一种鉴定小麦叶片绒毛基因的分子标记、引物组和应用

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种鉴定小麦叶片绒毛新基因的分子标记、引物组和应用。

背景技术：

小麦叶片的主要功能是进行光合作用，制造有机物，同时也是小麦呼吸和蒸腾的重要器官。小麦的叶片有5种，有盾片（退化叶）、胚芽鞘（不完全叶）、分蘖鞘（不完全叶）、壳（变态叶）和绿叶（完全叶）。我们通常说的叶片是指发育完全的绿叶。这种叶由叶身（叶片）、叶枕、叶鞘、叶耳和叶舌组成。叶片与叶鞘的连接处叫叶枕。叶鞘着生在茎节上，包围节间的全部或一部分，主要功能是加强茎秆强度，也可进行光合作用。叶舌位于叶片与叶鞘的交界处，主要功能是防止雨水、灰尘和害虫侵入叶鞘；叶耳很小，着生在叶片基部左右两侧，环抱茎秆，有的品种没有叶耳。叶耳有红、紫、绿等不同颜色，可作为鉴定品种的标志。小麦叶片数因品种和环境及栽培措施有一定变化，但在一定地区都有其最适的主茎叶数，并且相对而言比较稳定。有的品种叶片上有绒毛，小麦叶片绒毛是一个重要的与抗逆相关的表型性状，有叶片绒毛的小麦材料具有很多抗逆性，比如抗旱，抗虫，抗紫外线损伤等。目前，栽培小麦品种的叶片绒毛很少，几乎没有绒毛。

现有技术中对叶片绒毛基因的分子遗传机理研究较少,特别是有关基因的定位等分子基础研究尚不深入；关于鉴定小麦绒毛基因的分子标记尚未见报道，也没有利用分子标记辅助选择对小麦绒毛的育种选择也未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种鉴定小麦叶片绒毛新基因的分子标记、引物组和应用。

为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供的一种鉴定小麦叶片绒毛基因的分子标记，该基因定位在地方品种白毛麦的7bs染色体上，命名为qlp.saas-7bs，是一个小麦叶片绒毛相关的新基因位点；根据中国春参考基因组（iwgscrefseqv2.1）比对分析，所述qlp.saas-7bs定位区间为ax-86175290（物理位置为61106266-61106336b）和ax-86172908（物理位置为60629908-60629979b）之间的0.48mb区间内；利用qlp.saas-7bs位点侧翼探针ax-86175290和ax-86172908开发两对kasp特异连锁标记，所述连锁标记为kasp-ax-86175290的kasp标记和kasp-ax-86172908的kasp标记；所述标记kasp-ax-86175290和kasp-ax-86172908的核苷酸序列分别为，

kasp-ax-86175290：

fam：gaaggtgaccaagttcatgcttgcacaaccagtcagcagaaa

hex：gaaggtcggagtcaacggatttgcacaaccagtcagcagaag

com：tcgggatattgaattcttgagctac；

kasp-ax-86172908：

fam:gaaggtgaccaagttcatgcttgcagtgaagttattaacacc，

hex：gaaggtcggagtcaacggatttgcagtgaagttattaacact，

com：atatgcagtacagatctttcacag。

进一步的，所述qlp.saas-7bs两翼的snp探针分别为ax-86175290和ax-86172908，所述kasp-ax-86172908和kasp-ax-86175290是分别根据ax-86175290和ax-86172908的探针序列进行设计，ax-86175290和ax-86172908的探针序列分别为，

ax-86175290:ggctagtgctgtaaatgcacaaccagtcagcagaa[a/g]cgtaaatggtgtagctcaagaattcaatatcccga；

ax-86172908:

tctaaatgggagacctgcagtgaagttattaacac[c/t]aactggaaggactgtgaaagatctgtactgcatat。

发明提供的鉴定小麦叶片绒毛基因的分子标记的制备方法，包括下述步骤：

（1）构建了高代重组自交系遗传群体

采用普通栽培的无绒毛小麦川麦104与具有高密度叶片绒毛的小麦地方小麦品种白毛麦构建高代重组自交系遗传群体f8代；

（2）构建遗传连锁图谱

利用50k高密度snp芯片对群体进行了全基因组扫描，构建遗传连锁图谱，结合群体各株系的叶片绒毛表型性状，定位到一个与叶片绒毛性状紧密连锁的基因qlp.saas-7bs；

（3）遗传定位

对白毛麦叶片绒毛基因进行了遗传定位，该基因定位在白毛麦的7bs染色体上，命名为qlp.saas-7bs，根据中国春参考基因组（iwgscrefseqv2.1）比对分析，其探针区间为ax-86175290（物理位置为61106266-61106336b）和ax-86172908（物理位置为60629908-60629979b），该位点位于7bs染色体上，该基因位点的物理距离为0.48mb；

（4）获得鉴定小麦叶片绒毛基因的分子标记

利用qlp.saas-7bs位点侧翼探针ax-86175290和ax-86172908开发两对kasp特异连锁标记，所述连锁标记为kasp-ax-86175290的kasp标记和kasp-ax-86172908的kasp标记。

