采用碱处理进行脂肪酸烷基酯生产的制作方法

本申请是申请日为2015年5月28日、申请号为201580027195.1、发明名称为“采用碱处理进行脂肪酸烷基酯生产”的发明专利申请的分案申请。序列表的引用本申请包含一个计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在此。发明领域本发明涉及从脂肪酸原料生产脂肪酸烷基酯的方法。根据本发明所述的方法中包括抛光反应，在该反应中碱试剂或碱直接混合入该全酶反应混合物中。
背景技术：
：可以将脂肪酸烷基酯在标准的柴油发动机中用作燃料、生物柴油。生物柴油可以单独使用或与石化柴油混合使用。目前因为其环境方面的益处，生物柴油已经变得更有吸引力。虽然目前生物柴油主要是化学产生的(使用例如naoh和/或甲醇钠作为催化剂)，但是有几个相关的问题限制了它的发展，例如由于高含量的游离脂肪酸的油的预加工、为了在反应中的高醇盈余的需求将化学催化剂从酯和甘油相去除、和在甘油回收方法中去除无机盐。通过使用酯解酶作为催化剂，极大地防止了由化学催化剂导致的这些劣势，并且在最近这些年，在生产生物柴油的酯交换中使用脂肪酶引起了人们的兴趣。通过酶生物转换产生的生物柴油(与化学转换相比)更加环保。然而，有非常少的例外，目前酶技术未用于商业化规模的生物柴油生产。使用液体酶来进行脂肪酸烷基酯的酶生产方法描述于例如，wo2006/072256，lv等人，方法生化(processbiochemistry)45(2010)446-450)和wo2012/098114中。在生产脂肪酸烷基酯或生物柴油的方法中，将脂肪酸原料与醇(典型地甲醇)反应以产生脂肪酸烷基酯和甘油。这些方法包括另外的步骤，例如对脂肪酸烷基酯进行碱处理以降低游离脂肪酸的量。在这些加工步骤之前，将包含脂肪酸烷基酯、游离脂肪酸等的油相/疏水相与包含例如水、甘油和过量的醇的一部分的亲水相分离。在碱处理之前，油相/疏水相和亲水相的分离被认为是必须的，主要是因为，据信，在碱处理之前没有相分离，作为生产脂肪酸烷基酯的副产品形成的甘油将包含大量的盐。这是不理想的，因为甘油本身就是有价值的副产品，其中该甘油被加工成工业级甘油。另外，为了降低醇的蒸发，在碱处理之前分离油相/疏水相和亲水相被认为是有优势的，因为碱处理是在升高的温度下进行的，该温度接近醇的沸点。最后，当通过酶生物转化生产脂肪酸烷基酯/生物柴油时，在碱处理之前的相分离使再使用大量的该酶成为可能，否则该酶在碱处理过程中会至少部分变性。然而，在油相/疏水相和亲水相的分离过程中，形成了第三个乳剂相，该乳剂相也包含一些脂肪酸烷基酯或生物柴油。这个第三相不与油相/疏水相一起被收集。因此，除了带来技术挑战外，该分离步骤也导致了脂肪酸烷基酯或生物柴油的失去。因此，对生产脂肪酸烷基酯或生物柴油更有效的方法存在需求。发明概述本发明提供通过将脂肪酸原料与醇在系统中反应来生产脂肪酸烷基酯的方法，该系统包含油相/疏水相和亲水相，其中在所述醇/所述亲水相存在的情况下，通过用一种或多种碱性试剂进行处理，皂/盐形成自游离脂肪酸。本发明也提供生产脂肪酸烷基酯的方法，包括i)提供包含油相/疏水相和亲水相的系统，和ii)在水和一种或多种酯解酶存在的情况下，将存在于所述油相/疏水相中的脂肪酸原料与醇反应；其中所述一种或多种酯解酶的总量在100至500个酶单位/g油相/疏水相范围内。本发明的方法的优势是，在该方法中失去非常少的产物(即脂肪酸酯/生物柴油)，该方法提供了经济效益并增加了可持续性。另一个优势是，这些方法操作已被极大地简化了。在另外的方面，本发明提供包含至少90％(w/w)脂肪酸烷基酯、从300至400ppm皂、少于0.25％(w/w)游离脂肪酸和少于0.23％(w/w)甘油酯的组合物。附图简要说明图1：显示根据本发明所述的方法的示意图，包括具有高含量脂肪酸酯(fame相)的油相/疏水相的制备，该脂肪酸酯分离自包含残余的脂肪酸(甘油/皂相)的甘油、醇和皂/盐的亲水相；皂/脂肪酸盐的酸化以产生游离脂肪酸，该游离脂肪酸可循环利用并在酶反应中用作脂肪酸原料；以及高等级/工业级甘油的生产。图2：显示本发明的方法的实施例。该图显示批处理操作装置的工艺流程图。在具体的实施例中，该反应系统包括1％水、10％甘油、1.4当量meoh和0.3％酶(脂肪酶)，该系统对应于300个脂肪酶单位/g油相/疏水相。也可以将该装置构建为连续搅拌反应釜系统。已经包括了这些图，仅出于说明性目的，并且不应该被理解为限制本发明。发明详述定义生物柴油：短链醇的脂肪酸烷基酯(faae)、例如脂肪酸甲基酯(fame)和脂肪酸乙基酯(faee)也叫做生物柴油，因为它们可以用作石化柴油的添加剂或替代。醇：用于本发明的方法中的醇优选地是具有1至5个碳原子(c1、c2、c3、c4、或c5)的短链醇。脂肪酸原料：该术语“脂肪酸原料”在此被定义为以下底物，该底物包含甘油三脂、甘油二酯、甘油单酯、游离脂肪酸或其任意组合。原则上，任何包含脂肪酸的植物或动物来源的油和脂肪可以在本发明的方法中被用作底物来生产脂肪酸烷基酯。脂肪分解酶应用于本发明的方法中的一种或多种酯解酶选自脂肪酶，磷酸脂肪酶，角质酶，酰基转移酶或脂肪酶、磷酸脂肪酶、角质酶和酰基转移酶中的一种和多种的混合物。该一种或多种酯解酶选自在ec3.1.1、ec3.1.4、和ec2.3.中的酶。该一种或多种酯解酶也可以是一种或多种脂肪酶的混合物。该一种或多种酯解酶可以包括脂肪酶和磷酸脂肪酶。该一种或多种酯解酶包括ec3.1.1.3的脂肪酶。该一种或多种酯解酶包括在三-、二-、和单甘油酯上具有活性的脂肪酶。脂肪酶：合适的酯解酶可以是具有脂肪酶活性的多肽，例如，选自如在wo88/02775中披露的南极假丝酵母(candidaantarctica)脂肪酶a(cala)，如在wo88/02775中披露并示于wo2008065060的seqidno:1中的南极假丝酵母(c.antarctica)脂肪酶b(calb)，在ep258068中披露的疏棉状嗜热丝孢菌(thermomyceslanuginosus)(之前为柔毛腐质霉(humicolalanuginosus))脂肪酶，在wo2000/60063或wo1995/22615中披露的疏棉状嗜热丝孢菌(thermomyceslanuginosus)变体(具体地，示于wo95/22615的seqidno:2的位置1-269处的脂肪酶、hyphozymasp.脂肪酶(wo98/018912)、和曼赫根毛霉(曼赫根毛霉)脂肪酶(在wo2004/099400中的seqidno:5))，来自产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(ep218272)、洋葱假单胞菌(ep331376)、施氏假单胞菌(gb1,372,034)、萤光假单胞菌、假单胞菌属物种菌株sd705(wo95/06720和wo96/27002)、威斯康星假单胞菌(p.wisconsinensis)(wo96/12012)的脂肪酶；芽孢杆菌属脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(达图瓦(dartois)等人，(1993)，生物化学与生物物理学报(biochemicaetbiophysicaacta)，1131,253-360)、嗜热脂肪芽抱杆菌(jp64/744992)或短小芽孢杆菌(wo91/16422)。也优选的是来自以下生物体中任一种的脂肪酶：尖镰孢、犁头包蜕膜酶(absidiareflexa)、犁头霉、曼赫根毛霉、德氏根霉(oryzae)、黑曲霉、塔宾曲霉、异孢镰孢、米曲霉、卡门柏青梅、臭曲霉、黑曲霉、米曲霉和疏棉状嗜热丝孢菌，例如，选自在wo2004/099400中的seqidnos:1至15中任一个的脂肪酶。与本发明相关的有用的脂肪酶是与seqidno:2的成熟多肽、示于wo95/22615的seqidno:2的位置1-269处的多肽、或示于wo2008/065060的seqidno:1的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或甚至100％序列一致性的脂肪酶。适合在本发明的方法中使用的商业化的脂肪酶制剂包括lipozymecalbl、lipozyme(r)tl100l和calleratmtrans(都能从诺维信公司(novozymesa/s)获得)。具体地有用的脂肪酶可以选自下组，该组由以下各项组成(a)包含seqidno:1或seqidno:2中阐述的氨基酸序列或由其组成的的多肽；(b)是seqidno:1或2中阐述的氨基酸序列的子序列的多肽；(c)与在(a)和(b)中定义的多肽中的任一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的多肽。在(c)中阐释的脂肪酶可以是在seqidno:1中阐释的氨基酸序列的变体，其中该多肽包含以下取代t231r和n233r。在项目(c)中阐释的脂肪酶可以具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与seqidno:1或2的多肽在多达40个氨基酸上有所不同，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个。该脂肪酶可以是亲本脂肪酶的变体，该变体具有脂肪酶活性并且与seqidno:1具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性，并且在对应于t231r+n233r和seqidno:2的d96e、d111a、d254s、g163k、p256t、g91t、g38a、d27r、和n33q中至少一个或多个(例如，若干个)的位置处包括取代。