一种鱼精蛋白复合材料及其制备方法和应用

1.本发明涉及生物抗菌领域，更具体地，涉及一种鱼精蛋白复合材料及其制备方法和应用。


背景技术：

2.病原微生物如细菌对人类的生产及生活造成诸多危害和影响。特别是近几年，由有害细菌引发的全球性微生物灾害事件频频发生。因此，如何有效控制有害微生物传染和传播已经成为专家学者的重点研究课题。抗生素虽然具有强大的杀菌抑菌作用，但其因滥用而造成的耐药和环境污染已成为现今生物医药界的突出问题和难题。因此，研究开发新型高效又安全的抗菌剂成为目前亟待解决的问题。设计一种具有多重抗菌活性的复合材料，对于日常抗菌需求及感染创面治疗等方面是非常重要的。
3.鱼精蛋白是一种具有多聚阳离子特性的蛋白，含有较多的精氨酸，具有较强的碱性和正电性，分子量约为4.2kda。其能够作用于细菌细胞壁的肽聚糖部分，具有优秀的抗菌性，在生物医用材料方面具有重要的应用前景。
4.然而，现有的鱼精蛋白抗菌方法主要是把鱼精蛋白直接进行使用，存在产品用量大、成本高等问题，而且在使用过程中，鱼精蛋白容易发生流失，导致产品的抗菌持效性下降。基于此，如何开发一种成本低廉，制备方法简单，同时抗菌组分可以长效留存的抗菌材料是本领域亟待解决的技术难题之一。


技术实现要素：

5.本发明旨在克服上述现有技术的至少一种缺陷(不足)，提供一种鱼精蛋白复合材料，以提高鱼精蛋白的稳定性，减少其在使用过程中流失而导致抗菌效果下降。
6.本发明采取的技术方案是，提供一种鱼精蛋白复合材料，所述鱼精蛋白复合材料包括鱼精蛋白和物理抗菌性材料，所述物理抗菌性材料外侧包覆有所述鱼精蛋白；所述物理性抗菌材料为氧化石墨烯或碳纳米管的一种或两种；所述鱼精蛋白为纯鱼精蛋白、硫酸鱼精蛋白、盐酸鱼精蛋白或经酶切后的鱼精蛋白片段的一种或多种。
7.进一步地，所述物理抗菌性材料外侧与包覆的所述鱼精蛋白共价键合。
8.优选地，所述鱼精蛋白复合材料为膜状。
9.优选地，所述鱼精蛋白复合材料还包括与包覆在所述物理抗菌性材料外侧的所述鱼精蛋白交联的凝胶成胶剂，所述凝胶成胶剂为海藻酸钠、氧化海藻酸钠、单宁酸、壳聚糖、纤维素、聚合物、明胶、胶原或透明质酸的一种或多种；所述鱼精蛋白复合材料为凝胶状。
10.优选地，所述凝胶成胶剂与所述鱼精蛋白的交联作用包括离子交联、共价交联、静电交联。
11.优选地，所述鱼精蛋白的来源包括并不限于鲑鱼、鳟鱼、鲱鱼等。
12.在本技术方案中，将鱼精蛋白包覆在所述物理抗菌性材料外侧通过共价组装，复合形成大尺寸的固相材料，而所述物理抗菌性材料不限于氧化石墨烯或碳纳米管，可根据
实际情况而合理替换，与普通鱼精蛋白相比，通过鱼精蛋白与物理抗菌性材料可作为还原剂发生还原反应，使二者之间产生共价作用，并形成协同作用，从而增强了鱼精蛋白的稳定性，避免其在使用过程中流失，从而增加了其持续使用时间和保存时间，同时，鱼精蛋白与物理抗菌性材料在复合时此外，当所述鱼精蛋白复合材料应用于创面治疗时，除了可对创面起抗菌作用外，鱼精蛋白在创面上还会产生如富含精氨酸的氨基酸序列等的降解产物，对创面产生促愈效果。
13.本发明还提供上述膜状鱼精蛋白复合材料的制备方法，包括以下步骤：
14.s1将鱼精蛋白加入无菌水中搅拌至完全溶解，获得鱼精蛋白溶液；
15.s2将物理性抗菌材料加入无菌水中并超声搅拌至完全溶解，获得物理性抗菌材料溶液；
16.s3将步骤s1制得的鱼精蛋白溶液和步骤s2制得的物理性抗菌材料溶液混合后加热得复合混悬液；
17.s4对步骤s3制得的复合混悬液进行抽滤，将抽滤所得的薄膜干燥后与底膜分离，得到膜状的鱼精蛋白复合材料。
