一种Cap2结构5′帽子类似物及其制备方法和应用与流程

本申请是申请日为2020年08月20日、申请号为202010842263.2、发明名称为《一种新型cap2结构5′帽子类似物及其制备方法》的分案申请，申请人为深圳市瑞吉生物科技有限公司。本发明属于基因工程
技术领域：
，尤其涉及一种cap2结构5′帽子类似物及其制备方法和应用。
背景技术：
：翻译效率和免疫原性是mrna药物行使功能的两大关键因素。自体免疫蛋白如rig-i和ifit识别异常加帽的mrna，降低了外源mrna在细胞内的活性和半衰期，使得mrna药物在体内难以发挥作用。因此，优化mrna帽结构对于提高mrna的生物活性和降低免疫原性是至关重要的。目前在体外合成带帽的mrna有两种方法，第一种是mrna转录后使用牛痘病毒加帽酶对其进行加帽，产生带cap0或cap1的rna，这种加帽方法很高效，但是产量不稳定，价格也很昂贵。此外酶促加帽法不能产生cap2和m6am的帽子。第二种方法是转录过程中加入过量的帽结构类似物来进行加帽。截至目前，最常用的帽结构类似物是arca，使用arca可产生具有免疫原性的cap0，但是加帽效率只有70％。该方法的产量也比较低，每毫升转录反应体系最多制备1.5mgrna，转录产物具有很高的免疫原性。另一种叫做cleancap的新型共转录加帽的方法也被广泛采用。cleancap属于cap1，与arca使用二聚体(m7gpppg)启动t7转录不同，cleancap使用三聚体(m7gpppamg)启动t7转录。该方法的产量比较高，每毫升转录反应体系制备4mg加帽的rna，加帽效率可达90％，其转录产物的免疫原性低于arca。基于现有mrna合成体系中的帽结构类似物的加帽率低，单位合成体积内mrna产量低以及免疫原性高等缺点，从而研发了新型cap2帽结构类似物，既弥补了以上应用上的缺点，又大大提升了蛋白翻译效率。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种cap2结构5′帽子类似物及其制备方法和应用，本发明提供的cap2结构5′帽子类似物有更高的合成效率、更高的加帽效率、更低的免疫原性和更高的蛋白翻译效率。为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：本发明提供了一种cap2结构5′帽子类似物，所述cap2结构5′帽子类似物的分子式选自以下任一种；m7g(5′)ppp(5′)(2′omea)p(2′omeg)；m7g(5′)ppp(5′)(2′omeg)p(2′omeg)；m7g(5′)ppp(5′)(2′omec)p(2′omeg)；m7g(5′)ppp(5′)(2′omeu)p(2′omeg)；m7g(5′)ppp(5′)(2′omea)p(2′omea)；m7g(5′)ppp(5′)(2′omeg)p(2′omea)；m7g(5′)ppp(5′)(2′omec)p(2′omea)；m7g(5′)ppp(5′)(2′omeu)p(2′omea)；m7g(5′)ppp(5′)(2′omea)p(2′omec)；m7g(5′)ppp(5′)(2′omeg)p(2′omec)；m7g(5′)ppp(5′)(2′omec)p(2′omec)；m7g(5′)ppp(5′)(2′omeu)p(2′omec)；m7g(5′)ppp(5′)(2′omea)p(2′omeu)；m7g(5′)ppp(5′)(2′omeg)p(2′omeu)；m7g(5′)ppp(5′)(2′omec)p(2′omeu)；m7g(5′)ppp(5′)(2′omeu)p(2′omeu)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omea)p(2′omeg)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omeg)p(2′omeg)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omec)p(2′omeg)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omeu)p(2′omeg)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omea)p(2′omea)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omeg)p(2′omea)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omec)p(2′omea)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omeu)p(2′omea)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omea)p(2′omec)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omeg)p(2′omec)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omec)p(2′omec)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omeu)p(2′omec)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omea)p(2′omeu)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omeg)p(2′omeu)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omec)p(2′omeu)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omeu)p(2′omeu)。