在另一个实施例中，该脂肪酶是如下变体，该变体具有脂肪酶活性并且与seqidno:1具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性，并且在对应于t231r+n233r和seqidno:2的d96e、d111a、d254s、g163k、p256t、g91t、g38a、d27r、和n33q中至少一个或多个(例如，若干个)的位置处包括取代，这些位置选自下组，该组由以下各项组成：a)d96et231rn233r；b)n33qd96et231rn233r；c)n33qt231rn233rd)n33qd111at231rn233r；e)n33qt231rn233rp256t；f)n33qg38ag91tg163kt231rn233rd254s；g)n33qg38ag91td96ed111ag163kt231rn233rd254sp256t；h)d27rn33qg38ad96ed111ag163kt231rn233rd254sp256t；i)d27rn33qg38ag91td96ed111ag163kt231rn233rp256t；j)d27rn33qg38ag91td96ed111ag163kt231rn233rd254s；k)d27rg38ag91td96ed111ag163kt231rn233rd254sp256t；l)d96et231rn233rd254s；m)t231rn233rd254sp256t；n)g163kt231rn233rd254s；o)d27rn33qg38ag91td96eg163kt231rn233rd254sp256t；p)d27rg91td96ed111ag163kt231rn233rd254sp256t；q)d96eg163kt231rn233rd254s；r)d27rg163kt231rn233rd254s；s)d27rg38ag91td96ed111ag163kt231rn233rd254s；t)d27rg38ag91td96eg163kt231rn233rd254sp256t；u)d27rg38ad96ed111ag163kt231rn233rd254sp256t:v)d27rd96eg163kt231rn233rd254s；w)d27rd96ed111ag163kt231rn233rd254sp256t；x)d27rg38ad96eg163kt231rn233rd254sp256t。例如，在wo2015/049370中提供了这些亲本脂肪酶的有用变体。脂肪酶活性：在本发明的上下文中，可以使用三丁酸酯作为底物将该酯解活性确定为脂肪酶单位(lu)。该方法基于在该酶的作用下三丁酸的水解，并且将在水解过程中维持ph恒定的碱的消耗记录为时间的函数。根据本发明，一个脂肪酶单位(lu)可以被定义为，在标准条件(即在30℃；ph7.0；具有0.1％(w/v)阿拉伯胶作为乳化剂和0.16m三丁酸作为底物)下，每分钟释放1微摩尔的可滴定丁酸的酶量。可替代地，酯解活性可以被确定为长链脂肪酶单位(lclu)，使用底物pnp-palmitate(c:16)，当在ph8.0在30℃下孵育时，该脂肪酶水解该酯键并释放pnp，其中pnp是黄色的并能在405nm处被检测到。磷酸脂肪酶：所述一种或多种酯解酶可以包括具有磷酸脂肪酶活性的多肽，优选地磷酸脂肪酶a1、磷酸脂肪酶a2、磷酸脂肪酶b、磷酸脂肪酶c、磷酸脂肪酶d、溶血-磷酸脂肪酶活性、和/或其任何组合。在本发明的方法中，所述一种或多种酯解酶可以是磷酸脂肪酶，例如，单一磷酸脂肪酶，如a1、a2、b、c、或d；两种或更多种磷酸脂肪酶，如，两种磷酸脂肪酶(包括但不限于，a型和b型两者、a1型和a2型两者、a1型和b型两者、a2型和b型两者、a1型和c型两者、a2型和c型两者)或两种或更多种相同类型的磷酸脂肪酶。所述一种或多种酯解酶可以是具有磷酸脂肪酶活性以及具有酰基转移酶活性的多肽，例如，选自如下这些多肽中的多肽，这些多肽披露于wo2003/100044、wo2004/064537、wo2005/066347、wo2008/019069、wo2009/002480、和wo2009/081094中。例如可以通过在wo2004/064537中描述的测定确定酰基转移酶活性。该磷酸脂肪酶可以选自披露于wo2008/036863和wo20003/2758中的多肽。合适的磷酸脂肪酶制剂是purifine(r)(可以从范恩尼姆公司(verenium)获得)和lecitase(r)ultra(可以从诺维信公司获得)。具有酰基转移酶活性的酶和商业化的酶制剂lysomax(r)oil(可以从丹尼斯克公司(daniscoa/s)获得)一样是可获得的。角质酶：该一种或多种酯解酶可以包括具有角质酶活性的多肽。例如该角质酶可以选自披露于wo2001/92502中的多肽，具体地披露于实例2中的特异腐质霉角质酶变体。优选地，所述一种或多种酯解酶是与之前提到的脂肪酶、磷酸脂肪酶、角质酶、和酰基转移酶中的任一种具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％一致性的酶。在一个实施例中，所述一种或多种酯解酶与wo95/22615的seqidno:2的位置1-269处示出的氨基酸序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少或甚至至少99％一致性。酶源和配制品：在本发明的方法中使用的一种或多种酯解酶可以源自或可获得自在此提到的来源中的任一种。术语“源自”在本上下文中表示酶可以从天然存在所述酶的生物体分离，即酶的氨基酸序列的身份(identity)与天然酶相同。术语“源自”还表示酶可以在宿主生物体中重组产生，其中重组产生的酶具有与天然酶相同的身份，或具有修饰的氨基酸序列，例如，缺失、插入和/或取代一个或多个氨基酸，即，重组产生的酶是天然氨基酸序列的突变体和/或片段。天然酶的意义中包含天然变体。此外，术语“源自”包括通过例如肽合成而合成产生的酶。术语“源自”还包括已经通过例如糖基化、磷酸化等在体内或体外修饰的酶。在这个上下文中的术语“可获得的”意指该酶与天然酶具有相同的氨基酸序列。该术语涵盖已经从生物体分离的酶(在该生物体中，该酶天然地存在，或在该生物体中，该酶在相同类型的或其他类型的生物体中重组地表达)，或通过例如肽合成而合成产生的酶。对于重组产生的酶，该术语“可获得的”和“源自”指酶的身份而不是重组产生酶的宿主生物体的身份。相应地，可以通过使用任何合适的技术从微生物获得所述一种或多种酯解酶。例如，酶制剂可通过发酵合适的微生物和之后通过本领域公知的方法从所得的发酵液或微生物分离酶制剂而获得。该酶还可以通过使用重组dna技术而获得。这种方法通常包括培养用重组dna载体转化的宿主细胞，该载体包含编码所讨论的酶的dna序列，并且dna序列与合适的表达信号可操作地连接，使其能在允许酶表达的条件下在培养基中表达该酶，并从培养物回收该酶。还可将dna序列掺入宿主细胞的基因组中。dna序列可以是基因组、cdna或合成来源，或它们的任何组合，并且可以按照本领域公知的方法分离或合成。该一种或多种酯解酶可以应用于任何合适的配制品中，例如，如冻干粉末或在水性溶液中。序列一致性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施(needleman-wunsch)算法(尼德曼(needleman)和翁施(wunsch)，1970，分子生物学杂志(j.mol.biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性，该算法如emboss软件包(emboss：欧洲分子生物学开放软件套件(theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite)，赖斯(rice)等人，2000，遗传学趋势(trendsgenet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(needle)程序所实施的。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的needle输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性并且是如下计算的：(一致的残基x100)/(比对长度-比对中的空位总数)方法设计本发明提供了，在包含油相/疏水相和亲水相的系统/反应系统中，在水和一种或多种酯解酶存在的情况下，通过将脂肪酸原料与醇反应来生产脂肪酸烷基酯的方法。所述脂肪酸原料(包括任何甘油三脂、甘油二酯、甘油单酯、游离脂肪酸或包含在脂肪酸原料中的其任何组合)与所述醇的反应产生脂肪酸烷基酯/生物柴油和甘油。随着反应进行，脂肪酸烷基酯积累在油相/疏水相中。本发明的诸位发明人已经观察到，在脂肪酸烷基酯/生物柴油通过脂肪酸原料的酶生物转化产生的方法中，即使在没有有效地将油相/疏水相从亲水相分离的情况下进行碱处理，得到的甘油的盐侵意外地低并且该甘油具有足够低含量的盐以便容易地加工成高质量或工业级甘油，例如通过中和或盐化。因此，在根据本发明所述的方法中，在对脂肪酸酯/生物柴油进行任何进一步的加工(例如用碱试剂处理以去除游离脂肪酸)之前，脂肪酸烷基酯/生物柴油是在如下条件下产生的，在该条件下将包含脂肪酸酯/生物柴油的油相/疏水相从亲水相的分离是可以避免的。这提供了大量的显著益处：首先，有可能设计生产脂肪酸并且最终是精制产物(包括生物柴油和甘油)的方法，该方法步骤更少、步骤成本更低、方法时间更短并具有更高的容量。还有，因为相分离发生在碱处理之后，有可能使用升高的温度，该温度能使这些相更快的分离。本发明的诸位发明人也发现了，在碱处理之后，根据本发明所述的方法产生脂肪酸烷基酯/生物柴油相或组合物，该脂肪酸烷基酯/生物柴油相或组合物具有降低的含量的游离脂肪酸的皂或盐，这使得随后的后续洗涤步骤成本更低。最后，由于非常少的脂肪酸烷基酯陷在皂乳剂中并且没有脂肪酸烷基酯陷在酶乳剂相中，根据本发明所述的方法给出更高的产率。在本发明的一个主要的方面，在所述醇/所述疏水相的存在下，通过用一种或多种碱试剂处理，可以实现在油相/疏水相中的皂/盐游离脂肪酸的形成。因此，该方法包含，在允许游离脂肪酸的皂/盐形成的条件下，将脂肪酸烷基酯、游离脂肪酸、水、醇和甘油以及一种或多种酯解酶与一种或多种碱试剂接触。根据这一方面，本发明提供了用于生产脂肪酸烷基酯的方法，该方法包含i)在包含油相/疏水相和亲水相的反应系统中，在水和一种或多种酯解酶存在的情况下，将脂肪酸原料与醇反应来生产脂肪酸烷基酯和甘油；和j)在将油相/疏水相从亲水相分离之前，通过用一种或多种碱试剂进行处理，去除或降低游离脂肪酸的量以形成游离脂肪酸的皂/盐；例如当在所述反应系统中仍有油相/疏水相和亲水相时。根据本发明所述的方法可进一步包括i)提供系统，例如反应系统，该反应系统包含所述油相/疏水相和所述亲水相，ii)在水和一种或多种酯解酶存在的情况下，将存在于所述油相/疏水相中的脂肪酸原料与醇反应以产生所述脂肪酸烷基酯、游离脂肪酸和甘油。根据一些实施例，该方法包括将在步骤ii)中产生的所述游离脂肪酸的皂/盐与脂肪酸酯和一种或多种酯解酶分离，例如通过将脂肪酸烷基酯与包含所述皂/盐的亲水相和该一种或多种酯解酶分离。相应地，本发明提供生产脂肪酸烷基酯的方法，该方法包括i)提供系统，例如反应系统，该反应系统包含油相/疏水相和亲水相，ii)在水和一种或多种酯解酶存在的情况下，将存在于所述油相/疏水相中的脂肪酸原料与醇反应以产生所述脂肪酸烷基酯；iii)将在所述油相/疏水相中的游离脂肪酸与一种或多种碱试剂反应；和iv)将所述脂肪酸烷基酯与所述亲水相分离在另外的实施例中，根据本发明所述的方法包括i)提供反应系统，该反应系统具有包含脂肪酸原料的油相/疏水相，和包含醇、水和一种或多种酯解酶的亲水相；ii)在所述水和所述一种或多种酯解酶存在的情况下，将脂肪酸原料与醇反应以产生游离脂肪酸、甘油、和脂肪酸烷基酯；iii)添加一种或多种碱试剂到该反应系统中以允许在步骤ii)中产生的游离脂肪酸的皂/盐的形成；并且iv)将脂肪酸烷基酯与脂肪酸的皂/盐和一种或多种酯解酶分离。