一种微液滴生物传感器的构建方法及其应用

1.本发明涉及高通量检测领域，尤其涉及一种微液滴生物传感器的构建方法及其应用。


背景技术：

2.氨基葡萄糖是一种广泛存在于自然界的小分子单糖，在医药和保健品等领域有广泛的应用。目前，工业上生产氨基葡萄糖主要采用化学水解法，此方法以虾蟹壳中的甲壳素为底物，使用强酸进行水解，反应条件苛刻、易造成环境污染且生产效率有限。随着绿色化学、环保制造的提倡，更多的研究开始关注绿色环保的微生物发酵技术，并以甲壳素、葡萄糖等廉价产品为底物，通过水解或合成等方式生产氨基葡萄糖。其中，己丁二糖脱乙酰酶可以将相对廉价的n
‑
乙酰氨基葡萄糖脱乙酰水解，得到氨基葡萄糖。
3.然而，现有的通过微生物胞外表达己丁二糖脱乙酰酶仍然存在表达量有限的问题；同时，己丁二糖脱乙酰酶自身的催化活性也需要提升。针对这两方面的问题，我们需要对表达己丁二糖脱乙酰酶重组菌株进行工程改造，以及对酶本身进行定向进化。然而，这两种改造方式往往会涉及到对上万乃至百万数量的突变进行筛选，挑选出具有更高氨基葡萄糖产量的重组菌株或者酶突变体。传统的基于96孔板的检测方法由于通量过低、试剂消耗量大等缺陷，已难以满足筛选的需求。
4.现有的高通量筛选方法主要有流式细胞筛选和液滴微流体筛选。在流式细胞筛选中，所有细胞处于共同的培养环境，无法区分来自不同细胞的胞外分泌物，因而不适用于检测氨基葡萄糖。而液滴微流体筛选通过制作液滴，在包裹细菌的同时提供了化学屏障，阻碍不同液滴间的化学交流，非常适合检测酶法生产氨基葡萄糖的产量并进行筛选，其筛选速度可以达到每秒数千液滴，远超于传统的96孔板实验。马富强(微液滴酶反应器超高通量筛选体系的建立，上海交通大学，2016)提出一种基于微流控芯片的“水
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油”微反应器双色荧光分选体系，但采用直接将产酶菌和检测菌包入液滴培养并检测荧光的方法难以保证比例，且检测菌可能影响产酶菌的生长。因此，仍需一种筛选通量高，可对大量突变和改造样本进行检测分析的方法。目前还没有研究报道可在液滴中有效检测氨基葡萄糖的方法。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明针对产酶菌株的工程改造和酶的定向进化过程中出现的大量突变体，提供一种适用于微液滴高通量筛选的生物传感器，实现对微液滴中氨基葡萄糖产量的检测，从而解决现有对氨基葡萄糖检测方法无法适用于液滴高通量筛选的问题。
6.本发明的一种微液滴生物传感器的构建方法，包括以下步骤：
7.(1)将产酶菌培养并稀释至浓度为3
‑
10百万个菌/ml，将稀释后的产酶菌包裹进微液滴中，培养，得到含有产酶菌的微液滴，其中，产酶菌为可表达己丁二糖脱乙酰酶的菌株；
8.(2)向检测菌培养液中加入n
‑
乙酰氨基葡萄糖，得到检测菌溶液，其中，检测菌为
只可以利用氨基葡萄糖激活生产荧光蛋白的菌株；
9.(3)将步骤(2)的检测菌溶液注射入步骤(1)的含有产酶菌的微液滴中培养，得到微液滴生物传感器，其中，按照单个微液滴中检测菌和产酶菌的数量比为1:0.8
‑
1.2注射检测菌。
10.本发明包裹产酶菌时采用平均10个微液滴仅有1个包有单菌的策略，保证单细胞包裹率，避免多细胞包裹。同时采用注射法注射检测菌，注射时，液滴流速和注射的水相(含有检测菌、底物、iptg诱导剂、培养基等)流速比约为1：0.8(由于液滴包含滴液内的的水和液滴外的油，此比例下水相混合比约为1：1)，可控制检测菌注射入微液滴的数量，培养过后的产酶菌与之有相近的细胞浓度，以此保证微液滴中产酶菌和检测菌的数量比约为1:1且相对稳定。微液滴生物传感器将产酶菌与检测菌共培养，再加入底物进行氨基葡萄糖浓度的检测。
11.进一步地，微液滴的直径为20
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50μm，优选为30μm。
12.进一步地，产酶菌为枯草芽孢杆菌。
13.进一步地，检测菌为枯草芽孢杆菌。
14.进一步地，检测菌由以下步骤构建得到：
15.敲除bacillus subtilis 168的基因gamr、nagb和gama，将敲除后的基因转入质粒phtcsg2，得到重组表达载体，转入宿主细胞，得到检测菌。
16.进一步地，注射检测菌溶液的具体步骤为：
17.配制含有检测菌、底物n
‑
乙酰氨基葡萄糖、诱导剂iptg以及tb培养基的溶液，收集溶液于注射器中，通过液滴注射芯片将检测菌溶液注射进含有产酶菌的液滴中。
18.进一步地，在步骤(1)中，稀释后的产酶菌包裹进微液滴后培养8
‑
36h，优选为24h。目的是使产酶菌达到与检测菌相应的细胞浓度。
19.进一步地，在步骤(2)中，检测菌溶液中n
‑
乙酰氨基葡萄糖的浓度为8
‑
12g/l。检测菌生产的荧光蛋白与氨基葡萄糖浓度呈线性相关，线性响应范围约为0
‑
1g/l，注射的底物浓度在此范围内，保证注射后底物浓度为4
‑
6g/l，浓度不至于过高导致荧光达到上限或过低导致荧光信号区分不明显。
20.进一步地，在步骤(3)中，培养18
‑
30h，优选为24h。目的是保证检测菌能够表达与氨基葡萄糖浓度相应数量的荧光蛋白。