本发明还提供了上述技术方案所述的cap2结构5′帽子类似物的制备方法，包括以下步骤：1)将2′-o-methyl-atp、2′-o-methyl-gtp、2′-o-methyl-ctp和2′-o-methyl-utp分别溶解在无rna酶的水中，再分别与磷酸水解酶、2×reactionbuffer混合后进行孵育，得到2′-o-methyl-adp、2′-o-methyl-gdp、2′-o-methyl-cdp和2′-o-methyl-udp；2)将所述步骤1)得到的2′-o-methyl-adp、2′-o-methyl-gdp、2′-o-methyl-cdp和2′-o-methyl-udp分别溶解在无rna酶水中，再分别与7-methylguanosine、7-methyl-3′-o-methylguanosine、鸟苷转移酶、2×reactionbuffer混合后进行孵育，得到m7g(5′)ppp(5′)(2′omea/g/c/u)和3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omea/g/c/u)；3)将所述步骤2)得到的m7g(5′)ppp(5′)(2′omea/g/c/u)和3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omea/g/c/u)分别溶解在无rna酶水中，与t4rnaligase1混合后，再分别与2′-o-methyl-atp、2′-o-methyl-gtp、2′-o-methyl-ctp和2′-o-methyl-utp混合，再与2×t4rnaligasereactionbuffer混合后进行孵育，得到cap2结构5′帽子类似物。优选的，所述步骤1)2′-o-methyl-atp、2′-o-methyl-gtp、2′-o-methyl-ctp和2′-o-methyl-utp的摩尔与无rna酶的水的体积比均为1～30mmol:14μl。优选的，所述步骤1)无rna酶的水与磷酸水解酶、2×reactionbuffer的体积比为14:1:15。优选的，所述磷酸水解酶的酶活为50000u；所述2×reactionbuffer的组分包括：50mmtris-hcl、5mmkcl、1mmmgcl2、1mmdtt，ph值为8。优选的，所述步骤1)～3)孵育的温度分别为37℃，所述孵育的时间分别为1h。优选的，所述步骤2)无rna酶水与7-methylguanosine、7-methyl-3′-o-methylguanosine、鸟苷转移酶、2×reactionbuffer的体积比为11:10:10:1:22。优选的，所述步骤3)无rna酶水与t4rnaligase1、2×t4rnaligasereactionbuffer的体积比为11:1:22。优选的，所述2×t4rnaligasereactionbuffer的组分包括：60mmtris-hcl、20mmmgcl2、20mmdtt和2mmatp。优选的，所述t4rnaligase1的酶活为10000u。本发明还提供了上述技术方案所述的cap2结构5′帽子类似物在mrna合成中应用。本发明的有益效果：与现有帽结构类似物arca和cleancap相比，本发明中的32种cap2结构帽类似物具有更高的合成效率；与现有帽结构类似物arca和cleancap相比，本发明中的32种cap2结构帽类似物具有更高的加帽效率；与现有帽结构类似物arca和cleancap相比，本发明中的32种cap2结构帽类似物具有更低的免疫原性；与现有帽结构类似物arca和cleancap相比，本发明中的32种cap2结构帽类似物具有更高的蛋白翻译效率。附图说明图1为本发明所提供的帽结构类似物的结构通式；图2为本发明提供的32种cap2帽结构类似物应用于mrna合成有效增加mrna的合成效率，在每毫升合成体系中，采用cap2帽结构类似物的合成产物(4～6mg)明显高于arca(1.5mg)和cleancap(3.8mg)；图3为本发明提供的32种cap2帽结构类似物应用于mrna合成有效增加mrna的加帽效率，在同等合成条件下，采用cap2帽结构类似物的合成产物95％被加帽，高于arca的70％和cleancap的90％；图4为本发明提供的的32种cap2帽结构类似物应用于mrna合成有效降低免疫源性，采用cap2帽结构类似物的合成产物在细胞内的免疫原性仅为采用acra结构的相同mrna的9％-52％；图5为本发明提供的cap2帽结构类似物应用于mrna合成有效提高蛋白翻译效率，编码荧光素酶(luc)的mrna分别采用arca、cleancap和cap2帽结构类似物进行加帽，对比三种mrna在小鼠体内的表达强度，可以发现采用cap2帽结构类似物的lucmrna表达强度最高。