在本发明的方法中使用的一种或多种酯解酶可以具体地选自脂肪酶、磷酸脂肪酶、角质酶及其混合物。具体地优选的是，所述一种或多种酯解酶中至少一种是脂肪酶，并且任选地，一种或多种脂肪酶与一种或多种磷酸脂肪酶和/或一种或多种角质酶组合使用。如技术人员将理解的那样，当该脂肪酸原料包含以磷酸酯的形式出现的杂质时，将磷酸脂肪酶与其他酯解酶(例如脂肪酶和角质酶)组合使用是有意义的。一种或多种脂肪酶与一种或多种磷酸脂肪酶的组合使用导致组合的酯交换和磷酸酯的降低(脱胶)并且因此产生磷减少的脂肪酸烷基酯。这种产生磷减少的脂肪酸烷基酯的方法披露于wo2006/133698中，该方法包括，将醇、包含甘油三脂和/或脂肪酸的底物与一种或多种酯解酶(包括脂肪酶、角质酶和乙酰转移酶)，和一种或多种磷酸脂肪酶和水混合，将wo2006/133698的内容通过引用以其全文结合在此。为了使酶量(该酶在碱处理中失去)最小化，本发明的诸位发明人还能够减少在生产脂肪酸烷基酯的方法中使用的酶量。因此，所述一种或多种酯解酶的量优选地在100至500个酶单位/g油相/疏水相的范围内，例如在100至490个酶单位/g油相/疏水相、100至480个酶单位/g油相/疏水相、100至475个酶单位/g油相/疏水相、100至450个酶单位/g油相/疏水相、100至425个酶单位/g油相/疏水相、100至400个酶单位/g油相/疏水相、100至375个酶单位/g油相/疏水相、100至350个酶单位/g油相/疏水相、100至325个酶单位/g油相/疏水相、100至300个酶单位/g油相/疏水相、150至500个酶单位/g油相/疏水相、150至490个酶单位/g油相/疏水相、150至480个酶单位/g油相/疏水相、150至475个酶单位/g油相/疏水相、150至450个酶单位/g油相/疏水相、150至425个酶单位/g油相/疏水相、150至400个酶单位/g油相/疏水相、150至375个酶单位/g油相/疏水相、150至350个酶单位/g油相/疏水相、150至325个酶单位/g油相/疏水相、150至300个酶单位/g油相/疏水相、200至490个酶单位/g油相/疏水相、200至480个酶单位/g油相/疏水相、200至475个酶单位/g油相/疏水相、200至450个酶单位/g油相/疏水相、200至425个酶单位/g油相/疏水相、200至400个酶单位/g油相/疏水相、200至375个酶单位/g油相/疏水相、200至350个酶单位/g油相/疏水相、200至325个酶单位/g油相/疏水相、或例如200至300个酶单位/g油相/疏水相范围内。相应地，本发明的方法可以包括i)提供包含油相/疏水相和亲水相的系统，和ii)在水和一种或多种酯解酶存在的情况下，将存在于所述油相/疏水相中的脂肪酸原料与与醇反应；其中，所述一种或多种酯解酶的总量在100至500个酶单位/g油相/疏水相的范围内，例如在100至490个酶单位/g油相/疏水相、100至480个酶单位/g油相/疏水相、100至475个酶单位/g油相/疏水相、100至450个酶单位/g油相/疏水相、100至425个酶单位/g油相/疏水相、100至400个酶单位/g油相/疏水相、100至375个酶单位/g油相/疏水相、100至350个酶单位/g油相/疏水相、100至325个酶单位/g油相/疏水相、100至300个酶单位/g油相/疏水相、150至500个酶单位/g油相/疏水相、150至490个酶单位/g油相/疏水相、150至480个酶单位/g油相/疏水相、150至475个酶单位/g油相/疏水相、150至450个酶单位/g油相/疏水相、150至425个酶单位/g油相/疏水相、150至400个酶单位/g油相/疏水相、150至375个酶单位/g油相/疏水相、150至350个酶单位/g油相/疏水相、150至325个酶单位/g油相/疏水相、150至300个酶单位/g油相/疏水相、200至490个酶单位/g油相/疏水相、200至480个酶单位/g油相/疏水相、200至475个酶单位/g油相/疏水相、200至450个酶单位/g油相/疏水相、200至425个酶单位/g油相/疏水相、200至400个酶单位/g油相/疏水相、200至375个酶单位/g油相/疏水相、200至350个酶单位/g油相/疏水相、200至325个酶单位/g油相/疏水相、或例如200至300个酶单位/g油相/疏水相范围内。根据本发明的一些实施例，其中所述一种或多种酯解酶选自脂肪酶，例如在seqidno:1中阐述的脂肪酶，应被理解的是以脂肪酶单位提供酶的量。因此，当优选脂肪酶时，酯解酶的量优选地在100至500个脂肪酶单位/g油相/疏水相的范围内，例如在100至490个脂肪酶单位/g油相/疏水相、100至480个脂肪酶单位/g油相/疏水相、100至475个脂肪酶单位/g油相/疏水相、100至450个脂肪酶单位/g油相/疏水相、100至425个脂肪酶单位/g油相/疏水相、100至400个脂肪酶单位/g油相/疏水相、100至375个脂肪酶单位/g油相/疏水相、100至350个脂肪酶单位/g油相/疏水相、100至325个脂肪酶单位/g油相/疏水相、100至300个脂肪酶单位/g油相/疏水相、150至500个脂肪酶单位/g油相/疏水相、150至490个脂肪酶单位/g油相/疏水相、150至480个脂肪酶单位/g油相/疏水相、150至475个脂肪酶单位/g油相/疏水相、150至450个脂肪酶单位/g油相/疏水相、150至425个脂肪酶单位/g油相/疏水相、150至400个脂肪酶单位/g油相/疏水相、150至375个脂肪酶单位/g油相/疏水相、150至350个脂肪酶单位/g油相/疏水相、150至325个脂肪酶单位/g油相/疏水相、150至300个脂肪酶单位/g油相/疏水相、200至490个脂肪酶单位/g油相/疏水相、200至480个脂肪酶单位/g油相/疏水相、200至475个脂肪酶单位/g油相/疏水相、200至450个脂肪酶单位/g油相/疏水相、200至425个脂肪酶单位/g油相/疏水相、200至400个脂肪酶单位/g油相/疏水相、200至375个脂肪酶单位/g油相/疏水相、200至350个脂肪酶单位/g油相/疏水相、200至325个脂肪酶单位/g油相/疏水相、或例如200至300个脂肪酶单位/g油相/疏水相范围内。根据本发明的其他实施例，其中所述一种或多种酯解酶选自脂肪酶，例如在seqidno:2和子序列中阐述的该脂肪酶和如在上文披露的其变体，以长链脂肪酶单位(lclu)提供酶的量。在此类实施例中，酯解酶的量优选地在100至500个脂肪酶单位/g油相/疏水相的范围内，例如在100至490lclu/g油相/疏水相、100至480lclu/g油相/疏水相、100至475lclu/g油相/疏水相、100至450lclu/g油相/疏水相、100至425lclu/g油相/疏水相、100至400lclu/g油相/疏水相、100至375lclu/g油相/疏水相、100至350lclu/g油相/疏水相、100至325lclu/g油相/疏水相、100至300lclu/g油相/疏水相、150至500lclu/g油相/疏水相、150至490lclu/g油相/疏水相、150至480lclu/g油相/疏水相、150至475lclu/g油相/疏水相、150至450lclu/g油相/疏水相、150至425lclu/g油相/疏水相、150至400lclu/g油相/疏水相、150至375lclu/g油相/疏水相、150至350lclu/g油相/疏水相、150至325lclu/g油相/疏水相、150至300lclu/g油相/疏水相、200至490lclu/g油相/疏水相、200至480lclu/g油相/疏水相、200至475lclu/g油相/疏水相、200至450lclu/g油相/疏水相、200至425lclu/g油相/疏水相、200至400lclu/g油相/疏水相、200至375lclu/g油相/疏水相、200至350lclu/g油相/疏水相、200至325lclu/g油相/疏水相、或例如200至300lclu/g油相/疏水相范围内。在本发明的另一个实施例中，所述一种或多种酯解酶的量优选地在0.005-5g酶蛋白质(ep)/kg油相/疏水相或脂肪酸原料范围内，例如在0.005-2.5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-1gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.75gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.25gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.1gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.075gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.05gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.025gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.01gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.01-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.02-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.03-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.04-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.05-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.06-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.07-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.08-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.09-