一株耐镉促生雷氏普罗威登斯菌菌株及其应用

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及雷氏普罗威登斯菌菌株mrp36及其 应用。


背景技术：

2.镉不是植物生长发育所必需的元素。当其体内含量超过某一浓度时，植物就 会受到严重的危害，如植株萎蔫发黄、长势较弱等症状。植物根系很容易吸收镉， 继而向地上部转运，这样就会使植物中毒，影响营养元素的吸收，进而抑制植物 生长。镉也会破坏根结构，从而影响植物养分的吸收。
3.磷是植物最重要的必需营养元素之一，是植物细胞分裂、能量生成、大分子 生物合成、膜完整性、信号转导和光合作用等关键代谢过程所必需的常量营养元 素。它还在植物的呼吸作用和豆科作物的固氮作用中发挥作用。虽然土壤中含有 大量磷化合物，然而植物能真正利用的可溶性磷却非常少。因为土壤中的大部分 的磷以难溶态形式存在，而只有磷酸盐形式的磷源能被植物吸收。
4.微生物和植物紧密相关，微生物或正面或负面的影响植物的生长发育。受植 物根系分泌物的影响，土壤中的微生物与植物根际及根系建立稳定的共生关系， 有一些细菌能够侵染植物根系，定殖到植株内部。中国发明专利， cn104830728a，公开了一种雷氏普罗威登斯菌，该菌株能够与海水鱼类盾纤 毛虫病原共培养时，能够在24小时内杀灭共培养体系中97％以上的盾纤毛虫。 但该菌株不耐镉，不能溶解难溶性磷而让植物吸收利用磷，不能解决植物的镉毒 胁迫和低磷胁迫的技术问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一株新的雷氏普罗威登斯菌(providencia sp.)菌株 mrp36，该菌株与植物共生，能解决植物低磷胁迫和镉毒胁迫的技术问题。该菌 株具有分泌生长素、耐酸、耐镉、溶磷和产铁载体的特性。大豆接种该雷氏普罗 威登斯菌能提高大豆的生物量(干重)、显著提高叶绿素spad值和磷含量、促 进大豆根生长；而且能克服镉对大豆生长抑制的作用，尤其是克服镉对大豆根系 生长的抑制作用。
6.本发明的目的是提供雷氏普罗威登斯菌(providencia sp.)菌株mrp36。
7.本发明的另一目的是提供雷氏普罗威登斯菌(providencia sp.)菌株mrp36 在培育耐镉毒植物方面的应用。
8.本发明的另一目的是提供雷氏普罗威登斯菌(providencia sp.)菌株mrp36 在减弱镉抑制植物生长方面的应用。
9.本发明的另一目的是提供雷氏普罗威登斯菌(providencia sp.)菌株mrp36 在促进植物叶片合成叶绿素方面的应用。
10.本发明的另一目的是提供雷氏普罗威登斯菌(providencia sp.)菌株mrp36 在促进植物吸收磷方面的应用。
11.本发明的另一目的是雷氏普罗威登斯菌(providencia sp.)菌株mrp36在制 备适
mgso4·
7h2o，4.5
×
10
‑3mm mncl2·
4h2o，0.3
×
10
‑3mmznso4·
7h2o，0.16
×
10
‑3mm cuso4·
5h2o，0.16
×
10
‑3mm(nh4)6mo7o
24
·
4h2o， 20
×
10
‑3mm h3bo3，50
×
10
‑3mm kh2po4。
29.本发明具有以下有益效果：
30.本发明提供了一株耐镉促生雷氏普罗威登斯菌菌株mrp36，其与植物共生， 能够：
31.(1)促进植物生长，促进植物吸收磷含量，提高其生物量和叶绿素spad， 尤其适用于大豆科植物。
32.(2)提高植物的耐镉毒能力，克服镉对植物的生长抑制作用，尤其是克服 镉对大豆的生长抑制作用。
33.(3)该菌株具有分泌生长素、耐酸、耐隔、溶磷和产铁载体的特性。
附图说明
34.图1显示雷氏普罗威登斯菌菌株mrp36的溶磷圈。
35.图2显示雷氏普罗威登斯菌菌株mrp36在不同色氨酸浓度下产生iaa。
36.图3显示雷氏普罗威登斯菌菌株mrp36产生iaa的定量图，图中字母a、b、 c和d代表方差分析后各样本平均数间是否有显著差异，组间字母相同代表组间 差异不显著(p>0.05)，字母不相同代表组间差异显著(p<0.05)。
37.图4显示雷氏普罗威登斯菌菌株mrp36的耐镉曲线(od
600
‑
镉浓度)，图 中字母a、b和c代表方差分析后各样本平均数间是否有显著差异，组间字母相 同代表组间差异不显著(p>0.05)，字母不相同代表组间差异显著(p<0.05)。
38.图5显示雷氏普罗威登斯菌菌株mrp36的耐酸曲线(od
600
‑
