本发明属于多肽技术领域，具体涉及一种牡丹燕窝复合蛋白肽的制备方法。
背景技术：
cn103937865a披露了一种以牡丹籽压榨制备牡丹籽油后的饼粕为原料制备牡丹多肽的方法。具体如下：步骤一研磨粉碎将牡丹饼粕用粉碎机粉碎至80目，以上的牡丹饼粕是牡丹籽压榨制备牡丹籽油后的饼粕。
步骤二脱脂将粉碎后的饼粕装入索氏抽提器中脱脂6h后，取出风干获得脱脂牡丹饼粕粉备用。
步骤三制浆取10g脱脂牡丹饼粕粉，加90ml的95℃热水，搅拌均匀让牡丹饼粕粉充分溶解在热水里。
步骤四灭菌冷却用压力蒸汽灭菌器高温高压灭菌15min，作为发酵培养基。
步骤五接菌发酵接种10ml的枯草芽孢杆菌种子液(每ml种子液中含有枯草芽孢杆菌3.4×107cfu)，倒入发酵培养基，调ph为7.2，用玻璃棒混合均匀后用发酵封口膜封住瓶口，放入32℃的培养箱发酵，发酵时间48h。
步骤六滤液分离离心4000r/min，25min，取上清液，从而得到牡丹多肽粗液。
步骤七精炼将牡丹多肽粗液用超滤膜按分子量进行分级分离，截留分子量为5kda。
步骤八干燥在0.08个大气压下，130℃喷雾干燥。
步骤九灭菌140℃高温瞬时灭菌8s，得到牡丹多肽制品。
cn1858225a披露了一种燕窝多肽的制备方法和用途，其特征是所述燕窝多肽是用无花果蛋白酶降解燕窝蛋白质，获得燕窝多肽的制备方法和用途。
本发明人通过检索，未发现有将牡丹饼粕与燕窝制备复合多肽的文献披露。
技术实现要素：
为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种以牡丹饼粕与燕窝为原料制备复合多肽的方法。
一种牡丹燕窝复合蛋白肽的制备方法，包括下述的步骤：
(1)粉碎：将原料牡丹籽粕粉碎，得牡丹籽粕粉；将燕窝洗净、烘干、粉碎，得燕窝粉；
(2)破壁：取步骤(1)中牡丹籽粕粉和燕窝粉混合，破壁；
(3)步骤(2)处理后的牡丹籽粕粉和燕窝粉混合粉中加水，再加入碱性蛋白酶，超声条件下酶解，然后灭酶；
(4)过滤(3)中的灭酶酶解液，得第一过滤清液，然后在残渣中加入水，超声提取；过滤，收集第二过滤清液；
(5)真空浓缩：将步骤(4)的第一过滤清液和第二过滤清液合并，浓缩，得浓缩液；
(6)将步骤(5)浓缩液干燥即得牡丹燕窝蛋白肽粉。
优选的，(1)中，原料牡丹籽粕为牡丹种仁榨油之后的固体饼粕；
优选的，将原料牡丹籽粕粉碎，得牡丹籽粕粉；将燕窝洗净、烘干、粉碎，得燕窝粉。
(2)中，采用超微气流粉碎分级机进行破壁。
(2)中破壁：取步骤(1)中牡丹籽粕粉和燕窝粉以质量比1：1～10混合，破壁，破壁时间控制在10～30min。
(3)步骤(2)处理后的牡丹籽粕粉和燕窝粉混合粉中加水，加水质量为混合粉的5～10倍，混合，再加入占混合粉重量0.01％～0.03％的碱性蛋白酶，在35～50℃，ph为7～10，超声频率为20～40khz的条件下，超声酶解0.5～2小时；然后灭酶。
(4)中，过滤(3)中的酶解液，得第一过滤清液，将残渣以料液比为1：6～12加入质量份数的水，调节ph为7～10，在35～50℃，超声频率为20～40khz的条件下，超声0.5～2小时；过滤，收集第二过滤清液。
(5)中，真空浓缩：将步骤(4)的过滤清液合并，通过真空旋转蒸发进行浓缩，使滤出液中的固含量提升30～40％(w/v)，得浓缩液。
上述的一种牡丹燕窝复合蛋白肽的制备方法，包括下述的步骤：