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.1-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.2-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.3-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.4-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.5-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.6-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.7-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.8-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.9-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、1-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、2-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、3-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、4-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.01-4gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.02-3gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.03-2gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.04-1gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.05-0.9gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.06-0.8gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.07-0.7gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.08-0.6gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.09-0.5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.1-0.4gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.1-0.3gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料范围内，或例如在0.1-0.25gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料范围内。在本发明的上述方面的一些实施例中，将所述脂肪酸原料或任何甘油三脂、甘油二酯、甘油单酯、游离脂肪酸或包含在其中的任何其组合，与所述醇反应，以至于该油相/疏水相包含脂肪酸烷基酯和游离脂肪酸或基本上由其组成。本发明的方法优选地包含，将脂肪酸原料与所述醇反应，直到至少60％(w/w)(例如至少65％(w/w)、至少70％(w/w)、至少75％(w/w)、至少80％(w/w)、至少85％(w/w)、至少90％(w/w)，或例如至少95％(w/w))的脂肪酸乙酰基团和/或在所述脂肪酸原料中的游离脂肪酸已经被转换成脂肪酸烷基酯。在本发明的具体的实施例中，水的量对应于0.5％至5.0％(w/w)的所述油相/疏水相，例如0.5％至4.0％(w/w)的所述油相/疏水相，0.5％至3.75％、0.5％至3.5％、0.5％至3.25％、0.5％至3.0％、0.5％至2.75％、0.5％至2.5％、0.5％至2.25％、0.5％至2.0％、0.5％至1.9％、0.5％至1.8.％、0.5％至1.75％、0.75％至2.0％、0.75％至1.8％、0.75％至1.75％、0.75％至1.5％、1.0％至2.0％、1.0％至1.9％、1.0％至1.8％、或例如1.0％至1.5％(w/w)的所述油相/疏水相。如技术人员将理解的那样，在该方法中分别添加水的需求取决于在脂肪酸原料中水的量。在另外的实施例中，该方法包括，通过脂肪酸原料的反应和任选地通过甘油的另外的添加，将在所述亲水相中的甘油的量增加至2％(w/w)至30％(w/w)，优选地从2％(w/w)至20％(w/w)，例如相对于该油相/疏水相从2％(w/w)至20％(w/w)。仍然在另外的实施例中，添加该醇以达到如下量，该量相对于该油相/疏水相在12％(w/w)至34％(w/w)的范围内，例如相对于该油相/疏水相在17％(w/w)至34％(w/w)的范围内，或例如相对于该油相/疏水相在12％(w/w)至24％(w/w)的范围内。当该醇是甲醇时，优选相对于该油相/疏水相范围为12％(w/w)至24％(w/w)，但是当该醇是乙醇时，优选相对于该油相/疏水相范围为17％(w/w)至34％(w/w)。可以将该脂肪酸原料与所述醇在如下温度下反应，该温度在32℃至45℃范围内，优选地在32℃至40℃范围内。如技术人员将理解的那样，温度上限取决于在该方法中采用的一种或多种酯解酶的亲热性。本发明的方法可以包括，将所述脂肪酸原料与所述醇反应持续16-50小时，例如持续24-50小时，例如持续30-50小时、持续30-45小时、持续35-50小时、持续35-45小时、持续38-42小时，优选地持续35-40小时。如技术人员将理解的那样，本发明的方法能以分批模式或以连续模式进行。在连续模式方法中，这两个相，该油相/疏水相和该亲水相，可以分别逆流处理。小杉町(kosugi)等人(1990)，生物技术与生物工程(biotechnology&bioengineering)，第36卷，617-622，描述了通过固定化脂肪酶来水解植物油的连续的逆流方法。在该方法中使用的醇可以是c1-c5醇，优选乙醇或甲醇。目前甲醇是最优选的。可以滴加和/或连续地添加所述醇。能以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个步骤滴加该醇。将被理解的是，在本发明的方法中使用的所述一种或多种酯解酶中至少一种可以是液体酶。具体地，所述一种或多种酯解酶可以选自脂肪酶、磷酸脂肪酶、角质酶及其混合物。根据一些实施例，优选的是，所述一种或多种酯解酶是一种或多种脂肪酶。根据其他实施例，使用脂肪酶和磷酸脂肪酶的混合物。如果要求对脂肪酸原料脱胶，这种组合可以是具体地优选的。具体地，该脂肪酸原料可以源自以下各项中的一种或多种：海藻油、卡诺拉油(canolaoil)、椰子油(coconutoil)、蓖麻油、椰子油(coconutoil)、椰子干油(copraoil)、玉米油(cornoil)、酒糟玉米油(cornoil)、玉米油(cornoil)游离脂肪酸馏出物、棉花籽油、亚麻油、鱼油、葡萄籽油、大麻油、麻风果油、荷荷巴油、芥子油、卡诺拉油(canolaoil)、棕榈油、棕榈硬脂、棕榈油精、棕榈仁油、花生油、菜籽油、米糠油、红花油、大豆油、向日葵油、妥尔油、来自盐生植物和/或动物脂肪的油(包括来自猪、牛和羊的油脂，猪油，鸡脂肪，鱼油，棕榈油游离脂肪酸馏出物，大豆油游离脂肪酸馏出物，皂原料脂肪酸材料，黄色油脂，和棕色油脂或其任何组合)。根据其他实施例，该脂肪酸原料可以选自下组，该组由以下各项组成：海藻油、蓖麻油、椰子油(椰子干油)、玉米油、棉花籽油、亚麻油、鱼油、葡萄籽油、大麻油、麻风果油、荷荷巴油、芥子油、卡诺拉油、棕榈油、棕榈硬脂、棕榈油精、棕榈仁油、花生油、菜籽油、米糠油、红花油、大豆油、向日葵油、妥尔油、和来自盐生植物的油、或其任何组合。该脂肪酸原料可以选自下组，该组由以下各项组成：动物脂肪，包括来自猪、牛和羊的油脂，猪油，鸡脂肪，鱼油，或其任何组合。该脂肪酸原料可以是粗的、精制的、漂白的、除臭的、脱胶的、或其任何组合。食品质量的油和脂肪是昂贵的，并且因此来自它们的加工的废物和副产品以及非食品级的油和脂肪已经成为对于脂肪酸烷基酯而言具有日益增加的吸引力的原料。皂原料是在炼油厂中获得的油的级分，通过用碱处理该油来将游离脂肪酸转换到皂(例如，钠皂)上。除了这些皂之外，该皂原料通常还包括甘油酯的级分。酸性油是来自炼油厂的副产品，是通过将皂原料酸化来使这些皂溶解而产生的。酸性油主要包含游离脂肪酸(ffa)和酰基甘油。馏出物(如棕榈脂肪酸馏出物(pfad))是油精炼的副产品，来自用于将游离脂肪酸从该油中消除的蒸馏方法。该原料可以是油或脂肪精炼的中间产品、废品或副产品，该原料选自下组，该组由以下各项组成：皂原料；酸性油；脂肪酸馏出物，例如pfad、大豆脂肪酸馏出物、菜籽脂肪酸馏出物、米糠脂肪酸馏出物、家禽脂肪酸馏出物、牛油脂脂肪酸馏出物，等；来自脱胶的树胶；来自鱼油ω-3脂肪酸衍生物的产生的副产品；脂肪陷阱油脂(fattrapgrease)；黄色油脂、和棕色油脂、游离脂肪酸(如油酸)；或通过物理分离获得的油的级分；或其任何组合。在实施例中，使用高剪切混合器或空化器将在该系统中的溶液相(例如该油相/疏水相和该亲水相)进行混合。在其他的实施例中，在添加所述一种或多种酯解酶之前，将碱试剂或碱，例如naoh和/或koh，添加到所述系统中。具体地，以对应于200ppm或更少的量，优选地以在10-100ppm范围内的量，添加碱试剂或碱。在该方法中在这个阶段添加碱试剂或碱的主要目的是中和在该油中的痕量的矿物质酸。在另外的实施例中，所述油相/疏水相包含脂肪酸烷基酯、游离脂肪酸和任选地未反应的脂肪酸原料；并且所述亲水相包含甘油、醇、水和所述一种或多种酯解酶。在另外的实施例中，所述亲水相构成从5％至50％、10％至50％、20％至50％、20％至45％、或甚至20％至40％的该反应系统(反应物混合物)(w/w)，并且甘油构成30％至85％(w/w)、40％至85％(w/w)、45％至85％(w/w)、50％至85％(w/w)或甚至60％至80％(w/w)的该亲水相。在其他实施例中，甘油构成30％至70％(w/w)、35％至70％(w/w)、40％至70％(w/w)或甚至45％至70％(w/w)的该亲水相。