具体实施方式本发明提供了一种cap2结构5′帽子类似物，所述cap2结构5′帽子类似物的分子式选自以下任一种；m7g(5′)ppp(5′)(2′omea)p(2′omeg)；m7g(5′)ppp(5′)(2′omeg)p(2′omeg)；m7g(5′)ppp(5′)(2′omec)p(2′omeg)；m7g(5′)ppp(5′)(2′omeu)p(2′omeg)；m7g(5′)ppp(5′)(2′omea)p(2′omea)；m7g(5′)ppp(5′)(2′omeg)p(2′omea)；m7g(5′)ppp(5′)(2′omec)p(2′omea)；m7g(5′)ppp(5′)(2′omeu)p(2′omea)；m7g(5′)ppp(5′)(2′omea)p(2′omec)；m7g(5′)ppp(5′)(2′omeg)p(2′omec)；m7g(5′)ppp(5′)(2′omec)p(2′omec)；m7g(5′)ppp(5′)(2′omeu)p(2′omec)；m7g(5′)ppp(5′)(2′omea)p(2′omeu)；m7g(5′)ppp(5′)(2′omeg)p(2′omeu)；m7g(5′)ppp(5′)(2′omec)p(2′omeu)；m7g(5′)ppp(5′)(2′omeu)p(2′omeu)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omea)p(2′omeg)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omeg)p(2′omeg)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omec)p(2′omeg)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omeu)p(2′omeg)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omea)p(2′omea)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omeg)p(2′omea)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omec)p(2′omea)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omeu)p(2′omea)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omea)p(2′omec)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omeg)p(2′omec)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omec)p(2′omec)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omeu)p(2′omec)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omea)p(2′omeu)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omeg)p(2′omeu)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omec)p(2′omeu)；3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omeu)p(2′omeu)。在本发明中，所述cap2结构5′帽子类似物共性是基于甲氧基修饰2′ome，对a\g\c\u以及m7g核苷进行甲氧基修饰2′omea或2′omeg或2′omec或2′omeu和3′-o-me-m7g。通过酶学反应形成cap2结构的帽子。本发明还提供了上述技术方案所述的cap2结构5′帽子类似物的制备方法，包括以下步骤：1)将2′-o-methyl-atp、2′-o-methyl-gtp、2′-o-methyl-ctp和2′-o-methyl-utp分别溶解在无rna酶的水中，再分别与磷酸水解酶、2×reactionbuffer混合后进行孵育，得到2′-o-methyl-adp、2′-o-methyl-gdp、2′-o-methyl-cdp和2′-o-methyl-udp；2)将所述步骤1)得到的2′-o-methyl-adp、2′-o-methyl-gdp、2′-o-methyl-cdp和2′-o-methyl-udp分别溶解在无rna酶水中，再分别与7-methylguanosine、7-methyl-3′-o-methylguanosine、鸟苷转移酶、2×reactionbuffer混合后进行孵育，得到m7g(5′)ppp(5′)(2′omea/g/c/u)和3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omea/g/c/u)；3)将所述步骤2)得到的m7g(5′)ppp(5′)(2′omea/g/c/u)和3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omea/g/c/u)分别溶解在无rna酶水中，与t4rnaligase1混合后，再分别与2′-o-methyl-atp、2′-o-methyl-gtp、2′-o-methyl-ctp和2′-o-methyl-utp混合，再与2×t4rnaligasereactionbuffer混合后进行孵育，得到cap2结构5′帽子类似物。本发明将2′-o-methyl-atp、2′-o-methyl-gtp、2′-o-methyl-ctp和2′-o-methyl-utp分别溶解在无rna酶的水中，再分别与磷酸水解酶、2×reactionbuffer混合后进行孵育，得到2′-o-methyl-adp、2′-o-methyl-gdp、2′-o-methyl-cdp和2′-o-methyl-udp。