(1)粉碎：将原料牡丹籽粕粉碎过60～100目筛，得牡丹籽粕粉，原料牡丹籽粕为牡丹种仁榨油之后的固体饼粕；将燕窝洗净、烘干、粉碎过60～100目筛，得燕窝粉；
(2)破壁：步骤(1)中牡丹籽粕粉和燕窝粉以质量比1：1～10混合，用超微气流粉碎分级机进行破壁，破壁时间控制在10～30min；
(3)步骤(2)处理后的牡丹籽粕粉和燕窝粉混合粉中加水，加水质量为混合粉的5～10倍，混合，再加入占混合粉重量0.01～0.03％的碱性蛋白酶，在35～50℃，ph为7～10，超声频率为20～40khz的条件下，超声酶解0.5～2小时；然后灭酶；
(4)过滤(3)中的酶解液，得第一过滤清液，将残渣以料液比为1：6～12加入质量份数的水，调节ph为7～10，在35～50℃，超声频率为20～40khz的条件下，超声0.5～2小时；过滤，收集第二过滤清液；
(5)真空浓缩：将步骤(4)的过滤清液合并，通过真空旋转蒸发进行浓缩，使滤出液中的固含量提升至重量体积比为30～40，得浓缩液；
(6)对浓缩液超高压处理；压力为500～600mpa；
(7)将步骤(6)浓缩液进行喷雾干燥即得牡丹燕窝蛋白肽粉。
优选的，上述的一种牡丹燕窝复合蛋白肽的制备方法，包括下述的步骤：
(1)粉碎：将原料牡丹籽粕粉碎过80目筛，得牡丹籽粕粉，原料牡丹籽粕为牡丹种仁榨油之后的固体饼粕；将燕窝洗净、烘干、粉碎过80目筛，得燕窝粉；
(2)破壁：步骤(1)中牡丹籽粕粉和燕窝粉以质量比1：8混合，用超微气流粉碎分级机进行破壁，破壁时间为20min；
(3)步骤(2)处理后的牡丹籽粕粉和燕窝粉混合粉中加水，加水质量为混合粉的8倍，混合，再加入占混合粉重量0.02％的碱性蛋白酶，在40℃、ph8的条件下，超声频率为30khz的条件下，超声酶解1.5小时；然后灭酶；
(4)过滤(3)中的酶解液，获得第一过滤清液；将残渣以料液比为1：10的比例加入水，调节ph8，在40℃，超声频率为35khz的条件下，超声1.5小时；过滤，收集第二过滤清液；
(5)真空浓缩：将步骤(4)的第一过滤清液和第二过滤清液合并，通过真空旋转蒸发进行浓缩，使滤出液中的固含量提升至重量体积比为30～40，得浓缩液；
(6)对浓缩液超高压处理；压力为550mpa；
(7)将步骤(6)浓缩液进行喷雾干燥即得牡丹燕窝蛋白肽粉。
本发明的有益效果在于：
本发明所提供的复合蛋白肽，相较于单一的牡丹多肽或燕窝多肽，本发明所制备的复合蛋白肽其对dpph自由基清除能力、亚铁离子螯合能力、o2-·清除率、·oh清除率有显著的提高。
实施例1～4中的o2-·清除率能达到36％以上；·oh清除率达到了23％以上，dpph自由基清除率达到了62％以上，fe2+螯合率达到了92％以上。而对比例中上述的指标测试明显低于本发明。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。
实施例1
一种牡丹燕窝复合蛋白肽的制备方法，包括下述的步骤：
(1)粉碎：将原料牡丹籽粕粉碎过80目筛，得牡丹籽粕粉，原料牡丹籽粕为牡丹种仁榨油之后的固体饼粕；将燕窝洗净、烘干、粉碎过80目筛，得燕窝粉；
(2)破壁：步骤(1)中牡丹籽粕粉和燕窝粉以质量比1：8混合，用超微气流粉碎分级机进行破壁，破壁时间为20min；
