一种抗菌肽组合物及其应用的制作方法

1.本发明涉及一种来源于水解牛奶蛋白的抗菌肽组合物mamp及其应用。


背景技术：

2.抗生素是能抵抗致病微生物的药物，是抗菌消炎药中最大的一类。抗生素是由细菌、真菌或其他微生物在生活过程中所产生的物质，具有抑制或杀灭细菌、真菌等致病微生物的作用，因此作为抗感染药物广泛地应用于各种感染性疾病。抗生素在治疗感染中的显著效果也导致了细菌耐药性，使部分感染性疾病的治疗变得愈加困难。抗菌肽作为一种新型的抗生素，具有广谱的抗菌活性，不会轻易使微生物产生耐药性，具有广阔的应用前景。
3.抗菌肽在自然界中广泛分布，作为被广泛关注的一种新型抗生素，越来越多的抗菌肽在微生物、动植物体内被发现。目前解析的抗菌肽构效关系中有两个较清晰的特征，分别是“带正电荷的阳离子”和“两亲性序列结构”。然而抗菌肽作为抗菌药物仍然面临许多待解决的问题：部分阳离子抗菌肽可以对哺乳动物的细胞产生较大的毒性作用；两亲性结构则要求氨基酸序列中有一定数量的碱性氨基酸，而碱性氨基酸易被蛋白酶水解的特性使得其作为药物进入人体后发挥效果大大受限。因此，开发安全、稳定、低细胞毒性的抗菌肽具有重要意义。
4.牛奶作为优质的天然食物，是丰富的蛋白质和多肽资源，兼顾抗菌肽的优势及优质安全的蛋白来源两个特质。牛奶中蛋白含量丰富，在蛋白酶的水解作用下，形成稳定存在的抗菌肽，作为微生物生长抑制剂具有良好的潜质。因此，从水解牛奶蛋白肽出发进一步寻找具有抑菌活性的肽会为健康安全的微生物生长抑制剂的制备提供新的方向。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种来源于水解牛奶蛋白的抗菌肽组合物mamp，在制备预防和/或降低由微生物引起的肠道感染疾病、口腔疾病、皮肤疾病的药物、日用品或者微生物生长抑制剂中的应用。
6.为实现上述目的，本发明以所述抗菌肽组合物mamp为抑制微生物生长活性的有效成份。抗菌肽组合物mamp由mamp-01、mamp-02和mamp-03组成，具体为：
7.(1)mamp-01为多肽aasdisll，具有序列表seq id no：1中氨基酸序列；该多肽的氨基酸序列具体为：
8.ala-ala-ser-asp-ile-ser-leu-leu)；分子量788.90da，白色粉末状，易溶于水。
9.(2)mamp-02为多肽ldaqsaplr，具有序列表seq id no：2中氨基酸序列；该多肽的氨基酸序列具体为：
10.leu-asp-ala-gln-ser-asp-pro-leu-arg；分子量970.09da，白色粉末状，易溶于水。
11.(3)mamp-03为多肽ldtdykky，具有序列表seq id no：3中氨基酸序列；该多肽的氨基酸序列具体为：
12.leu-asp-thr-asp-tyr-lys-lys-tyr；分子量1045.16da，白色粉末状，易溶于水。
13.三个抗菌肽的比例为mamp-01：mamp-02：mamp-03＝1：0-10：5～20(重量比)，优选mamp-01：mamp-02：mamp-03＝1：0-8：7～15(重量比)，更优选mamp-01：mamp-02：mamp-03＝1：0-6：8～12(重量比)。
14.mamp对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、牙龈卟啉单胞菌、变异链球菌、白色念珠菌的生长存在较强的抑制作用。mamp可作为抗革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌的药物、食品、日用品的活性成份，其中可添加药学、食品、日用品上可接受的载体或辅料。
15.本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
16.本发明将来源于水解牛奶蛋白的抗菌肽按照其在酶解物中的含量进行组合，获得的抗菌肽组合物，与单一抗菌肽相比，组合物的抗菌效率提高、抑制微生物的种类更多。本发明首次验证了上述多肽组合物具有较好的抑菌活性，因此作为预防和/或降低由大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、牙龈卟啉单胞菌、变异链球菌、白色念珠菌引起的感染疾病的药物和/或保健品和/或日用品或者微生物生长抑制剂具有良好的应用前景。
具体实施方式
17.实施例1
18.(1)mamp的配置
19.于上海杰肽科技有限公司分别定制化学合成多肽mamp-01(纯度为97.7％)、mamp-02(纯度为95.4％)、mamp-03(纯度为97.6％)。配置抗菌肽组合mamp：1克mamp-01+10克mamp-02+20克mamp-03。以革兰氏阴性菌中的大肠杆菌和牙龈卟啉单胞菌、革兰氏阳性菌中的金黄色葡萄球菌和变异链球菌、真菌白色念珠菌为靶标菌种，考察抗菌肽组合物mamp的抗菌活性。
20.(2)菌株及复苏