随着该方法进行，在该甘油-水相中，甘油的量可以增加至超过理想水平。因此，将该亲水相的部分与包含脂肪酸烷基酯的油相/疏水相分离可以是有优势的，并且例如在本发明的方法中再使用该分离的部分。如技术人员将认识到的那样，为了再使用这些酶，可以通过滗水器、凝结器、旋风分离器或涡流分离器、沉降器或通过离心将该亲水相的部分与该脂肪相分离。再使用该亲水相的该部分提供了另外的优势，因为这也将导致这些酯解酶中的至少部分的再循环。当把该亲水相该部分返回到该反应器中时，可以添加新鲜液体脂肪酶以将脂肪酶活性维持在理想水平并且可以添加醇(例如甲醇)。因此，在一些实施例中，根据本发明所述的方法包括i)在所述脂肪酸原料与所述醇的反应过程中或当所述反应已经终止时，将所述甘油/所述亲水相的至少一部分从该系统去除；和ii)在如以上权利要求任一项中所定义的方法中，将该方法与另外的脂肪酸原料组合，其中该方法与该甘油/所述亲水相去除的该方法是相同的或不同的。根据一些实施例，去除30％至80％(w/w)的所述甘油/所述亲水相，例如30％至70％(w/w)、例如40％至60％(w/w)或45％至55％(w/w)的所述甘油/所述亲水相。仍然在另外的实施例中，将所述油相/疏水相和所述亲水相经受碱处理以形成所述游离脂肪酸的皂/盐。在根据本发明所述的方法中，优选的是，促进包含ffa的皂原料级分的分离，在该处理之前，用碱试剂或碱(优选地naoh或koh或其混合物)处理发生时该油相和亲水相很少分离或没有分离。因此，在本发明的这些实施例中，油相/疏水相和所述亲水相都经受碱处理以形成存在于油相/疏水相中的游离脂肪酸的至少一部分的皂/脂肪酸盐。然而，这不排除，在用碱试剂处理前，亲水相降低，例如当为了与如上披露的另外的脂肪酸原料组合，去除该甘油/该亲水相的部分时。具体地，在用碱试剂处理前，该亲水相可以降低30％至80％(w/w)，例如降低30％至70％(w/w)、例如降低40％至60％(w/w)或降低45％至55％(w/w)。可以将该碱试剂/碱作为在水中的1-6n溶液添加，例如2-9n溶液、3-9n溶液、4-9n溶液、5-9n溶液、6-9n溶液、7-9n溶液、8-9n溶液，例如3-6n溶液、4-6n溶液或5-6n溶液。在一些实施例中，优选6-9n溶液，因为这将非常少的另外的水引入该系统。在一些实施例中，所述碱的量在游离脂肪酸的量的1.0-2.0摩尔当量范围内，例如在游离脂肪酸的量的1.05-1,30摩尔当量或例如1.05-1.25摩尔当量的范围内。可以在如下温度下进行碱处理，该温度在35℃至85℃范围内，例如在35℃至80℃、例如35℃至75℃、35℃至70℃、35℃至60℃、35℃至50℃、35℃至45℃、35℃至40℃、40℃至80℃、例如40℃至75℃、40℃至70℃、40℃至60℃、40℃至50℃、40℃至45℃、45℃至80℃、例如45℃至75℃、45℃至70℃、45℃至60℃、或例如45℃至50℃范围内。一般来说，在尽可能低的温度下或远低于使用的醇的沸点下操作是有优势的，例如在35℃至45℃时，不需要或只需要很少的另外的加热。因此，优选地在如下温度下进行碱处理，该温度在35℃至45℃范围内，例如在36℃至45℃范围内，例如在37℃至45℃、38℃至45℃、39℃至45℃或40℃至45℃范围内。技术人员将理解的是，该温度上限主要通过醇的沸点来进行定义，并进一步取决于存在于该系统中的醇的量和安装在该生产装置上的洗涤系统的效率。所述碱处理的持续时间可以是从5分钟至2小时，例如从7分钟至2小时、10分钟至2小时、15分钟至2小时、30分钟至2小时、例如从30分钟至1,5小时或例如从30分钟至1小时。具体地，当操作连续的系统时，熟练的短的持续时间，例如几分钟，是可能的。在本发明的另外的实施例中，将所述碱试剂/碱作为非水性溶液添加。具体地，将该碱试剂/碱溶解在醇(例如甲醇)中。根据其他的实施例，所述碱试剂是甲醇钠或甲醇钾或这两者的混合物。根据本发明所述的方法可以进一步包括如下步骤，在该步骤中将所述脂肪酸烷基酯与所述皂/脂肪酸盐分离。当在根据本发明所述的方法中进行时脂肪酸烷基酯与该皂/脂肪酸盐的分离是具体地有效的。这主要是因为，在对脂肪酸酯/生物柴油进行任何进一步的加工(例如用碱试剂处理以去除游离脂肪酸)之前，将包含脂肪酸酯/生物柴油的油相/疏水相从亲水相的分离是可以避免的。结果，将烷基酯相从甘油/皂相分离是快速的并且没有形成或很少形成包含脂肪酸酯/生物柴油、甘油和酶的第三种酶乳剂相，并且在该方法中很少失去产物(脂肪酸酯/生物柴油)。根据本发明的一些实施例，通过使用大量的或大体积的甘油可以提供另外的优势，这在将皂/脂肪酸盐从脂肪酸酯/生物柴油中萃取出来中是有效的。可以通过重力沉降、倾析和/或离心将该脂肪酸烷基酯从所述皂/脂肪酸盐中分离。在本发明的一些实施例中，在如下条件下并使用如下量的碱试剂进行用所述一种或多种碱试剂进行的处理，这些条件和碱试剂的量允许在油相/疏水相中的所述游离脂肪酸的量减少到少于2％(w/w)，例如少于1.5％(w/w)、少于1％(w/w)、少于0.75％(w/w)、少于0,5％(w/w)、或例如少于0.25％(w/w)。根据本发明的另外的实施例，该方法包括将包含脂肪酰基酯的组合物与所述皂/脂肪酰基盐分离，其中在所述组合物中的游离脂肪酸的含量低于2％(w/w)，例如低于1.5％(w/w)、低于1％(w/w)、低于0.75％(w/w)、低于0,5％(w/w)、或例如低于0.25％(w/w)和/或在所述组合物中甘油酯(优选地表达为“结合甘油”；即，结合在甘油酯中的甘油)的含量低于2％(w/w)，例如低于1.5％(w/w)、低于1％(w/w)、低于0.75％(w/w)、低于0,5％(w/w)、或例如低于0.23％(w/w)。优选地，该方法包括将包含脂肪酰基酯的组合物与所述皂/脂肪酰基盐分离，其中在所述组合物中的游离脂肪酸的含量低于0.25％(w/w)和/或在所述组合物中甘油酯(优选地表达为“结合甘油”；即，结合在甘油酯中的甘油)的含量低于0.23％(w/w)。因此，根据这些实施例，本发明的产品优选地是不需要另外的精炼的、满足生物柴油指定要求的产品。在另外的实施例中，根据本发明所述的方法包括将油相/疏水相与亲水相分离以提供如下组合物，该组合物包含至少90％(w/w)脂肪酸烷基酯、从300至400ppm皂、少于0.25％(w/w)游离脂肪酸和少于0.23％(w/w)甘油酯(优选地表达为“结合甘油”；即，结合在甘油酯中的甘油)。可以将所述皂/脂肪酸盐经受酸化以产生游离脂肪酸，例如通过将该皂/脂肪酸盐与hcl、h3po4和/或h2so4接触。目前，h2so4和也可能的h3po4是优选的，因为得到的盐容易沉淀，并且因此可以容易地从该甘油分离以提供有价值的高等级/工业级甘油产品。根据本发明所述的方法的示意图，该示意图包含工业级甘油的产生，该产生示于图1中。如技术人员将理解的那样，通过所述皂/脂肪酸盐的酸化产生的游离脂肪酸，可以在如上披露的根据本发明所述的方法中用作脂肪酸原料。通过所述皂/脂肪酸盐的酸化产生的游离脂肪酸的量可以在0.5％至3％(w/w)的所述原料的范围内，例如从1％至2％(w/w)的所述原料的范围内。在具体的实施例中，根据本发明的任一项所述的方法包括如下步骤i)提供包含油相/疏水相和亲水相的反应系统；例如如下反应系统，其中该油相/疏水相包含脂肪酸原料(该脂肪酸原料含有游离的和/或甘油酯结合的脂肪酸)，并且该亲水相包含水、一种或多种酯解酶、和任选地甘油；ii)将醇，例如c1-c5醇，优选地乙醇或甲醇，滴加或连续地添加至所述反应系统以达到如下量，该量相对于该油相/疏水相在14％至24％(w/w)的范围内；iii)将该脂肪酸原料和该一种或多种酯解酶经受如下条件，这些条件允许所述游离和/或甘油酯结合的脂肪酸的酯交换以提供包含脂肪酸烷基酯的组合物；iv)将所述组合物与碱试剂/碱在如下条件下接触，这些条件允许从在该组合物中的残余的游离脂肪酸形成脂肪酸盐/皂；并且v)将该脂肪酸烷基酯与脂肪酸盐/皂分离。在另外的实施例中，根据本发明所述的方法包括i)提供包含所述油相/疏水相和所述亲水相的系统，ii)在水和一种或多种酯解酶存在的情况下，将存在于所述油相/疏水相中的脂肪酸原料与醇反应以产生所述脂肪酸烷基酯和所述游离脂肪酸。iii)将该油相/疏水相和亲水相经受碱处理以形成存在于该油相/疏水相中的游离脂肪酸的皂/脂肪酸盐iv)将脂肪酸烷基酯与包含所述皂/脂肪酸盐的亲水相分离v)将所述亲水相经受酸化，例如通过添加h2so4或h3po4。具体地，可以将所述皂/脂肪酸盐进行中和/经受酸化，例如通过添加h2so4或h3po4，以形成盐，例如na2so4或k2so4，该盐沉淀在甘油中。在另外的步骤中，该方法优选地包含将沉淀的盐从该甘油分离，例如通过过滤。为了提供高等级或工业级甘油，该方法可以进一步包含干燥所述甘油，以从该甘油中去除例如水和醇，例如甲醇。具体地，可以纯化该甘油，例如通过干燥和/或去除醇，和/或通过过滤以产生如下组合物，其中在该组合物中，甘油的含量高于95％(w/w)，例如高于97％(w/w)、高于97.5％(w/w)、高于98％(w/w)、高于98.5％(w/w)、高于99％(w/w)、高于99.5％(w/w)、高于99.75％(w/w)、高于99.8％(w/w)或高于99.9％(w/w)。另外地，根据这些实施例，可以在相对于该油相/疏水相对应于2％至30％(w/w)或10％至12％(w/w)的甘油的量、相对于该油相/疏水相对应于1.5％至5.0％(w/w)或1.5％至2.0％(w/w)的水的量和相对于该油相/疏水相在14％至24％(w/w)范围内的醇(例如甲醇)的量存在下，将所述脂肪酸原料与醇反应。可以经1至30小时时间段添加该醇，例如经1至20小时时间段，例如16小时时间段。在某些具体的实施例中，所述脂肪酸原料包含玉米油或者酒糟玉米油或主要由其组成。在另外的方面，本发明提供制造脂肪酸烷基酯的方法，该方法包括将脂肪酸原料与酯解酶接触；该酯解酶选自下组，该组由以下各项组成(a)包含在seqidno:2中阐述的氨基酸序列或由其组成的多肽；(b)是seqidno:2中阐述的氨基酸序列的子序列的多肽；(c)与在(a)和(b)中定义的多肽中的任一种具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列一致性的多肽。在项目(c)中阐释的脂肪酶可以具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与seqidno:2的多肽在多达40个氨基酸上有所不同，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个。