进一步的，所述步骤（3）中，对白毛麦叶片绒毛基因进行遗传定位的方法为qtl定位方法。

本发明提供的用于鉴定上述分子标记的引物组，检测基因qlp.saas-7bs的kasp功能标记引物有两组，分别如下：

第一组，kasp-ax-86175290引物序列如下：

fam:gaaggtgaccaagttcatgcttgcacaaccagtcagcagaaa，

hex：gaaggtcggagtcaacggatttgcacaaccagtcagcagaag，

com：tcgggatattgaattcttgagctac；

第二组，kasp-ax-86172908引物序列如下：

fam:gaaggtgaccaagttcatgcttgcagtgaagttattaacacc，

hex：gaaggtcggagtcaacggatttgcagtgaagttattaacact，

com：atatgcagtacagatctttcacag。

进一步的，根据qlp.saas-7bs两翼探针的snp位置的5’端设计了竞争性的fam和hex正向引物，在3’端设计了通用引物，引物序列在5’端分别添加不同的荧光探针标记基团，fam的荧光探针序列为gaaggtgaccaagttcatgct，hex的荧光探针序列为gaaggtcggagtcaacggatt。

本发明提供的一种鉴定小麦叶片绒毛基因的方法，包括下述步骤：

（1）提取待鉴定的小麦基因组dna；

（2）应用上述设计的kasp标记kasp-ax-86175290和kasp-ax-86172908引物对步骤（1）提取的dna进行pcr扩增；

进一步的，所述步骤（2）中，pcr扩增的方法为：先配置kasp基因分型混合液，将配置的kasp基因分型混合液加到步骤（1）中已分装有dna的pcr反应板上，然后将pcr反应板密封后离心；最后进行pcr循环反应，所用仪器为荧光定量pcr仪；

pcr反应体系：dna2μl；kaspmastermix5μl；kasp引物组3μl，且引物组3条引物等浓度，按照体积比fam:hex:com=1:1:2的比例混合；总反应体积10μl；

pcr反应程序：94℃预变性15min；94℃变性20sec，61-55℃梯度复性/延伸60sec、每循环降低0.6℃，共10个循环；94℃变性20sec，55℃复性/延伸60sec，共26个循环；40℃以下进行kasp分型的荧光数据读取。

本发明提供的鉴定小麦叶片绒毛基因的分子标记在在选育小麦具有叶片绒毛表型性状品种中的应用。

本发明提供的引物组在选育小麦具有叶片绒毛表型性状品种中的应用。

本发明提供的上述的引物组在选育小麦具有叶片绒毛表型形状品种中的应用。

基于上述技术方案，本发明实施例至少可以产生如下技术效果：

（1）本发明提供的鉴定小麦叶片绒毛基因的分子标记、引物组和应用，开发出可用于辅助小麦特异性状分子辅助选择的分子标记，大大提高了这一种重要资源的利用效率，首次用kasp分子标记定位了小麦品种中的叶片绒毛新基因qlp.saas-7bs，将分子标记技术应用在选育小麦具有叶片绒毛表型性状品种中，可以借助分子标记对小麦叶片绒毛表型形状的基因型进行直接而快速地前景选择，排除环境和外界因素的影响；

（2）本发明提供的鉴定小麦叶片绒毛基因的分子标记、引物组和应用，通过本发明分子标记定位的基因位点位置明确，鉴定方便。通过检测与该基因位点连锁的分子标记，即可以预测小麦是否具有叶片绒毛表型性状，进而预测小麦植株的抗逆性，比如抗旱，抗虫，抗紫外线损伤等，用于小麦品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系是否具有叶片绒毛以及是否含有叶片绒毛新基因qlp.saas-7bs，通过检测小麦叶片绒毛基因位点，可以在苗期就鉴定出具有叶片绒毛表型性状的单株，淘汰其它植株，进而快速筛选具有叶片绒毛表型性状的品种或品系用于小麦绒毛性状的育种利用，获得含有叶片绒毛基因的小麦品种，不仅节约了生产成本而且大大提高了具有叶片绒毛表型性状小麦材料的选择效率，极大地缩短小麦品种的育种周期；且其检测方便快速，不受环境影响。

附图说明

图1是本发明实施例的技术路线图；

图2是本发明实施例1中利用leicaez4hd体视显微镜检测的川麦104与白毛麦叶片绒毛侧面照片，川麦104叶片无绒毛，白毛麦叶片绒毛长而密；

图3是本发明实施例1中利用leicaez4hd体视显微镜检测的川麦104与白毛麦叶片绒毛正面照片，川麦104叶片无绒毛，白毛麦叶片绒毛长而密；

图4是本发明实施例2中利用荧光定量pcr仪进行特异分子标记kasp-ax-86175290检测的分型图；

图5本发明实施例2中利用荧光定量pcr仪进行特异分子标记kasp-ax-86172908检测的分型图。

图6小麦叶片绒毛新基因qlp.saas-7bs。

具体实施方式

实施例1：

一种鉴定小麦叶片绒毛基因的分子标记，该基因定位在白毛麦的7bs染色体上，命名为qlp.saas-7bs（如图6所示）；所述qlp.saas-7bs包括两个连锁的分子标记，为kasp-ax-86175290的kasp标记和ax-86172908的kasp标记，所述qlp.saas-7bs定位区间为ax-86175290（物理位置为61106266-61106336b）和ax-86172908（物理位置为60629908-60629979b）之间的0.48mb的物理区间内。