18.进一步地，所述步骤s1中所述鱼精蛋白溶液中鱼精蛋白的浓度为0.5g/l～10g/l。
19.进一步地，所述步骤s2中所述物理性抗菌材料溶液的浓度为0.5g/l～10g/l。
20.进一步地，所述步骤s3具体为将步骤s1制得的鱼精蛋白溶液和步骤s2制得的物理性抗菌材料溶液按10:1～1:100的体积比混合后，在ph值为1～14的条件下，在30～100℃下加热10～1000min得复合混悬液。
21.进一步地，所述膜状的鱼精蛋白复合材料的大小根据所述抽滤器的大小控制；所述膜状的鱼精蛋白复合材料的直径为25～300mm。
22.优选地，所述膜状的鱼精蛋白复合材料的直径为50mm。
23.进一步地，所述膜状的鱼精蛋白复合材料的厚度通过用于抽滤的复合混悬液的用量控制；所述膜状的鱼精蛋白复合材料的厚度为10nm～1cm。
24.优选地，所述膜状的鱼精蛋白复合材料的厚度为2μm。
25.本发明还提供上述凝胶状的鱼精蛋白复合材料的制备方法，包括以下步骤：
26.s1将鱼精蛋白加入无菌水中搅拌至完全溶解，获得鱼精蛋白溶液；
27.s2将物理性抗菌材料加入无菌水中并超声搅拌至完全溶解，获得物理性抗菌材料溶液；
28.s3将步骤s1制得的鱼精蛋白溶液和步骤s2制得的物理性抗菌材料溶液混合后加热得复合混悬液；
29.s4将步骤s3制得的复合混悬液加入到凝胶成胶剂并倒入凝胶模具后，所述凝胶成胶剂的交联作用使所述复合混悬液形成凝胶状的鱼精蛋白复合材料；所述凝胶成胶剂的质量分数为0.1％～50％。
30.进一步地，所述步骤s1中所述鱼精蛋白溶液中鱼精蛋白的浓度为0.5g/l～10g/l。
31.进一步地，所述步骤s2中所述物理性抗菌材料溶液的浓度为0.5g/l～10g/l。
32.进一步地，所述步骤s1和步骤s2均在常温常压下进行。
33.进一步地，所述步骤s3具体为将步骤s1制得的鱼精蛋白溶液和步骤s2制得的物理性抗菌材料溶液按10:1～1:100的体积比混合后，在ph值为1～14的条件下，在30～100℃下
加热10～1000min得复合混悬液。
34.进一步地，在步骤s3中，所述凝胶成胶剂为海藻酸钠、氧化海藻酸钠，所述海藻酸钠、氧化海藻酸钠通过加入氯化钙溶液作为交联剂产生交联作用使所述复合混悬液形成凝胶状的鱼精蛋白复合材料。
35.进一步地，在步骤s3中，所述凝胶成胶剂为单宁酸，所述单宁酸通过加入铁离子作为交联剂产生交联作用使所述复合混悬液形成凝胶状的鱼精蛋白复合材料。
36.进一步地，在步骤s3中，所述凝胶成胶剂为壳聚糖，所述壳聚糖通过加入戊二醛等多醛作为交联剂产生交联作用使所述复合混悬液形成凝胶状的鱼精蛋白复合材料。
37.进一步地，在步骤s3中，所述凝胶成胶剂为纤维素，所述纤维素通过加入酸性溶液作为交联剂或冷冻产生交联作用使所述复合混悬液形成凝胶状的鱼精蛋白复合材料。
38.优选地，所述交联剂的质量分数为0.1％～10％。
39.优选地，所述凝胶成胶剂与所述交联剂以20:1～1:10的体积比混合产生交联作用；或向所述凝胶模具滴入所述交联剂产生交联作用至复合混悬液形成凝胶状的鱼精蛋白复合材料。
40.进一步地，在步骤s3中，所述凝胶成胶剂为聚合物、明胶、胶原或透明质酸，所述聚合物、明胶、胶原或透明质酸通过自身的交联作用形成凝胶状的鱼精蛋白复合材料。
41.进一步地，所述凝胶模具为任意形状，如圆形、长条形。