该脂肪酶可以是亲本脂肪酶的变体，该变体具有脂肪酶活性并且与seqidno:1具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性，并且在对应于t231r+n233r和seqidno:2的d96e、d111a、d254s、g163k、p256t、g91t、g38a、d27r、和n33q中至少一个或多个(例如，若干个)的位置处包括取代。在另一个实施例中，该脂肪酶是如下变体，该变体具有脂肪酶活性并且与seqidno:1具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性，并且在对应于t231r+n233r和seqidno:2的d96e、d111a、d254s、g163k、p256t、g91t、g38a、d27r、和n33q中至少一个或多个(例如，若干个)的位置处包括取代，这些位置选自下组，该组由以下各项组成：a)d96et231rn233r；b)n33qd96et231rn233r；c)n33qt231rn233r；d)n33qd111at231rn233r；e)n33qt231rn233rp256t；f)n33qg38ag91tg163kt231rn233rd254s；g)n33qg38ag91td96ed111ag163kt231rn233rd254sp256t；h)d27rn33qg38ad96ed111ag163kt231rn233rd254sp256t；i)d27rn33qg38ag91td96ed111ag163kt231rn233rp256t；j)d27rn33qg38ag91td96ed111ag163kt231rn233rd254s；k)d27rg38ag91td96ed111ag163kt231rn233rd254sp256t；l)d96et231rn233rd254s；m)t231rn233rd254sp256t；n)g163kt231rn233rd254s；o)d27rn33qg38ag91td96eg163kt231rn233rd254sp256t；p)d27rg91td96ed111ag163kt231rn233rd254sp256t；q)d96eg163kt231rn233rd254s；r)d27rg163kt231rn233rd254s；s)d27rg38ag91td96ed111ag163kt231rn233rd254s；t)d27rg38ag91td96eg163kt231rn233rd254sp256t；u)d27rg38ad96ed111ag163kt231rn233rd254sp256t；v)d27rd96eg163kt231rn233rd254s；w)d27rd96ed111ag163kt231rn233rd254sp256t；x)d27rg38ad96eg163kt231rn233rd254sp256t。在具体的实施例中，该方法包括将所述脂肪酸原料与如下量的脂肪酶接触，该量优选地在0.005-5g酶蛋白(ep)/kg脂肪酸原料的范围内，例如在0.005-2.5gep/kg脂肪酸原料、0.005-1gep/kg脂肪酸原料、0.005-0.75gep/kg脂肪酸原料、0.005-0.5gep/kg脂肪酸原料、0.005-0.25gep/kg脂肪酸原料、0.005-0.1gep/kg脂肪酸原料、0.005-0.075gep/kg脂肪酸原料、0.005-0.05gep/kg脂肪酸原料、0.005-0.025gep/kg脂肪酸原料、0.005-0.01gep/kg脂肪酸原料、0.01-5gep/kg脂肪酸原料、0.02-5gep/kg脂肪酸原料、0.03-5gep/kg脂肪酸原料、0.04-5gep/kg脂肪酸原料、0.05-5gep/kg脂肪酸原料、0.06-5gep/kg脂肪酸原料、0.07-5gep/kg脂肪酸原料、0.08-5gep/kg脂肪酸原料、0.09-5gep/kg脂肪酸原料、0.1-5gep/kg脂肪酸原料、0.2-5gep/kg脂肪酸原料、0.3-5gep/kg脂肪酸原料、0.4-5gep/kg脂肪酸原料、0.5-5gep/kg脂肪酸原料、0.6-5gep/kg脂肪酸原料、0.7-5gep/kg脂肪酸原料、0.8-5gep/kg脂肪酸原料、0.9-5gep/kg脂肪酸原料、1-5gep/kg脂肪酸原料、2-5gep/kg脂肪酸原料、3-5gep/kg脂肪酸原料、4-5gep/kg脂肪酸原料、0.01-4gep/kg脂肪酸原料、0.02-3gep/kg脂肪酸原料、0.03-2gep/kg脂肪酸原料、0.04-1gep/kg脂肪酸原料、0.05-0.9gep/kg脂肪酸原料、0.06-0.8gep/kg脂肪酸原料、0.07-0.7gep/kg脂肪酸原料、0.08-0.6gep/kg脂肪酸原料、0.09-0.5gep/kg脂肪酸原料、0.1-0.4gep/kg脂肪酸原料、0.1-0.3gep/kg脂肪酸原料、或例如0.1-0.25gep/kg脂肪酸原料的范围内。脂肪酸烷基酯组合物及其用途脂肪酸烷基酯用于广泛范围的产品中并作为合成中间体使用。他们的工业化应用中的一些包括用作润滑剂、塑化剂、防锈剂、钻井和切削油、和用于合成超级酰胺和脂肪醇的起始材料。某些本发明的实施例具体地涉及燃料。由于与石油基燃料在十六烷数目、能含量、粘度和相变上的相似性，短链醇的脂肪酸烷基酯是无毒的、可生物降解的并且是石油基燃料极好的全部或部分的替代。本发明的另一方面关于如下组合物，该组合物包含至少90％(w/w)脂肪酸烷基酯、从300至400ppm皂、少于0.25％(w/w)游离脂肪酸和少于0.23％(w/w)甘油酯(优选地表达为“结合甘油”；即，结合在甘油酯中的甘油)。在游离脂肪酸和甘油酯方面，该产品满足生物柴油的指定要求。例如这些规格要求是由astm国际(astminternational)(针对生物柴油的规格(specificationforbiodiesel)(b100)-astm6751)(在http://www.astm.org/standards/可得到)提供的。与在来自之前已知的方法的产品中的皂含量相比，皂的含量低5-10x；通过过滤可以将该含量去除或降低至可接受的水平。具体地，所述组合物可以是通过以上披露的程序可获得的组合物。在一些实施例中，根据本发明的组合物通过如下方法是可获得的，其中所述脂肪酸原料包含玉米油或主要由其组成，并且所述碱试剂是koh。诸位发明人意外地发现，当使用玉米油(cornoil)作为原料时，该方法提供如下产品，该产品典型地不需要进一步加工或纯化，并且几乎是无色。在其他方面，根据本发明所述的组合物可以潜在地通过本领域已知的方法(例如蒸馏(包括快速蒸发、气提、和除臭)；相分离；萃取；和干燥))进行精炼或纯化。这种精炼的目的可以是从该组合物中去除或回收以上提及的组分中的一种或多种。实例包括但不限于用于去除水的干燥。因此，可以不用进一步精炼或通过一种或多种方法精炼应用该粗反应物混合物(组合物)。本发明的另外的方面提供包含甘油的组合物，所述组合物是可以通过根据本发明所述的方法获得的，其中通过将皂/脂肪酸盐与h3po4和/或h2so4接触，将所述皂/脂肪酸盐经受酸化以产生游离脂肪酸和盐，例如na2so4或k2so4。如上提及的，用这些酸对皂/脂肪酸盐进行酸化导致如下盐的形成，这些盐容易沉淀，并且因此可以容易地从该甘油分离以提供有价值的高等级/工业级甘油产品。如在图1制备高等级/工业级乙醇的方法中所示，可以通过过滤或其他方法去除所述盐。该方法可进一步包括干燥和/或降低在所述甘油中醇(例如甲醇)的量。根据本发明的可获得的组合物可以具有如下甘油含量，该含量高于97％(w/w)，例如高于97.5％(w/w)、高于98％(w/w)、高于98.5％(w/w)、高于99％(w/w)、高于99.5％(w/w)、高于99.75％(w/w)、高于99.8％(w/w)或高于99.9％(w/w)。项目本发明进一步披露于以下项目的任一项中并由其定义：1.生产脂肪酸烷基酯的方法，该方法包括：在包含油相/疏水相和亲水相的反应系统中，在一种或多种酯解酶存在的情况下，将脂肪酸原料与醇反应来生产脂肪酸烷基酯和甘油，其中在所述醇/所述亲水相存在的情况下，通过用一种或多种碱性试剂进行处理，皂/盐形成自在油相/疏水相中的游离脂肪酸。2.生产脂肪酸烷基酯的方法，该方法包括：在包含油相/疏水相和亲水相的反应系统中，在水和一种或多种酯解酶存在的情况下，将脂肪酸原料与醇反应来生产脂肪酸烷基酯和甘油；并且在将油相/疏水相从亲水相分离之前，通过用一种或多种碱试剂进行处理，去除或降低游离脂肪酸的量以形成游离脂肪酸的皂/盐。3.根据项目1或2所述的方法，包括i)提供包含所述油相/疏水相和所述亲水相的系统，ii)在水和一种或多种酯解酶存在的情况下，将存在于所述油相/疏水相中的脂肪酸原料与醇反应以产生所述脂肪酸烷基酯、游离脂肪酸和甘油。4.根据以上项目中的任一项所述的方法，包含将脂肪酸烷基酯与包含所述皂/盐和该一种或多种酯解酶的亲水相分离。5.根据以上项目中的任一项所述的方法，其中该一种或多种酯解酶选自脂肪酶、磷酸脂肪酶、角质酶及其混合物。6.根据以上项目中的任一项所述的方法，包括i)提供反应系统，该反应系统具有包含脂肪酸原料的油相/疏水相，和包含醇、水和一种或多种酯解酶的亲水相；ii)在所述水和所述一种或多种酯解酶存在的情况下，将脂肪酸原料与醇反应以产生游离脂肪酸、甘油、和脂肪酸烷基酯；iii)添加一种或多种碱试剂到该反应系统中以允许在步骤ii)中产生的游离脂肪酸的皂/盐的形成；并且iv)将脂肪酸烷基酯与脂肪酸的皂/盐和一种或多种酯解酶分离。7.根据以上项目中的任一项所述的方法，其中该一种或多种酯解酶是一种或多种脂肪酶，任选地与一种或多种磷酸脂肪酶和/或一种或多种角质酶组合。8.