ph)，图中字 母组合a、ab、bc和c代表方差分析后各样本平均数间是否有显著差异，组间字 母相同代表组间差异不显著(p>0.05)，字母不相同代表组间差异显著(p<0.05)。
39.图6显示雷氏普罗威登斯菌菌株mrp36的发育进化树。
40.图7显示雷氏普罗威登斯菌菌株mrp36的大豆在镉毒胁迫下，其植株干重 (a)、株高(b)和spad值(c)的变化。
41.图8显示接种雷氏普罗威登斯菌菌株mrp36的大豆在镉毒胁迫下，其根长 (a)、根表面积(b)、根直径(c)和根体积(d)的变化。
42.图9显示接种雷氏普罗威登斯菌菌株mrp36的大豆在镉毒胁迫下，其地上 部镉浓度(a)和根部镉浓度(b)的变化。
43.图10显示接种雷氏普罗威登斯菌菌株mrp36的大豆在镉毒胁迫下，其地上 部磷含量(a)和根部磷含量(b)的变化。
44.图中*:0.01<p<0.05，**:0.001<p<0.01，***:p<0.001。
具体实施方式
45.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本 发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技 术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为 市购。
46.实施例1：菌株的分离纯化
47.1.菌株的分离及纯化
48.在韶关市曲江区北约村，从镉污染土上种植的玉米(正甜68)的玉米根际 分离菌株。分别剪取5g玉米根，用小刷子刷去表层土壤，无菌水漂洗多次至无 附着土后，置于盛有100ml灭菌水的250ml编号序号的三角形瓶中，180r/min， 37℃摇床，摇30min。锥形瓶内添加10
‑
20颗玻璃珠帮助打碎土壤，使细菌能 够从土壤中释放出来，震荡结束后，将土壤悬液静置10min，得到土壤悬浮液， 取上清液，进行10倍系列梯度浓度稀释，稀释至10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5、 10
‑6，然后吸取稀释液0.1ml涂布于lb平板，每个浓度梯度三次重复，37℃条 件下倒置培养，观察菌落生长情况，挑取不同表型的单克隆，给每种菌落在培养 基背面编号，并记录菌落形态和长出菌落的时间，每种类型挑取单克隆到1.5ml 离心管中摇菌，在180r/min，37℃条件下培养，再经lb固体培养基划线纯化 3
‑
4次后(直至显微镜下菌落形态一致，说明已纯化完成)，加入浓度为25％灭 菌甘油于
‑
80℃保藏待用。
49.结果在玉米根际离到55株菌株，编号mrp1～55，此为分离纯化出来的待测 菌株。
50.实施例2：菌株筛选
51.2.1溶磷菌的初筛
52.将筛选出的菌株接种于pko固体培养基上，每个平板点接三次，28℃培养 箱培养，在第7d测量菌株溶磷圈外直径(d)和菌落直径(d)的大小并拍照， 有溶磷圈的即能够溶磷。然后比较(d/d)的比值，对菌株的溶磷能力进行判断。
53.吸取1ml具溶磷圈的菌株的菌液，接种于20ml lb液体培养基中(50ml 的离心管)，24h培养后，测定od
600
为1.0左右，取1ml菌重悬液接种于20mlpko液体培养基中(50ml的离心管)，每个菌株三次重复，ck对照组为接种 等量的无菌水，放置在28℃，180r/min摇床中培养。在第7d测定pko液体培 养基的ph值，并吸取1ml上清液(1200r/min，离心5min)到25ml容量瓶 待测，吸取5ml钼锑抗显色液，用二级水定容至25ml，反应30min后，使用 酶标仪测定880nm处的吸光度值(为了去除培养基颜色的影响，应用880nm测 定，通过换算公式，得出在标准曲线(y＝0.4833x+0.0002(r2＝0.9997)。换 算得到相应的磷浓度(mg/l)。
54.结果：发现菌株mrp36的溶磷圈比值大于1.5(图1和表1)。在溶磷定量 试验中，菌株mrp36表现出较强的溶磷能力，可溶解到33.42
±
1.46mg/ml的磷。
55.表1
56.菌株编号d(cm)d(cm)d/d溶解磷浓度(mg/ml)mrp361.000.701.4333.42
±
1.46
57.2.2分泌iaa的筛选
58.配制含l
‑
色氨酸浓度分别为0、100、200、500mg/l lb液体培养基，将筛 选出的菌株接种于液体培养基中，每个菌株三次重复(以不接菌的相同培养基作 为空白对照)，在28℃，180r/min下培养2d，每个重复取200μl上清液，加 入200μl的salkowski显色液到96孔酶标板中，并以加入未接菌相同液体培养 基与200μl的salkowski显色液为对照，室温避光放置20min后，使用酶标仪 在530nm下测其波长。在标准曲线上查出相应的iaa产量。iaa产量单位为 mg/ml。