在本发明中，所述2′-o-methyl-atp、2′-o-methyl-gtp、2′-o-methyl-ctp和2′-o-methyl-utp采用常规市售产品即可。在本发明中，所述2′-o-methyl-atp、2′-o-methyl-gtp、2′-o-methyl-ctp和2′-o-methyl-utp的摩尔与无rna酶的水的体积比优选均为1～30mmol:14μl，更优选为10mmol:14μl。本发明对所述2′-o-methyl-atp、2′-o-methyl-gtp、2′-o-methyl-ctp和2′-o-methyl-utp的来源没有特殊限定，采用市售产品或者采用常规方法制备即可。在本发明中，所述无rna酶的水与磷酸水解酶、2×reactionbuffer的体积比优选为14:1:15。在本发明中，所述磷酸水解酶的酶活优选为50000u；所述2×reactionbuffer的组分优选包括：50mmtris-hcl、5mmkcl、1mmmgcl2、1mmdtt，ph值为8。在本发明中，所述孵育的温度优选为37℃，所述孵育的时间优选为1h。在本发明中，所述2′-o-methyl-atp、2′-o-methyl-gtp、2′-o-methyl-ctp和2′-o-methyl-utp优选经过hplc纯化后再溶解在无rna酶水中。本发明将得到的2′-o-methyl-adp、2′-o-methyl-gdp、2′-o-methyl-cdp和2′-o-methyl-udp分别溶解在无rna酶水中，再分别与7-methylguanosine、7-methyl-3′-o-methylguanosine、鸟苷转移酶、2×reactionbuffer混合后进行孵育，得到m7g(5′)ppp(5′)(2′omea/g/c/u)和3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omea/g/c/u)。在本发明中，所述无rna酶水与7-methylguanosine、7-methyl-3′-o-methylguanosine、鸟苷转移酶、2×reactionbuffer的体积比优选为11:10:10:1:22。在本发明中，所述鸟苷转移酶的酶活优选为50000u。在本发明中，所述2×reactionbuffer的组分优选包括：50mmtris-hcl、5mmkcl、1mmmgcl2、1mmdtt，ph值为8。本发明对所述7-methylguanosine和7-methyl-3′-o-methylguanosine的来源没有特殊限定，采用常规市售或者采用常规制备方法制备即可。在本发明中，所述孵育的温度优选为37℃，所述孵育的时间优选为1h。本发明将得到的m7g(5′)ppp(5′)(2′omea/g/c/u)和3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omea/g/c/u)分别溶解在无rna酶水中，与t4rnaligase1混合后，再分别与2′-o-methyl-atp、2′-o-methyl-gtp、2′-o-methyl-ctp和2′-o-methyl-utp混合，再与2×t4rnaligasereactionbuffer混合后进行孵育，得到cap2结构5′帽子类似物。在本发明中，所述m7g(5′)ppp(5′)(2′omea/g/c/u)和3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omea/g/c/u)优选进行hplc纯化后再溶解在无rna酶水中。在本发明中，所述无rna酶水与t4rnaligase1、2×t4rnaligasereactionbuffer的体积比优选为11:1:22。在本发明中，所述t4rna连接酶1的酶活优选为10000u。在本发明中，所述2×t4rnaligasereactionbuffer的组分优选包括：60mmtris-hcl、20mmmgcl2、20mmdtt和2mmatp。在本发明中，所述孵育的温度优选为37℃，孵育的时间优选为1h。本发明还提供了上述技术方案所述的cap2结构5′帽子类似物在mrna合成中应用。下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例11.将10mmol的2′-o-methyl-atp、2′-o-methyl-gtp、2′-o-methyl-ctp或者2′-o-methyl-utp分别溶解在无rna酶的水中，总体积为14μl。加入1μl(50000u)磷酸水解酶和15μl2×reactionbuffer(50mmtris-hcl；5mmkcl；1mmmgcl2；1mmdtt；ph8)，37℃下孵育1h，得到2′-o-methyl-adp、2′-o-methyl-gdp、2′-o-methyl-cdp和2′-o-methyl-udp。2.对以上所得2′-o-methyl-adp、2′-o-methyl-gdp、2′-o-methyl-cdp和2′-o-methyl-udp分别进行进行hplc纯化并溶解在无rna酶水中，总体积为11μl。3.将10μl(10mmol)7-methylguanosine、10μl(10mmol)7-methyl-3′-o-methylguanosine和1μl(50000u)鸟苷转移酶加入到步骤2得到的溶液中，加入22μl2×reactionbuffer(50mmtris-hcl；5mmkcl；1mmmgcl2；1mmdtt；ph8)，在37℃下孵育1h，得到m7g(5′)ppp(5′)(2′omea/g/c/u)或3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omea/g/c/u)。