21.进一步地，在步骤(1)
‑
(3)中，于30
‑
40℃培养，优选为37℃。
22.本发明的一种上述构建方法构建的微液滴生物传感器。
23.本发明要求保护上述微液滴生物传感器在筛选己丁二糖脱乙酰酶的重组菌株或突变体，或在氨基葡萄糖高通量检测中的应用。
24.本发明的产酶菌分解底物n
‑
乙酰氨基葡萄糖得到产物氨基葡萄糖，检测菌可以且只可以利用产物氨基葡萄糖，而无法利用作为底物的n
‑
乙酰氨基葡萄糖，从而激活检测菌生产荧光蛋白，根据微液滴生物传感器的荧光强度进行高通量筛选或检测，氨基葡萄糖浓度越高，荧光强度越强。
25.进一步地，通过液滴微流体高通量筛选系统进行筛选，具体步骤为：
26.将培养过后的含有产酶菌、检测菌及底物的微液滴重新注入筛选芯片，进行高通量微液滴筛选。
27.借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
28.(1)本发明首次提出在微液滴中进行氨基葡萄糖的检测，实现了高通量检测或筛选，可极大提升产酶菌株的改造和对酶定向进化的效率。
29.(2)本发明的微液滴生物传感器在高通量筛选或检测的基础上，可以较好地响应不同浓度的氨基葡萄糖以及氨基葡萄糖不同产量的产酶菌，从而实现氨基葡萄糖的浓度检测以及高产菌的筛选。
30.上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
31.为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
32.图1为实施例1制备的生物传感器对氨基葡萄糖响应的验证结果；
33.图2为实施例1制备的生物传感器对氨基葡萄糖高产菌(正向突变)的验证结果。
具体实施方式
34.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
35.实施例1单细菌液滴包裹、注射与筛选
36.1、单细菌包裹
37.将产酶菌(枯草芽孢杆菌)于tb(terrific broth)培养基中培养，用新鲜tb培养基重悬、稀释至od
600
＝0.02，装入注射器中。使用宽度高度均为25μm的液滴制作微流体芯片制作液滴。其中，油相流速为8μl/min，水相(细菌)流速为3μl/min。制作出的液滴直径约为30μm，大小均一，其中约10％液滴含有单个产酶菌，几乎没有多个产酶菌共处于一个液滴中。之后，收集液滴，于37℃摇床培养24h。
38.2、液滴注射
39.将检测菌(枯草芽孢杆菌)于tb培养基中培养，用新鲜tb培养基重悬、并加入终浓度为10g/l的底物glcnac和2x浓度的iptg诱导剂，使得重悬浓缩后检测菌的浓度为od
600
＝5，装入注射器中。液滴注射选取高度宽度均为30μm的微流体芯片。其中，油相流速为3μl/min，液滴(含产酶菌)流速为1μl/min，注射水相(含检测菌)流速为0.8μl/min，注射电压信号为100v
pp
，10khz，正弦波。收集注射后的液滴，于37℃摇床培养24h。
40.3、液滴筛选
41.将培养后的液滴注射入筛选芯片进行筛选。其中，油相流速为10μl/min，液滴流速为1μl/min，筛选电压信号为1000v
pp
，10khz，触发时间为10ms，筛选阈值可根据荧光信号强度和实验需求进行调节。筛选后的液滴收集到tb培养基中，使用全氟己基乙醇破乳，释放细胞于培养基中，即可得到筛选所得细胞。
42.实施例1中，筛选通量约为每秒400液滴，远高于传统基于96孔板的检测方法(每使用1个96孔板，通量约为100液滴)。
43.实施例2验证生物传感器的有效性
44.制作两批液滴：一批作为实验组，包裹有可高效表达己丁二糖脱乙酰酶的菌株(产酶菌)；另一批作为对照组，仅包裹培养基(空液滴)。为验证检测菌对不同浓度氨基葡萄糖的响应，首先对空液滴注射检测菌和底物，同时额外注射氨基葡萄糖标准品，并使其注射后的最终浓度分别为0、0.2g/l和0.5g/l。在培养24h后于荧光显微镜下拍照测量荧光强度，其结果如图1所示。
45.图1结果表明，在0
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0.5g/l的范围之内，检测菌表达的绿色荧光信号强度与氨基葡萄糖浓度呈线性关系，证明其可以很好的响应不同浓度的氨基葡萄糖。
46.实施例4对氨基葡萄糖高产菌的筛选
47.为模拟对氨基葡萄糖高产菌的筛选，对包有产酶菌的液滴进行检测菌注射时也额外添加了0、0.2和0.5g/l的氨基葡萄糖，以考察检测菌能否检测出比现有产酶菌生产更多氨基葡萄糖的菌株。结果如图2所示。
48.由图2可见，本产酶菌在液滴内的氨基葡萄糖约为0.5g/l，而在额外添加0
‑
0.5g/l的氨基葡萄糖之后，检测菌表达的绿色荧光信号强度仍与氨基葡萄糖浓度呈线性关系，实际线性范围至少为0
‑
1g/l。此实验证明了检测菌可以有效检测产酶菌的氨基葡萄糖产量，并且对高于现有产酶菌的氨基葡萄糖浓度仍可以有效检测。由此可见，本发明提出的检测方法，可以很好的适用于针对氨基葡萄糖的液滴高通量筛选系统。
49.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。