59.定性结果显示(图2)，在0
‑
500mg/l的l
‑
色氨酸浓度条件下，随着l
‑
色 氨酸浓度的提高，各菌株分泌iaa的能力也越强。其中菌株mrp36产iaa含 量最高，最高可产生48.27mg/l的iaa，即使在色氨酸浓度为0的条件下，依 然能够产生较高的iaa(图3)，说明其能够利用非色氨酸途径来产生iaa。
60.2.3产铁载体能力的筛选
61.吸取1ml待测菌株的菌悬液，接种于mkb液体培养基中。在28℃，180r/min 下培养48h。培养液离心10min(1200r/min)，取200μl上清液(参比值(ar) 为测定时加入200μl未接种的mkb液体培养基)，按照1:1的比例与cas检 测液混合。常温反应1h后，酶标仪测定630nm下波长od值(a)。实验中， 若不产铁载体，则cas液体培养基和对照一样呈蓝色，若菌株产铁载体，则cas 液体培养基变化为橘黄色。以a/ar的比值表示样品中铁载体的相对含量，值越 小，则表示菌株产铁载体的能力越强，以(ar
‑
a)/ar的比值表示样品中铁载体 的活性单位，活性单位越高，产铁载体能力越强。
62.结果发现，mrp36菌株在mrp1～55菌株中产铁载体的活性单位较高，达到 37.50％。
63.2.4耐镉能力筛选
64.分别配制镉浓度为0、4、8、12、16、20mg/l的6个lb液体培养基，121℃， 20min灭菌。准备2个96孔灭菌细胞培养板，吸取配制好的不同镉浓度的lb 液体培养基各200μl到培养板。待测菌株活化培养24h后，每个菌株吸取5μl 到不同镉浓度值的培养孔中，每个菌株4次重复，37℃，180r/min下培养48h， 测定菌液在600nm下的吸光值。
65.结果：在0
‑
8mg/l cd浓度条件下，mrp36的生长速度几乎不变，耐镉性较 强(图4)。
66.5.耐酸能力筛选
67.分别配制ph至4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的6个lb培养基，121℃，20 min灭菌。准备2个96孔灭菌细胞培养板，吸取配制好的不同ph的lb液体培 养基各200μl到培养板。待测菌株活化培养24h后，每个菌株吸取5μl到不同 ph值的培养孔中，每个菌株4次重复，37℃，180r/min下培养48h，测定菌液 在600nm下的吸光值。
68.菌株mrp36在ph为4.5
‑
7.0之间生长速度差异不大(图5)，说明这该菌 株在弱酸性条件下也能够生长的很好。
69.实施例3菌株鉴定
70.经过多方面综合考虑，对筛选的菌株mrp36进行鉴定。
71.3.1菌株的形态学鉴定
72.将菌株mrp36接种在lb固体培养基上进行培养，并观察记录。在最适生 长条件(ph 7.0，温度37℃)培养5～7天后，将分离并纯化得到的菌株mrp36 进行单菌落状态观察，主要包括菌落的大小、颜色、菌落表面状态和菌落边缘状 态等。另一方面，对处于对数生长期的菌株mrp36，经涂片染色后采用光学显 微镜观察菌体的形态。
73.在lb平板培养基上，形成近似圆状，光滑，突起，乳白色菌落，革兰氏染 色为红色，革兰氏阴性菌。
74.3.2分子鉴定
75.经过多方面筛选和综合考虑，筛选菌株mrp36进行鉴定并继续研究。将菌 株接种于lb培养基中37℃，180r/min培养24小时后，采用细菌总dna提取 试剂盒提取菌株的总dna，送生物公司进行测序，将得到的菌株序列在ncbi 数据库进行blast序列比对分析，使用mega7.0构建系统发育进化树(图6)。
76.根据测序结果显示mrp36为雷氏普罗威登斯菌(providencia sp.)，其16s rdna序列如seq id no.1所示；并将该雷氏普罗威登斯菌(providencia sp.)菌 株mrp36于2021年
5月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为 gdmcc no：61650。
77.实施例4雷氏普罗威登斯菌mrp36的回接大豆试验
78.4.1回接试验
79.本研究采用基质土盆栽试验。实验设置三种镉浓度组，分别为0、10、20mg/kgcdcl2·
5/2h2o，接种菌株mrp36，且每盆均为低磷处理，每个处理4个重复， 具体如下。