42.在本技术方案中，所述鱼精蛋白溶液和物理性抗菌材料溶液混合后加热后发生还原反应，使所述物理抗菌性材料外侧与包覆的所述鱼精蛋白共价键合组装，反应后不需再进行组装即可直接进行抽滤或交联获得即可大尺寸的固相复合材料，而且在使用所述复合混悬液制备复合材料时，可根据实际需要选择抽滤或凝胶交联的方法，并通过选择不同的复合混悬液用量、抽滤器尺寸或凝胶模具以灵活调控制得的复合材料的尺寸和内部结构，进而实现不同的功能，如需要将其用于大面积开放性创伤伤口抗菌时，可制备大尺寸抗菌膜材料作为伤口敷料使用，当其用于日常物品的抗菌时，亦可将这种复合材料贴在任意固体表面进行抗菌的修饰。
43.上述鱼精蛋白复合材料在抗菌领域中的应用。
44.进一步地，所述鱼精蛋白复合材料用于日常抗菌以及创面抗菌治疗。
45.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
46.(1)本发明的鱼精蛋白复合材料为大尺寸的固相材料，通过鱼精蛋白与物理抗菌性材料进行共价键合增强鱼精蛋白的稳定性，从而避免其在使用时流失降低抗菌性，提高其持续使用时间，并能提高其保存时间至1年以上，降低了鱼精蛋白的使用成本；
47.(2)本发明的鱼精蛋白复合材料通过鱼精蛋白和物理抗菌性材料在复合时可作为还原剂发生还原反应，使二者之间产生共价作用；
48.(3)本发明的鱼精蛋白复合材料可根据实际需要控制其尺寸、结构和功能，不涉及有机溶剂使用，生物相容性良好；
49.(4)本发明的鱼精蛋白复合材料将具有生物抗菌功能的鱼精蛋白与物理抗菌性材料复合，形成协同作用，可提高其抗菌效果，同时，复合材料的降解产物还能产生一定促愈效果，因此该复合材料更适合用于日常抗菌以及创面抗菌治疗；
50.(5)本发明的制备方法通过加热使鱼精蛋白与物理抗菌性材料发生还原反应后共
价键合，反应后无需再组装即可直接制成各种尺寸、结构，合成步骤简单，可制备大尺寸的固相鱼精蛋白复合材料。
附图说明
51.图1为实施例1制备的膜状鱼精蛋白复合材料的扫描电镜图像。
52.图2为实施例2制备的凝胶状状鱼精蛋白复合材料的照片。
53.图3为实施例3制备的氧化石墨烯膜的扫描电镜图像。
54.图4为实施例1制备的膜状鱼精蛋白复合材料的抗菌实验数据图。
具体实施方式
55.为了让本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明作进一步阐述。
56.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
57.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
58.实施例1
59.本实施例提供一种膜状的鱼精蛋白复合材料，其制备方法包括以下步骤：
60.s1在常温常压下将一定质量的鱼精蛋白加入无菌水中搅拌至完全溶解，配置得浓度为10g/l的鱼精蛋白溶液；
61.s2在常温常压下将一定质量的氧化石墨烯粉末加入无菌水中并超声搅拌至完全溶解，配置得2g/l物理性抗菌材料溶液；
62.s3在常温常压下将步骤s1制得的鱼精蛋白溶液和步骤s2制得的物理性抗菌材料溶液按1:10的体积比混合后，在ph值为7的条件下，将混合后的溶液在60℃下加热200min后得复合混悬液；
63.s4对步骤s3制得的复合混悬液进行抽滤，将抽滤所得的薄膜干燥后与底膜分离，得到膜状的鱼精蛋白复合材料，所述膜状鱼精蛋白复合材料的直径为50mm，厚度为2μm。
64.实施例2
65.本实施例提供一种凝胶状的鱼精蛋白复合材料，其制备方法包括以下步骤：
66.s1在常温常压下将一定质量的鱼精蛋白加入无菌水中搅拌至完全溶解，配置得浓度为10g/l的鱼精蛋白溶液；