21.大肠杆菌(escherichia coli k12)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis，p.g.,atcc33277)、变异链球菌(streptococcus mutans，m.s.,atcc25175)和白色念球菌(candida albicans，atcc 10231)均购自中国菌种资源库保藏中心，以甘油保藏法保存于-80℃。实验前将大肠杆菌接种于lb肉汤培养基(北京索莱宝科技有限公司)中，将金黄色葡萄球菌接种于tsb肉汤培养基(北京索莱宝科技有限公司)中，将牙龈卟啉单胞菌和变异链球菌分别接种于bhi肉汤培养基(北京索莱宝科技有限公司)中，白色念球菌接种于ym培养基(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)中，靶标菌种均以1％体积量接种。于37℃条件下培养12h，将菌液以1％体积量再次接种至新鲜培养基中培养复苏。重复接种复苏操作2次，使菌株恢复活力。
22.(3)抗菌实验
23.分别取1ml培养过夜的菌液用pbs缓冲液洗涤2次后稀释成10^7菌液，获得大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、牙龈卟啉单胞菌、变异链球菌和白色念球菌菌液。(mamp、mamp-01、mamp-02、mamp-03)样品分别溶解于上述菌培养对应的培养基中(大肠杆菌对应lb肉汤培养基，金黄色葡萄球菌对应tsb肉汤培养基，牙龈卟啉单胞菌和变异链球菌对应bhi肉汤培养基，白色念球菌对应ym培养基)，配制成100mg/ml的抗菌肽溶液，过0.22um膜除菌备用，获得不同菌对应的肽溶液。将100ul不同菌对应的上述浓度肽溶液或菌培养对应的培养基分别
与100ul上述对应的菌液混合(大肠杆菌对应lb肉汤培养基或其溶解样品后获得的菌液，金黄色葡萄球菌对应tsb肉汤培养基或其溶解样品后获得的菌液，牙龈卟啉单胞菌和变异链球菌对应bhi肉汤培养基或其溶解样品后获得的菌液，白色念球菌对应ym培养基或其溶解样品后获得的菌液)，依次加入96孔细胞培养板的不同孔中，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌于有氧环境37℃培养，牙龈卟啉单胞菌和变异链球菌于厌氧环境37℃培养。以上菌液分别培养12小时后于600nm处测吸光度。按照以下公式分别计算样品对应不同菌的抑菌率：
24.od1对照组：菌液100ul+培养基100ul
25.od2试验组：菌液100ul+肽溶液100ul
26.(4)实验结果
27.对五种菌的抑菌结果见表1，表中列出了抗菌肽组合物mamp、mamp-01、mamp-02、mamp-03的抑菌结果。结果表明抗菌肽组合物mamp对革兰氏阴性、革兰氏阳性菌和真菌均有抑制活性，并且对于以上五种菌的抑制活性明显好于单一抗菌肽。
28.表1抗菌肽组合物mamp的抑菌结果
[0029][0030]
实施例2
[0031]
mamp的配置：抗菌肽组合物mamp：1克mamp-01+5克mamp-03。
[0032]
其他实验方法与实施例1相同。
[0033]
对五种菌的抑菌结果见表2，结果表明抗菌肽组合物mamp对革兰氏阴性、革兰氏阳性菌和真菌均有抑制活性，并且对于以上五种菌的抑制活性明显好于单一抗菌肽。
[0034]
表2抗菌肽组合物mamp的抑菌结果
[0035][0036]
实施例3
[0037]
mamp的配置：抗菌肽组合物mamp：1克mamp-01+6克mamp-02+15克mamp-03。
[0038]
其他实验方法与实施例1相同。
[0039]
对五种菌的抑菌结果见表3，结果表明抗菌肽组合物mamp对革兰氏阴性、革兰氏阳性菌和真菌均有抑制活性，并且对于以上五种菌的抑制活性明显好于单一抗菌肽。
[0040]
表3抗菌肽组合物mamp的抑菌结果
[0041][0042]
实施例4
[0043]
mamp的配置：
[0044]
抗菌肽组合物mamp：1克mamp-01+3克mamp-02+8克mamp-03。
[0045]
其他实验方法与实施例1相同。对五种菌的抑菌结果见表4，结果表明抗菌肽组合物mamp对革兰氏阴性、革兰氏阳性菌和真菌均有抑制活性，并且对于以上五种菌的抑制活性明显好于单一抗菌肽。
[0046]
表4抗菌肽组合物mamp的抑菌结果
[0047][0048]
实施例5
[0049]
mamp的配置：
[0050]
mamp组合1：1克mamp-01+5克mamp-02+10克mamp-03
[0051]
mamp组合2：1克mamp-01+15克mamp-02+10克mamp-03
[0052]
mamp组合3：1克mamp-01+20克mamp-02+2克mamp-03
[0053]
mamp组合4：1克mamp-01+20克mamp-02+30克mamp-03
[0054]
其他实验方法与实施例1相同。
[0055]
对五种菌的抑菌结果见表5，表中列出了mamp抗菌肽组合1、mamp抗菌肽组合2、mamp抗菌肽组合3、mamp抗菌肽组合4、mamp抗菌肽组合5的抑菌结果。结果表明五种抗菌肽组合mamp均对革兰氏阴性、革兰氏阳性菌和真菌均很好的抑制活性，其中mamp抗菌肽组合5的抑菌活性明显好于其他4种组合。
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表5抗菌肽组合物mamp的抑菌结果
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