4.对步骤3所得的溶液进行hplc纯化并溶解在无rna酶水中备用，总体积为11μl。5.将10μl(10mmol)的2′-o-methyl-atp、2′-o-methyl-gtp、2′-o-methyl-ctp或者2′-o-methyl-utp分别与1μl(10000u)t4rna连接酶1(ssrnaligasenebm0437m)加入到步骤4所得溶液中，加入22μl2×t4rnaligasereactionbuffer(60mmtris-hcl(ph7.8at25℃),20mmmgcl2,20mmdttand2mmatp)，在37℃下孵育1h，得到新型cap2结构5′帽子类似物，分子式如下：1、m7g(5′)ppp(5′)(2′omea)p(2′omeg)；2、m7g(5′)ppp(5′)(2′omeg)p(2′omeg)；3、m7g(5′)ppp(5′)(2′omec)p(2′omeg)；4、m7g(5′)ppp(5′)(2′omeu)p(2′omeg)；5、m7g(5′)ppp(5′)(2′omea)p(2′omea)；6、m7g(5′)ppp(5′)(2′omeg)p(2′omea)；7、m7g(5′)ppp(5′)(2′omec)p(2′omea)；8、m7g(5′)ppp(5′)(2′omeu)p(2′omea)；9、m7g(5′)ppp(5′)(2′omea)p(2′omec)；10、m7g(5′)ppp(5′)(2′omeg)p(2′omec)；11、m7g(5′)ppp(5′)(2′omec)p(2′omec)；12、m7g(5′)ppp(5′)(2′omeu)p(2′omec)；13、m7g(5′)ppp(5′)(2′omea)p(2′omeu)；14、m7g(5′)ppp(5′)(2′omeg)p(2′omeu)；15、m7g(5′)ppp(5′)(2′omec)p(2′omeu)；16、m7g(5′)ppp(5′)(2′omeu)p(2′omeu)；17、3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omea)p(2′omeg)；18、3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omeg)p(2′omeg)；19、3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omec)p(2′omeg)；20、3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omeu)p(2′omeg)；21、3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omea)p(2′omea)；22、3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omeg)p(2′omea)；23、3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omec)p(2′omea)；24、3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omeu)p(2′omea)；25、3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omea)p(2′omec)；26、3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omeg)p(2′omec)；27、3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omec)p(2′omec)；28、3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omeu)p(2′omec)；29、3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omea)p(2′omeu)；30、3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omeg)p(2′omeu)；31、3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omec)p(2′omeu)；32、3′-o-me-m7g(5′)ppp(5′)(2′omeu)p(2′omeu)。实施例2实施例1制备的32种新型cap2帽结构类似物应用于mrna合成有效增加mrna的合成效率(4-6mg/ml)。实验方法：1.合成mrna前，先用noti线性化质粒，4℃酶切过夜。2.dna模板抽提。3.体外转录合成mrna，分别使用arca、cleancap和本发明中32种cap2作为帽结构，反应体系如表1：表1反应体系组分用量t710xreactionbuffer2μlt7atpsolution(75mm)2μlt7ctpsolution(75mm)2μlt7gtpsolution(75mm)2μlt7utpsolution(75mm)2μl线性化质粒模板<8μlt7enzymemix2μlarca/cleancap/cap22μlnuclease-free水至20μl37℃反应6小时。