(3)步骤(2)处理后的牡丹籽粕粉和燕窝粉混合粉中加水，加水质量为混合粉的8倍，混合，再加入占混合粉重量0.02％的碱性蛋白酶，在45℃、ph8的条件下，超声频率为30khz的条件下，超声酶解1.5小时；然后灭酶；
(4)过滤(3)中的酶解液，获得第一过滤清液；将残渣以料液比为1：10的比例加入水，调节ph8，在45℃，超声频率为35khz的条件下，超声1.5小时；过滤，收集第二过滤清液；
(5)真空浓缩：将步骤(4)的第一过滤清液和第二过滤清液合并，通过真空旋转蒸发进行浓缩，使滤出液中的固含量提升至重量体积比为35，得浓缩液；
(6)对浓缩液超高压处理；压力为550mpa；
(7)将步骤(6)浓缩液进行喷雾干燥即得牡丹燕窝蛋白肽粉。
实施例2
一种牡丹燕窝复合蛋白肽的制备方法，包括下述的步骤：
(1)粉碎：将原料牡丹籽粕粉碎过80目筛，得牡丹籽粕粉，原料牡丹籽粕为牡丹种仁榨油之后的固体饼粕；将燕窝洗净、烘干、粉碎过80目筛，得燕窝粉；
(2)破壁：步骤(1)中牡丹籽粕粉和燕窝粉以质量比1：4混合，用超微气流粉碎分级机进行破壁，破壁时间为10min；
(3)步骤(2)处理后的牡丹籽粕粉和燕窝粉混合粉中加水，加水质量为混合粉的5倍，混合，再加入占混合粉重量0.01％的碱性蛋白酶，在37℃、ph7的条件下，超声频率为20khz的条件下，超声酶解2小时；然后灭酶；
(4)过滤(3)中的酶解液，获得第一过滤清液；将残渣以料液比为1：12的比例加入水，调节ph8，在37℃，超声频率为35khz的条件下，超声2小时；过滤，收集第二过滤清液；
(5)真空浓缩：将步骤(4)的第一过滤清液和第二过滤清液合并，通过真空旋转蒸发进行浓缩，使滤出液中的固含量提升至重量体积比为30，得浓缩液；
(6)对浓缩液超高压处理；压力为550mpa；
(7)将步骤(6)浓缩液进行喷雾干燥即得牡丹燕窝蛋白肽粉。
实施例3
一种牡丹燕窝复合蛋白肽的制备方法，包括下述的步骤：
(1)粉碎：将原料牡丹籽粕粉碎过80目筛，得牡丹籽粕粉，原料牡丹籽粕为牡丹种仁榨油之后的固体饼粕；将燕窝洗净、烘干、粉碎过80目筛，得燕窝粉；
(2)破壁：步骤(1)中牡丹籽粕粉和燕窝粉以质量比1：8混合，用超微气流粉碎分级机进行破壁，破壁时间为30min；
(3)步骤(2)处理后的牡丹籽粕粉和燕窝粉混合粉中加水，加水质量为混合粉的8倍，混合，再加入占混合粉重量0.03％的碱性蛋白酶，在50℃、ph8的条件下，超声频率为30khz的条件下，超声酶解1小时；然后灭酶；
(4)过滤(3)中的酶解液，获得第一过滤清液；将残渣以料液比为1：10的比例加入水，调节ph8，在50℃，超声频率为35khz的条件下，超声1小时；过滤，收集第二过滤清液；
(5)真空浓缩：将步骤(4)的第一过滤清液和第二过滤清液合并，通过真空旋转蒸发进行浓缩，使滤出液中的固含量提升至重量体积比为40，得浓缩液；
(6)对浓缩液超高压处理；压力为550mpa；
(7)将步骤(6)浓缩液进行喷雾干燥即得牡丹燕窝蛋白肽粉。
实施例4
一种牡丹燕窝复合蛋白肽的制备方法，包括下述的步骤：
(1)粉碎：将原料牡丹籽粕粉碎过80目筛，得牡丹籽粕粉，原料牡丹籽粕为牡丹种仁榨油之后的固体饼粕；将燕窝洗净、烘干、粉碎过80目筛，得燕窝粉；
(2)破壁：步骤(1)中牡丹籽粕粉和燕窝粉以质量比1：7混合，用超微气流粉碎分级机进行破壁，破壁时间为25min；