80.基质和蛭石的混合基质处理方法：称取无肥基质和蛭石按照3：1混合(0.5 kg混合土＝0.125kg蛭石+0.375kg基质)，121℃灭菌40min，间隔24h后重 复一次灭菌，放置一周后备用。取容量2l的花盆，用10％的次氯酸钠浸泡过夜 后用清水充分冲洗数次，风干备用。称取定量氯化镉溶于水，配制0、10、20mg/kg 的溶液，量取一定体积倒入混合基质中，同时每盆(0.5kg)混入125mg ca3(po4)
2 (相当于纯磷50mg/kg)，每盆称取混匀，静置一周待用。
81.种子用盐酸
‑
次氯酸钠产生氯气灭菌4h，用粗砂：中砂＝1：2的混合砂来育 苗，育苗一周后，挑选生长基本一致的大豆植株(巴西10)，每盆移栽一株。 移苗后1、3、5天浇灌菌悬液，一次100ml，合计3次。
82.菌悬营养液的配制：菌株接种于装有250ml lb培养液，在37℃摇床中， 180r/min振荡培养18h左右，待菌液浑浊测定od
600
在0.6到1.0之间，离心收 集菌体用低磷营养液重悬，用灭菌枪头拨开幼苗根部表面基质。将菌重悬营养液 倒入根部，菌体随营养液浇灌到基质中。
83.其中所述的低磷营养液的配方为:2.5mm kno3，2.5mm ca(no3)2·
4h2o， 0.08mm fe
‑
na
‑
edta，0.25mm k2so4，1mm mgso4·
7h2o，4.5
×
10
‑3mmmncl2·
4h2o，0.3
×
10
‑3mm znso4·
7h2o，0.16
×
10
‑3mm cuso4·
5h2o，0.16
×
10
‑
3 mm(nh4)6mo7o
24
·
4h2o，20
×
10
‑3mm h3bo3，50
×
10
‑3mm kh2po4。
84.4.2指标检测
85.培养大豆30天后收获。在光照充足的条件下用spad仪测量植株倒三叶不 同部位的spad值后取平均值。自来水冲洗干净后先放到冷库，一周内及时进行 扫描。用台式扫描仪(epson1460xl)扫描根系，根系尽量平展铺开，使其不重 叠，根系过大的可剪开扫描，不影响其扫描结果，盖上蓝色遮光板，扫描完成后， 经过根系分析软件winrhizo(regent instruments inc.,加拿大)分析各个样品根 的根系性状，
86.将作物地上部和根部分开，称取地上部和根部鲜重，地上部分放入105℃烘 箱杀青30min后，在烘箱烘干后，取出在室温下放置10min冷却后称量干重。 根部先用根系扫描仪进行扫描，并称重，其余部分同样经过杀青后烘干，称干重。
87.再将大豆根部浸泡在10mmol/l na2‑
edta溶液中5min以除去表面吸附的 cd
2+
，然后用二级水水冲洗干净，将根系与茎叶部分开75℃烘干称取干重后测定 地上部磷含量和镉浓度；根部放冷库用于扫根，扫完后烘干称重，测定根部磷含 量和镉浓度。磷检测采用紫外分光光度法，镉检测采用原子吸收分光光度计火焰 吸收法。
88.结果如下：
89.(1)在0mg/kg cd
2+
和20mg/kg cd
2+
条件下，接种了菌株mrp36的大豆植 株干重显著高于不接菌处理，高出28％和29％，表明接种mrp36能够促进大豆 生长且缓解大豆镉毒害(图7a)。
90.(2)在0mg/kg cd
2+
和20mg/kg cd
2+
条件下，接种mrp36菌株的大豆与 ck大豆株高
相比显著增加了，分别增加了21％和23％(图7b)。
91.(3)mrp36接菌处理的大豆spad值显著高于ck不接菌处理，高出了20％ (图7c)。
92.(3)在20mg/kg cd
2+
条件下，接种mrp36菌株处理的大豆总根长与ck 组有极显著差异，增加了180％，根表面积；接菌处理大豆根表面积与ck组有 极显著差异，增加了212％；接菌处理大豆平均根直径与ck组有极显著差异， 增加了25％；接菌处理大豆根体积与ck组有极显著差异，增加了249％，表明 高浓度镉条件下，mrp36菌株能减弱镉对根生长的抑制作用，甚至利用镉促进 根系生长(图8)。
93.(5)0mg/kg cd
2+
条件下，对比ck不接菌，接种mrp36菌株的大豆地上 部镉浓度显著上升，但不影响根的镉浓度，但在20mg/kg cd
2+
条件下，对比ck 不接菌，接菌后根部镉浓度显著减少了38％，表明mrp36能够缓解大豆根部镉 毒害(图9)。
94.(6)0mg/kg cd
2+
条件下，对比ck不接菌，mrp36处理的地上部磷含量 显著提高了93％，根的磷含量显著提高了60％。在高浓度镉(20cd)条件下， mrp36仍能有效提高大豆根部磷含量(图10)。
95.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。