。接着用pbs洗2遍，再更换为含10％血清替代品、5ng/ml血小板源性生长因子aa(platelet-derivedgrowthfactoraa，pdgf-aa)、10ng/ml成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bfgf)、200ng/ml重组神经调节蛋白(heregulin，hrg)和5mol/l福司克林(forskolin，fsk)的dmem/f12培养液培养7天，每隔2天换1次液，倒置显微镜下观察细胞形态变化，分别记为p0代nc-scs和cx43-scs。p0代施旺细胞nc-scs和cx43-scs分别传代培养1次。以施旺细胞培养基重悬p1代scs，接种至重组人层黏连蛋白、重组人纤黏连蛋白、重组人神经调节蛋白-1β包被的培养瓶中。

诱导7天后的施旺细胞状态如图5所示，左边为nc-scs，原来三角形或梭形的adscs细胞质向核收缩，细胞轴突细长、胞体较小，为二级或三级性针状梭型细胞，即表明培养得到了正常的施旺细胞；右边为cx43-scs，大多数细胞形态单一，胞体呈梭形周缘发亮，几乎所有细胞均呈现两端具有长突起的施旺细胞形态。与对照组相比，cx43-scs呈现更成熟施旺细胞形态，而且此类形态细胞数量更多，诱导所需时间更短。

实施例6qpcr检测施旺细胞标记基因s100β、p75ntr和gfap的表达水平

取培养48小时的p3代adscs、培养48小时的nc-scs和cx43-scs，pbs冲洗1次，提取总rna，反转录生成1μgcdna，所有操作严格按照使用说明书进行。利用荧光实时定量pcr仪，以gapdh为内参对照，采用δct法计算三组细胞s100β、p75ntr、gfap基因的相对表达量，实验重复3次。

结果如图6所示，可见adscs分化成施旺细胞后，与adscs相比，施旺细胞标记基因s100β、gfap、p75ntr表达显著提升，而且源于cx43-adscs的施旺细胞表达更高水平的施旺细胞标记基因，说明cx43-adscs诱导分化成功，且源于cx43-adscs的施旺细胞表现出更成熟的状态。

实施例7elisa检测来源于cx43-adscs的施旺细胞的分泌bdnf和ngf生物学特性

施旺细胞能通过分泌bdnf(brainderivedneurotrophicfactor)、ngf(nervegrowthfactor)等神经营养因子支持神经元和轴突的生长。通过elisa法分别检测p3代adscs、培养48小时的nc-scs和cx43-scs的培养上清中ngf、bdnf的表达，结果如图7所示。可见，adscs分化成施旺细胞后，与adscs相比，ngf、bdnf的分泌量有显著增长。且源于cx43-adscs的施旺细胞，能分泌更多ngf和bdnf，有利于神经修复。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。