(3)步骤(2)处理后的牡丹籽粕粉和燕窝粉混合粉中加水，加水质量为混合粉的8倍，混合，再加入占混合粉重量0.03％的碱性蛋白酶，在40℃、ph8的条件下，超声频率为30khz的条件下，超声酶解1.2小时；然后灭酶；
(4)过滤(3)中的酶解液，获得第一过滤清液；将残渣以料液比为1：10的比例加入水，调节ph8，在40℃，超声频率为35khz的条件下，超声1.2小时；过滤，收集第二过滤清液；
(5)真空浓缩：将步骤(4)的第一过滤清液和第二过滤清液合并，通过真空旋转蒸发进行浓缩，使滤出液中的固含量提升至重量体积比为36，得浓缩液；
(6)对浓缩液超高压处理；压力为550mpa；
(7)将步骤(6)浓缩液进行喷雾干燥即得牡丹燕窝蛋白肽粉。
对比例1
一种牡丹蛋白肽的制备方法，包括下述的步骤：
(1)粉碎：将原料牡丹籽粕粉碎过80目筛，得牡丹籽粕粉，原料牡丹籽粕为牡丹种仁榨油之后的固体饼粕；
(2)破壁：步骤(1)中牡丹籽粕粉用超微气流粉碎分级机进行破壁，破壁时间为20min；
(3)步骤(2)处理后的牡丹籽粕粉中加水，加水质量为牡丹籽粕粉的8倍，混合，再加入占混合粉重量0.02％的碱性蛋白酶，在45℃、ph8的条件下，超声频率为30khz的条件下，超声酶解1.5小时；然后灭酶；
(4)过滤(3)中的酶解液，获得第一过滤清液；将残渣以料液比为1：10的比例加入水，调节ph8，在45℃，超声频率为35khz的条件下，超声1.5小时；过滤，收集第二过滤清液；
(5)真空浓缩：将步骤(4)的第一过滤清液和第二过滤清液合并，通过真空旋转蒸发进行浓缩，使滤出液中的固含量提升至重量体积比为35，得浓缩液；
(6)对浓缩液超高压处理；压力为550mpa；
(7)将步骤(6)浓缩液进行喷雾干燥即得牡丹蛋白肽粉。
对比例2
一种燕窝复合蛋白肽的制备方法，包括下述的步骤：
(1)粉碎：将燕窝洗净、烘干、粉碎过80目筛，得燕窝粉；
(2)破壁：步骤(1)中燕窝粉以质量比1：8混合，用超微气流粉碎分级机进行破壁，破壁时间为20min；
(3)步骤(2)处理后的燕窝粉中加水，加水质量为燕窝粉的8倍，混合，再加入占燕窝粉重量0.02％的碱性蛋白酶，在45℃、ph8的条件下，超声频率为30khz的条件下，超声酶解1.5小时；然后灭酶；
(4)过滤(3)中的酶解液，获得第一过滤清液；将残渣以料液比为1：10的比例加入水，调节ph8，在45℃，超声频率为35khz的条件下，超声1.5小时；过滤，收集第二过滤清液；
(5)真空浓缩：将步骤(4)的第一过滤清液和第二过滤清液合并，通过真空旋转蒸发进行浓缩，使滤出液中的固含量提升至重量体积比为35，得浓缩液；
(6)对浓缩液超高压处理；压力为550mpa；
(7)将步骤(6)浓缩液进行喷雾干燥即得燕窝蛋白肽粉。
对比例3
与实施例1相比，对比例3中，(5)之后直接进入(6)，未进行超高压处理；具体步骤如下：
(5)真空浓缩：将步骤(4)的第一过滤清液和第二过滤清液合并，通过真空旋转蒸发进行浓缩，使滤出液中的固含量提升至重量体积比为35，得浓缩液；
(6)将步骤(5)浓缩液进行喷雾干燥即得牡丹燕窝蛋白肽粉。
对比例4
将碱性蛋白酶替换为中性蛋白酶，并相应的酶解步骤的调节ph为7；其余和与实施例1相同；
对比例5
将碱性蛋白酶替换为酸性蛋白酶，并相应的酶解步骤的调节ph为5.5；其余和与实施例1相同；
实施例5
本发明的多肽清除dpph自由基能力和亚铁离子螯合能力的测定方法：
(1)清除dpph自由基能力：