根据以上项目中的任一项所述的方法，其中所述一种或多种酯解酶的总量在0.005-5g酶蛋白质(ep)/kg油相/疏水相或脂肪酸原料范围内，例如在0.005-2.5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-1gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.75gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.25gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.1gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.075gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.05gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.025gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.005-0.01gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.01-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.02-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.03-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.04-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.05-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.06-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.07-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.08-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.09-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.1-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.2-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.3-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.4-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.5-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.6-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.7-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.8-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.9-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、1-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、2-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、3-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、4-5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.01-4gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.02-3gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.03-2gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.04-1gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.05-0.9gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.06-0.8gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.07-0.7gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.08-0.6gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.09-0.5gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.1-0.4gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料、0.1-0.3gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料范围内，或例如在0.1-0.25gep/kg油相/疏水相或脂肪酸原料范围内。9.根据以上项目中的任一项所述的方法，其中步骤ii)包括将脂肪酸原料与所述醇反应，直到至少60％(w/w)(例如至少65％(w/w)、至少70％(w/w)、至少75％(w/w)、至少80％(w/w)、至少85％(w/w)、至少90％(w/w)，或例如至少95％(w/w))的脂肪酸酰基或在所述脂肪酸原料中的游离脂肪酸已经被转换成脂肪酸烷基酯。10.根据以上项目中的任一项所述的方法，其中水的量对应于0.5％至5.0％(w/w)的所述油相/疏水相，例如0.5％至4.0％(w/w)的所述油相/疏水相、0.5％至3.0％(w/w)的所述油相/疏水相、0.5％至2.5％(w/w)的所述油相/疏水相或例如0.5％至2.0％(w/w)的所述油相/疏水相。11.根据以上项目中的任一项所述的方法，该方法包括，通过脂肪酸原料的反应和任选地通过甘油的另外的添加，将在所述亲水相中的甘油的量增加至2％至30％(w/w)，优选地从2％至20％(w/w)，例如相对于该油相/疏水相从2％至20％(w/w)。12.根据以上项目中的任一项所述的方法，其中添加该醇以达到如下量，该量相对于该油相/疏水相在12％至34％(w/w)的范围内，例如相对于该油相/疏水相在17％至34％(w/w)的范围内，或例如相对于该油相/疏水相在12％至24％(w/w)的范围内。13.根据以上项目中的任一项所述的方法，其中将该脂肪酸原料与所述醇在如下温度下反应，其中该温度在32℃至45℃的范围内，优选地在32℃至40℃的范围内。14.根据以上项目中的任一项所述的方法包括，将所述脂肪酸原料与所述醇反应持续16-50小时，例如持续24-50小时，例如持续30-50小时、持续30-45小时、持续35-50小时、持续35-45小时、持续38-42小时，优选地持续35-40小时。15.根据以上项目中的任一项所述的方法，其中所述方法以分批模式或以连续模式进行。16.根据以上项目中的任一项所述的方法，其中所述醇是c1-c5醇，优选乙醇或甲醇。17.根据以上项目中的任一项所述的方法，其中滴加或连续地添加所述醇。18.根据以上项目中的任一项所述的方法，其中所述一种或多种酯解酶中至少一种是液体酶。19.根据以上项目中任一项所述的方法，其中该脂肪酸原料源自以下各项中的一种或多种：海藻油、卡诺拉油(canolaoil)、椰子油(coconutoil)、蓖麻油、椰子油(coconutoil)、椰子干油(copraoil)、玉米油(cornoil)、酒糟玉米油(cornoil)、棉花籽油、亚麻油、鱼油、葡萄籽油、大麻油、麻风果油、荷荷巴油、芥子油、卡诺拉油(canolaoil)、棕榈油、棕榈硬脂、棕榈油精、棕榈仁油、花生油、菜籽油、米糠油、红花油、大豆油、向日葵油、妥尔油、来自盐生植物和/或动物脂肪的油(包括来自猪、牛和羊的油脂，猪油，鸡脂肪，鱼油，棕榈油游离脂肪酸馏出物，大豆油游离脂肪酸馏出物，皂原料脂肪酸材料，黄色油脂，和棕色油脂或其任何组合)。20.根据以上项目中任一项所述的方法，其中使用高剪切混合器或空化器将在该系统/反应系统中的溶液相进行混合。21.根据以上项目中的任一项所述的方法，其中在添加所述一种或多种酯解酶之前，将碱试剂或碱，例如naoh和/或koh，添加到所述系统中。22.根据项目21所述的方法，其中以对应于200ppm或更少的量，优选地以在10-100ppm范围内的量，添加碱试剂或碱。23.根据以上项目中的任一项所述的方法，其中所述油相/疏水相包含脂肪酸烷基酯、游离脂肪酸和任选地未反应的脂肪酸原料；并且所述亲水相包含甘油、醇、水和该一种或多种酯解酶。24.根据以上项目中的任一项所述的方法，其中所述亲水相构成从5％至50％、10％至50％、20％至50％、20％至45％、或甚至20％至40％的该系统/反应系统(w/w)，并且甘油构成30％至85％(w/w)、40％至85％(w/w)、45％至85％(w/w)、50％至85％(w/w)或甚至60％至80％(w/w)的该亲水相。25.根据以上项目中的任一项所述的方法，其中甘油构成30％至80％(w/w)、30％至70％(w/w)、35％至70％(w/w)、40％至70％(w/w)或甚至45％至70％(w/w)的该亲水相。26.根据以上项目中的任一项所述的方法，包含i)在所述脂肪酸原料与所述醇的反应过程中或当所述反应已经终止时，将所述甘油/所述亲水相的至少一部分从该系统/反应系统去除；并且ii)在如以上项目中任一项所定义的方法中，将该方法与另外的脂肪酸原料组合，其中该方法与该甘油/所述亲水相去除的方法是相同的或不同的。27.根据项目26所述的方法，其中去除30％至70％(w/w)的所述甘油/所述亲水相，例如40％至60％(w/w)或45％至55％(w/w)的所述甘油/所述亲水相。28.根据以上项目中的任一项所述的方法，其中将所述油相/疏水相和所述亲水相经受碱处理以形成所述游离脂肪酸的皂/盐。29.根据以上项目中的任一项所述的方法，其中将该油相/疏水相和所述亲水相经受碱处理以形成存在于油相/疏水相中的游离脂肪酸的至少一部分的皂/脂肪酸盐。30.根据项目28至29中任一项所述的方法，其中所述碱处理包含将油相/疏水相和所述亲水相与选自koh或naoh或其混合物的碱试剂或碱接触。31.根据项目28至30中任一项所述的方法，其中将该碱试剂/碱作为在水中的1-6n溶液添加，例如2-9n溶液、3-9n溶液、4-9n溶液、5-9n溶液、6-9n溶液、7-9n溶液、8-9n溶液，例如3-6n溶液、4-6n溶液或5-6n溶液。32.根据项目28至31中任一项所述的方法，其中所述碱的量在游离脂肪酸的量的1.0-2.0摩尔当量范围内，例如在游离脂肪酸的量的1.05-1,30摩尔当量或例如1.05-1.25摩尔当量的范围内。33.根据项目28至32中任一项所述的方法，其中在如下温度下进行所述碱处理，其中该温度在35℃至85℃的范围内，例如在35℃至80℃的范围内。34.