实施例2：

实施例1中所述分子标记的制备方法，技术路线如图1所示，其制备包括下述步骤：

（1）构建了高代重组自交系遗传群体

采用普通栽培的无绒毛小麦川麦104与具有高密度叶片绒毛的小麦地方品种白毛麦构建高代重组自交系遗传群体f8代；

如图2所示，川麦104与白毛麦叶片绒毛侧面照片，川麦104无绒毛，白毛麦长绒毛；

如图3所示，川麦104与白毛麦叶片绒毛正面照片，川麦104叶片无绒毛，白毛麦叶片绒毛长而密；

（2）构建遗传连锁图谱

利用50k高密度snp芯片对群体进行了全基因组扫描，构建高密度遗传连锁图谱，并通过多年多点的环境种植，鉴定出群体各株系叶片绒毛表型性状在多环境下遗传稳定；

（3）遗传定位

采用qtl定位方法对白毛麦叶片绒毛基因进行遗传定位（利用50k高密度snp芯片，对具有高密度叶片绒毛特征的小麦地方品种的叶片绒毛性状进行基因定位），该基因定位在白毛麦的7bs染色体上，命名为qlp.saas-7bs，根据中国春参考基因组（iwgscrefseqv2.1）比对分析，该位点位于7bs染色体上，其探针区间为ax-86175290（物理位置为61106266-61106336b）和ax-86172908（物理位置为60629908-60629979b），该基因位点的物理距离为0.48mb；

（4）获得鉴定小麦叶片绒毛基因的分子标记

利用qlp.saas-7bs位点侧翼探针ax-86175290和ax-86172908分别开发两对与该基因位点紧密连锁的kasp特异标记，所述连锁标记为kasp标记，分别为kasp-ax-86175290和kasp-ax-86172908。

特异分子标记kasp-ax-86175290的引物组序列信息为：

特异标记kasp-ax-86175290的引物组序列如下：

fam：gaaggtgaccaagttcatgcttgcacaaccagtcagcagaaa

hex：gaaggtcggagtcaacggatttgcacaaccagtcagcagaag

com：tcgggatattgaattcttgagctac

特异标记的kasp-ax-86172908的引物组序列如下：

fam：gaaggtgaccaagttcatgcttgcagtgaagttattaacacc

hex：gaaggtcggagtcaacggatttgcagtgaagttattaacact

com：atatgcagtacagatctttcacag

以上kasp标记引物组序列中的fam和hex引物序列中，中在5’端分别含有不同的荧光探针标记基团，fam引物的荧光探针标记基团序列为gaaggtgaccaagttcatgct，hex引物的荧光探针标记基团序列为gaaggtcggagtcaacggatt。

实施例3：

验证实施例1中的ax-86175290的kasp标记和ax-86172908的kasp标记，kasp标记引物检测试剂采用艾吉析科技（上海）有限公司的mix试剂，定量pcr仪使用bio-rad公司的cfx384real-timesystem；叶片绒毛的表型鉴定是通过“体视显微镜leicae24hd进行观察”；特异标记的检测是通过“荧光定量pcr仪进行分型检测；具体包括下述步骤：

（1）提取待鉴定的小麦基因组dna并分装到pcr反应板上；

（2）应用标记引物组kasp-ax-86175290和kasp-ax-86172908对步骤（1）提取的dna进行pcr扩增；

pcr扩增的方法为：先配置kasp基因分型混合液，将配置的kasp基因分型混合液加到步骤（1）中已分装有dna的pcr反应板上，然后将pcr反应板密封后离心；最后进行pcr循环反应；

pcr反应体系：dna2μl；kaspmastermix5μl；kasp引物组3μl（引物组3条引物浓度均为10μm，按照体积比fam:hex:com=1:1:2的比例混合）；总反应体积10μl；

pcr反应程序：94℃预变性15min；94℃变性20sec，61-55℃梯度复性/延伸60sec、每循环降低0.6℃，共10个循环；94℃变性20sec，55℃复性/延伸60sec，共26个循环；40℃以下进行kasp分型的荧光数据读取，检测结果如图4和图5所示。

（3）采用体视显微镜leicae24hd进行观察（检测结果如图2和图3所示），进行小麦叶片绒毛性状的鉴定，根据表型分析和定位结果表明，kasp标记检测结果稳定可靠，可用于基因位点qlp.saas-7bs的分子检测。