将冷冻干燥后的本发明中的多肽用蒸馏水配制成质量浓度为8.0mg/ml的溶液，取2ml稀释液及0.2mmol/ldpph·50％甲醇溶液2ml加入同一具塞试管中摇匀，在室温下密闭静置30min，于517nm波长下测定吸光度。
清除率＝[1-(a1-a2)/a0]×100％，
式中，a1为样品溶液+dpph·50％甲醇溶液；
a2为样品溶液+50％甲醇溶液；a0为dpph·50％甲醇溶液+超纯水。
(2)亚铁离子螯合能力测定
分别取适量固体样品本发明的多肽和多肽亚铁螯合物1～1.5mg，加入干燥好的kbr做稀释剂，样品与溴化钾的比为1∶200，放进玛瑙研钵中，在玛瑙研钵里进行研磨，直至样品粒子成细小而均匀状态，再压至透明薄片，将薄片放入样品架，用傅立叶变换红外光谱仪在4000～400cm-1光谱范围进行扫描，得到两组光谱，进行定性分析。
螯合率的测定游离亚铁离子采用邻二氮菲法测定。螯合率按式进行计算:
螯合率(％)＝(亚铁离子总量－游离亚铁离子含量)/亚铁离子总量×100
(3)o2-·清除率(％)测定方法：
原理：邻苯三酚在弱碱条件下会发生自氧化反应，生成超氧阴离子(o2-·)和有色的中间产物，该有色中间产物在325nm处有一定有吸收峰，加入具有清除o2-·溶液后会抑制邻苯三酚自氧化速率，在325nm处的吸收峰减少；
对照管：取5mlph8.2的tris-hcl-edta缓冲溶液，加入3ml蒸馏水，混匀后在25℃水浴20min，取出后迅速加入5mol/l邻苯三酚(25℃水浴预热)0.2ml，再加入1.8ml蒸馏水(25℃水浴预热)，立即混匀，在325nm下读取吸光值为a，每隔30s读取a325，连续记录4min，做吸光度随时间变化的回归方程，其斜率为邻苯三酚自氧化速率△a0；
样品管：将多肽样品配制成20、40、60、80、100ug/ml的溶液，分别移取3ml样液代替蒸馏水，其余操作同上，邻苯三酚自氧化速率记为△a0；
调零管：5mlph8.2的tris-hcl-edta缓冲溶液加5ml蒸馏水；
按下式计算清除率：
清除率(％)＝(△a0-△a)/△a0×100
△a0：对照组邻苯三酚的自氧化的速率；
△a：多肽样品邻苯三酚自氧化的速率。
(4)·oh清除率(％)测定方法：
在终体积为3ml的反应体系中，含有0.75mmol邻二氮菲、0.15mol/l磷酸盐缓冲溶液(pbs，ph7.40)、0.75mmol/l硫酸亚铁溶液、0.01％双氧水和不同浓度的多肽溶液，混合均匀后，于37℃水浴60min，在波长536nm下读取吸光值。
按下式计算对·oh清除率(％)：
清除率i(％)＝(a-a损)/(a未-a损)×100
a损：加双氧水没有样品的反应管；
a未：既没有双氧水又没有样品的反应管；
a：既有双氧水又有样品的反应管；
调零管：1mlpbs加2ml蒸馏水。
表1实施例与对比例的多肽抗氧化能力测定结果
从以上表格中的数据可以看出，实施例1～4中，牡丹和燕窝复合多肽o2-·清除率、·oh清除率、dpph自由基清除率、fe2+螯合率较高；
对比例1、2中采用单一肽，单一肽的酶解及制备工艺与实施例1相同，其结果是，单一肽的抗氧化性能远远不如两者的复合；
对比例3中未采用超高压处理，其抗氧化性也有一定的影响；对比例4、5中，采用不同的酶来酶解获得复合多肽，所得的复合多肽的抗氧化性也不如实施例1。这说明酶解时酶的选择也会对最终肽的抗氧化性产生一定的影响。