67.s2在常温常压下将一定质量的氧化石墨烯粉末加入无菌水中并超声搅拌至完全溶解，配置得2g/l物理性抗菌材料溶液；
68.s3在常温常压下将步骤s1制得的鱼精蛋白溶液和步骤s2制得的物理性抗菌材料溶液按1:10的体积比混合后，在ph值为7的条件下，将混合后的溶液在60℃下加热200min后得复合混悬液；
69.s4取10ml步骤s3制得的复合混悬液与0.1g海藻酸钠混合后倒入圆形凝胶模具后，加入2ml 4％氯化钙溶液，所述凝胶成胶剂的交联作用使所述复合混悬液形成凝胶状的鱼精蛋白复合材料。
70.制得的凝胶状的鱼精蛋白复合材料的照片如图2所示。
71.实施例3
72.本实施例提供一种氧化石墨烯膜，其制备方法包括以下步骤：
73.s1在常温常压下将一定质量的氧化石墨烯粉末加入无菌水中并超声搅拌至完全溶解，配置得2g/l物理性抗菌材料溶液；
74.s2对步骤s1制得的物理性抗菌材料溶液进行抽滤，将抽滤所得的薄膜干燥后与底膜分离，得到氧化石墨烯膜，所述氧化石墨烯膜的直径为50mm，厚度为2μm。
75.本实施例采用扫描电子显微镜对实施例1的膜状鱼精蛋白复合材料和本实施例制备的氧化石墨烯膜进行观察，图1为膜状鱼精蛋白复合材料的扫描电镜图像，图3为氧化石墨烯膜的扫描电镜图像。
76.通过图1和图3的对比可见，与未复合的氧化石墨烯膜相比，实施例1的膜状鱼精蛋白复合材料表面更加粗糙，氧化石墨烯的片层结构变得更加模糊，其厚度也相应增加了，表明在该复合材料中，鱼精蛋白与氧化石墨烯发生了共价相互作用。同时，本实施例制备的氧化石墨烯膜为棕色，而实施例1的膜状鱼精蛋白复合材料为黑色，同样可表明鱼精蛋白通过共价相互作用成功复合到氧化石墨烯表面。
77.实施例4
78.本实施例对实施例1所制备的膜状鱼精蛋白复合材料进行抗菌实验，以测试其抗菌效果。所述抗菌实验具体包括以下步骤：
79.s1将冷冻保存的菌种划线接种至平板培养基，并在37℃下培养24h，得到活化后的菌种；
80.s2在步骤s1的平板培养基上挑单菌落并接种至100ml的液体培养基，在37℃下以200r/min的转速摇床培养过夜，制得菌液，用pbs缓冲液洗涤制得的菌液后，离心收集菌体，再用pbs缓冲液稀释菌体，得稀释菌液；
81.s3取1μl步骤s2制得的稀释菌液滴在实施例1所制备的膜状鱼精蛋白复合材料上，暴露不同时间后，用pbs缓冲液冲洗膜状鱼精蛋白复合材料，并收集洗涤液；
82.s4向灭菌的平板内倾注20ml平板培养基，水平静置所述平板至培养基凝固，然后将0.1ml步骤s3的洗涤液接种到培养基表面，涂布均匀后置于培养箱中，并在37℃下培养过夜；
83.s5将步骤s4培养后的培养基取出，对菌落数数量进行观察并计数。
84.本实施例设置了三个实验组，在步骤s3中的暴露时间分别为0、10min、30min，其余步骤操作均一致。抗菌实验的结果如图4所示，由图4可知，稀释菌液菌液未在膜状鱼精蛋白复合材料的表面暴露时，细菌的存活率为1，稀释菌液在膜状鱼精蛋白复合材料的表面暴露了10min后，细菌存活率为1.5％，稀释菌液在膜状鱼精蛋白复合材料的表面暴露了30min后，细菌存活率仅为0.01％，体现出制备的鱼精蛋白复合材料与直接使用鱼精蛋白相比，其抗菌效果得到提高，这是由于鱼精蛋白与物理抗菌性材料氧化石墨烯复合形成了协同作用，提高其抗菌效果，同时，还二者之间的共价键合增强了鱼精蛋白的稳定性，从而保证了在抗菌过程中足够量的鱼精蛋白可以长效留存，进一步提高了复合材料的抗菌效果。
85.显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。