turbodnase消化15分钟。4.使用licl溶液对转录产物进行纯化，计算反应得率。结果如表2、图2，使用arca帽结构时，每毫升转录反应体系最高可制备1.5mgmrna，使用cleancap时，每毫升转录反应体系最高可制备3.8mgmrna，使用本发明中的cap2时，每毫升转录反应体系最高可制备至4～6mgmrna。表21mlmrna合成反应体系所得的终产物质量(mg)arcacleancap12345671.53.84.54.95.84.74.45.15.389101112131415165.34.86.04.74.95.15.54.64.21718192021222324254.74.14.44.64.84.64.54.74.1262728293031324.64.74.85.35.34.54.3实施例3实施例1制备的32种新型cap2帽结构类似物应用于mrna合成有效增加加帽效率(95-98％)。实验方法：将实施例1中的得到的不同帽结构的mrna分子进行酶切，可在液相色谱质谱分析实验中对加帽和未加帽的mrna分子比例进行测定。beads预处理：1、使用磁铁浓缩beads，吸去上清存储液，加入等体积的0.1mnaoh+0.05mnacl；2、吸去上清，用等体积0.1mnacl重悬beads，保持浓度不变；3、mrna与剪切标签退火，配置以下表3所示反应体系。表3反应体系10xrnasehreactionbuffer12μlrnasehprobe500pmolmrna100pmoltotal120μl梯度退火：95℃5min65℃2min55℃2min22℃hold4、剪切标签与beads结合beads经过15000g5min离心，去上清，加入120μl退火后的mrna和标签，室温孵育30min，期间轻轻震荡，确保充分结合；5、rnaseh剪切加入10μlrnaseh，37℃孵育3h。用磁石沉淀beads，弃上清。加入100μlwashingbuffer，充分混匀，磁石沉淀2min，弃上清。重复3次。diwater洗3次，6、rpph消化10unitsrpphinnebuffer2室温消化1小时7、diwater洗3次。8、洗脱吸去diwater，加入100μl预热至80℃的75％乙醇，温育3min，磁石沉淀3min，取上清，蒸发离心45min，至体积为10μl，重悬至50μl100medta/1％meoh，待lc-ms分析。9、lc-ms分析不同帽结构类似物合成的mrna加帽率。结果如表4和图3所示，使用arca帽结构时，转录产物加帽率最高为70％，使用cleancap时，转录产物加帽率最高为90％，使用本发明中的cap2时，转录产物加帽率最高可达95％。表4使用不同帽结构时mrna加帽率arcacleancap123456770％90％94.91％95.1％94.82％94.72％94.88％94.65％94.76％891011121314151694.79％94.73％94.93％95.2％94.86％94.77％94.82％94.83％94.84％17181920212223242594.91％94.98％95％94.42％94.55％94.83％94.65％94.72％94.8％2627282930313294.97％94.88％94.62％94.93％94.8％94.7％94.66％实施例4实施例1制备的32种新型cap2帽结构类似物应用于mrna合成有效降低免疫源性。实验方法：采用rna免疫共沉淀的方法，将胞内免疫蛋白tlr3、tlr7、tlr8和rig-1与其结合的rna一起进行免疫沉淀，最后对这些mrna进行实时定量pcr鉴定，其相对丰度与其免疫原性呈正比关系。实验方法：1.细胞收集培养人pbmc细胞至106个/孔，使用lipofectamine2000将5μgarca、cleancap和cap2帽结构的mrna转染细胞。24h后通过胰蛋白酶消化收集细胞并在pbs中重悬细胞，离心，收集细胞。2.细胞固定和裂解在细胞中加入固定液，15min加入甘氨酸终止固定，离心收集细胞。加入裂解液重悬细胞，冰孵育30min，4℃，2400g离心10min，收集上清。3.rna免疫沉淀将tlr3、tlr7、tlr8和rig-1的抗体(2～10μg)加入上清液中(6～10mg)，4℃轻柔搅动孵育2h。加入proteina/g磁珠(40μl)，4℃轻柔搅动孵育1h。4.洗去未结合的物质2500rpm离心30s沉淀磁珠，移去上清液，在500μlrip缓冲液中重悬磁珠。rip缓冲液中重复清洗共三次，随后在pbs中清洗一次。5.对免疫沉淀后rbp上结合的rna进行纯化在trizolrna提取试剂(1ml)中重悬磁珠，分离共沉淀的rna。使用不含核酸酶的水(20μl)洗脱rna。6.将rna逆转录(rt)为cdna，并根据mrna序列设计引物进行定量pcr分析，mrna免疫原性与磁珠沉淀的mrna拷贝数成正比。结果如表5和图4，本发明中的cap2帽结构mrna免疫原性明显低于arca和cleancap帽结构的mrna免疫原性。表5使用不同帽结构时mrna的胞内免疫原性，所有结果为相对于arca的相对值；表5实验结果实施例5实施例1制备的新型cap2帽结构类似物应用于mrna合成有效蛋白翻译效率。实验方法：将等量编码荧光素酶luciferase的mrna皮内注射于小鼠背部，24小时后尾静脉注射荧光素酶底物，发光强度与有效目的蛋白翻译率成比。实验结果如图5，本法明中的新型cap2帽结构类似物应用于mrna合成有效蛋白翻译效率明显高于arca和cleancap帽结构的蛋白翻译效率。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12