根据项目28至33中任一项所述的方法，其中所述碱处理的持续时间是从30秒至2小时，例如从30秒至1小时、从30秒至30分钟、从1至30分钟、从2-30分钟、从3-30分钟、从5分钟至2小时，例如从7分钟至2小时、10分钟至2小时、15分钟至2小时、30分钟至2小时，例如从30分钟至1,5小时或例如从30分钟至1小时。35.根据项目28至34中任一项所述的方法，其中将所述碱试剂/碱作为非水性溶液添加。36.根据项目28至35中任一项所述的方法，其中将所述碱试剂/碱溶解在醇、例如甲醇中。37.根据项目28至34中任一项所述的方法，其中所述碱试剂是甲醇钠或甲醇钾或这两者的混合物。38.根据项目28至37中任一项所述的方法，其中将所述脂肪酸烷基酯与所述皂/脂肪酸盐分离。39.根据项目28至38中任一项所述的方法，其中通过重力沉降、倾析和/或离心将所述脂肪酸烷基酯与所述皂/脂肪酸盐分离。40.根据项目28至39中任一项所述的方法，其中在如下条件下并使用如下量的碱试剂进行用所述一种或多种碱试剂进行的处理，这些条件和碱试剂的量允许在油相/疏水相中的所述游离脂肪酸的量减少到少于2％(w/w)，例如少于1.5％(w/w)、少于1％(w/w)、少于0.75％(w/w)、少于0,5％(w/w)、或例如少于0.25％(w/w)。41.根据项目28至39中任一项所述的方法，该方法包括将包含脂肪酰基酯的组合物与所述皂/脂肪酰基盐分离，其中在所述组合物中的游离脂肪酸的含量低于0.25％(w/w)和/或在所述组合物中甘油酯的含量低于0.23％(w/w)。42.根据以上项目中的任一项所述的方法，该方法包括将包含脂肪酰基酯的组合物与所述皂/脂肪酰基盐分离，其中在所述组合物中的游离脂肪酸的含量低于2％(w/w)，例如低于1.5％(w/w)、低于1％(w/w)、低于0.75％(w/w)、低于0,5％(w/w)、或例如低于0.25％(w/w)和/或在所述组合物中甘油酯(优选地表达为“结合甘油”；即，结合在甘油酯中的甘油)的含量低于2％(w/w)，例如低于1.5％(w/w)、低于1％(w/w)、低于0.75％(w/w)、低于0,5％(w/w)、或例如低于0.23％(w/w)。43.根据以上项目中的任一项所述的方法，该方法包括将包含脂肪酰基酯的组合物与所述皂/脂肪酰基盐分离，其中在所述组合物中的游离脂肪酸的含量低于0.25％(w/w)和/或在所述组合物中甘油酯(优选地表达为“结合甘油”；即，结合在甘油酯中的甘油)的含量低于0.23％(w/w)。因此，根据这些实施例，本发明的产品优选地是不需要另外的精炼的、满足生物柴油指定要求的产品。44.根据以上项目中的任一项所述的方法，该方法包括将油相/疏水相与亲水相分离以提供如下组合物，该组合物包含至少90％(w/w)脂肪酸烷基酯、从300至400ppm皂、少于0.25％(w/w)游离脂肪酸和少于0.23％(w/w)甘油酯。45.根据项目28至44中任一项所述的方法，其中将所述皂/脂肪酸盐经受酸化以产生游离脂肪酸，例如通过将该皂/脂肪酸盐与hcl、h3po4和/或h2so4接触。46.根据项目41至45中任一项所述的方法，其中通过所述皂/脂肪酸盐的酸化产生的游离脂肪酸可以在根据以上项目中任一项所述的方法中用作脂肪酸原料。47.根据项目41至46中任一项所述的方法，其中通过所述皂/脂肪酸盐的酸化产生的游离脂肪酸的量在0.5％至3％(w/w)的所述原料的范围内，例如从1％至2％(w/w)的所述原料。48.根据以上项目中的任一项所述的方法，包括如下步骤i)提供包含油相/疏水相和亲水相的反应系统；例如如下反应系统，其中该油相/疏水相包含脂肪酸原料(该脂肪酸原料含有游离的和/或甘油酯结合的脂肪酸)，并且该亲水相包含水、一种或多种酯解酶、和任选地甘油；ii)将醇，例如c1-c5醇，优选地乙醇或甲醇，滴加或连续地添加至所述反应系统以达到如下量，该量相对于该油相/疏水相在14％至24％(w/w)的范围内；iii)将该脂肪酸原料和该一种或多种酯解酶经受如下条件，这些条件允许所述游离和/或甘油酯结合的脂肪酸的酯交换以提供包含脂肪酸烷基酯的组合物；iv)将所述组合物与碱试剂/碱在如下条件下接触，这些条件允许从在该组合物中的残余的游离脂肪酸形成脂肪酸盐/皂；并且v)将该脂肪酸烷基酯与脂肪酸盐/皂分离。49.根据以上项目中的任一项所述的方法，包括i)提供包含所述油相/疏水相和所述亲水相的系统，ii)在水和一种或多种酯解酶存在的情况下，将存在于所述油相/疏水相中的脂肪酸原料与醇反应以产生所述脂肪酸烷基酯和所述游离脂肪酸。iii)将该油相/疏水相和亲水相经受碱处理以形成存在于该油相/疏水相中的游离脂肪酸的皂/脂肪酸盐iv)将脂肪酸烷基酯与包含所述皂/脂肪酸盐的亲水相分离v)将所述亲水相经受酸化，例如通过添加h2so4。50.根据以上项目中的任一项所述的方法，其中将所述皂/脂肪酸盐进行中和/经受酸化，例如通过添加h2so4或h3po4，以形成盐，例如na2so4或k2so4，该盐沉淀在甘油中。51.根据权利要求50所述的方法，包含将沉淀的盐从该甘油分离，例如通过过滤。52.根据以上项目中的任一项所述的方法，包含干燥所述甘油，以从该甘油中去除例如水和醇，例如甲醇。53.根据项目50至52中任一项所述的方法，其中纯化该甘油，例如通过干燥和/或去除醇，和/或通过过滤以产生如下组合物，其中在该组合物中，甘油的含量高于95％(w/w)，例如高于97％(w/w)、高于97.5％(w/w)、高于98％(w/w)、高于98.5％(w/w)、高于99％(w/w)、高于99.5％(w/w)、高于99.75％(w/w)、高于99.8％(w/w)或高于99.9％(w/w)。47.根据以上项目中的任一项所述的方法，其中在相对于该油相/疏水相对应于2％至30％(w/w)的甘油的量、相对于该油相/疏水相对应于1.5％至5.0％(w/w)的水的量和相对于该油相/疏水相在14％至24％(w/w)范围内的醇(例如甲醇)的量存在下，将所述脂肪酸原料与醇反应。54.根据以上项目中的任一项所述的方法，其中经1至30小时时间段添加所述醇，例如经1至20小时时间段，例如经16小时时间段。55.根据以上项目中的任一项所述的方法，其中所述脂肪酸原料包含玉米油或者酒糟玉米油或主要由其组成。56.包含至少90％(w/w)脂肪酸烷基酯、从300至400ppm皂、少于0.25％(w/w)游离脂肪酸和少于0.23％(w/w)甘油酯的组合物。57.根据项目50所述的组合物，所述组合物是通过根据项目1至55中任一项所述的方法可获得的。58.根据项目55至57中任一项所述的组合物，所述组合物通过如下方法是可获得的，其中所述脂肪酸原料包含玉米油或主要由其组成，并且所述碱试剂是koh。59.包含甘油的组合物，所述组合物是可以通过在项目1至46中任一项定义的方法获得的，其中通过将皂/脂肪酸盐与h3po4和/或h2so4接触，将所述皂/脂肪酸盐经受酸化以产生游离脂肪酸和盐，例如na2so4或k2so4。60.根据权利要求59所述的组合物，其中该方法包含将该盐从该甘油分离，例如通过过滤。61.根据权利要求59或60所述的组合物，其中该方法包括干燥和/或降低在所述甘油中醇、例如甲醇的量。56.根据项目55所述的组合物，其中该甘油的含量高于95％(w/w)，例如高于97％(w/w)、高于97.5％(w/w)、高于98％(w/w)、高于98.5％(w/w)、高于99％(w/w)、高于99.5％(w/w)、高于99.75％(w/w)、高于99.8％(w/w)或高于99.9％(w/w)。通过以下实例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。实例1每克油使用低剂量的300lu液体脂肪酶(seqidno:1)，使用酒糟玉米油(cornoil)的酯交换产生脂肪酸甲基酯(fame)。在该实验中，甘油和水浓度是变化的(参见表1)。表1：*％w/w基于油的剂量使用100ml方玻璃烧瓶作为反应器并且使用的程序如下：添加32g油后，添加100ppm溶解在脱矿质水中的naoh。将该混合物在35℃和250rpm下混合10分钟，接着添加甘油和液体脂肪酶。通过添加0,70g甲醇启动该反应，接着经16小时连续的配量4,17g甲醇。在35℃和250rpm下，在英诺华(innova)培养箱中进行该反应。每批次反应时间是24小时。通过气相色谱对在油相/疏水相中的脂肪酸甲基酯的产率进行定量并通过naoh滴定法测量游离脂肪酸的含量。表2：试验％fame@24h％ffa@24h参比84.82.2低水78.62.1高甘油89.11.3高甘油和低水86.41.2中等水81.42.1中等甘油84.51.6最高的产率表示为总fame并且通过添加10％甘油和1.5％-2.0％水(w/w的油)实现最低的可能的游离脂肪酸含量。实例2每克油使用低剂量的300lu液体脂肪酶，使用酒糟玉米油的酯交换产生脂肪酸甲基酯(fame)。在35℃和530rpm下，在1l搅拌过的夹套玻璃反应器中，经24小时进行这些酶反应。使用的该程序如下：将700g的油添加到1.7g1nnaoh和8.75g的脱矿质水中。将该混合物在35℃和530rpm混合10分钟，接着每克油添加70.0g甘油和300lu液体脂肪酶(seqidno:1)。通过添加19.2g甲醇启动该反应，接着经16小时连续的配量115.0g甲醇。通过气相色谱对在油相/疏水相中的脂肪酸甲基酯的产率和结合甘油的含量进行定量并通过naoh滴定法测量游离脂肪酸的含量。表3：在530rpm下，将该混合物加热至60℃并经3分钟连续地添加28ml的3nkoh。然后将温度升至82℃持续2小时。在1小时和2小时后取出该混合物的样品并在2000rpm下离心10分钟，并分析油相/疏水相用于脂肪酸甲基酯、游离脂肪酸和结合甘油的含量。表4：关闭加热和搅动并在油相/疏水相中测量脂肪酸甲基酯、游离脂肪酸、结合甘油和皂的含量前将该混合物静置1小时。表5：实例3将seqidno:2的脂肪酶用于大规模试验中，以测试针对生物柴油的应用。使用在seqidno:1中阐述的脂肪酶，将该酶在两个水平的剂量上使用并与标准生产相比较。生产在10,000gal反应器中进行并针对每个系列的测试制作四个批次。批次编号一，添加具有181lclu/g活性的30gal的配制的酶；对应于17mg酶蛋白/100g油。在下面的批次b、c、和d中不添加额外的酶。在第一个10小时期间，以如下量添加甲醇，该量能维持甲醇在该重相中的浓度为大约15％。这一添加对应于在批次a中的1.5摩尔当量的脂肪酸且在连续批次中略减少一点(大约1.2当量)。在所有的批次后，停止混合并静置该重相至釜的底部，用于在下一个批次中再悬浮。仅从批次b，在反应后从该釜的底部排出大约650gal的重相并静置。使用seqidno:2的脂肪酶，对于这些试验而言，维持更高的温度以利用这种酶更高的耐热性。表6添加第一个30gal酶(seqidno:2)表7添加20gal酶(seqidno:2)表850galseqidno:1对照，在批次b、c、和d添加5gal当前第1页12