一种基于柠檬酸发酵废弃物的
ε
‑
聚赖氨酸生物合成方法
技术领域
1.本发明涉及一种ε
‑
聚赖氨酸的合成方法，具体涉及一种基于柠檬酸发酵废弃物的ε
‑
聚赖氨酸生物合成方法，是对柠檬酸发酵废水、废渣中的微生物诱导物进行提取，并在分批及补料分批发酵中进行提取物的外源添加来强化ε
‑
聚赖氨酸合成的方法，属于工业生物技术领域。
背景技术：
2.柠檬酸，又名枸橼酸，是一种重要食品添加剂，目前主要通过黑曲霉液态发酵薯类、玉米类底物合成。目前，国内柠檬酸发酵产量约为14％左右，而余下部分由大量有机发酵废水和废渣组成。研究显示，1吨柠檬酸将产生8
‑
15m3发酵性废水，以及2
‑
4吨发酵废渣。我国是全球柠檬酸的最大生产国之一，每年产生的废水废渣量更是巨大。“如何对此类废弃物进行资源化利用”成为了重要课题。
3.针对柠檬酸发酵废水问题，毛忠贵团队开发出“柠檬酸
‑
沼气双发酵偶联系统”，对柠檬酸发酵废水进行厌氧发酵并以产物沼气发电，处理过后的废水再回用柠檬酸发酵配料中，实现了废水的资源化利用。针对发酵废渣(废菌体)问题，部分企业将其作为氨基葡萄糖盐酸盐提取的原料，而大部分企业将其与麸皮、秸秆等农业副产物混合制备动物饲料，或是以其为底物固态发酵制备蛋白饲料。尽管如此，目前在柠檬酸发酵废液、废渣资源化方面的技术手段依然稀缺，尤其缺少利用此类废弃物合成高值产物的技术，这直接影响本领域的进一步发展。
4.ε
‑
聚赖氨酸是一种主要由链霉菌属合成的天然同型阳离子聚合物，其由25
‑
35个赖氨酸残基经α
‑
羧基与ε
‑
氨基在聚赖氨酸合成酶的催化下脱水缩合而成。ε
‑
聚赖氨酸抑菌能力强，抑菌谱广，其对大多数革兰氏阳性细菌、阴性细菌具有显著的抑制能力，同时还可抑制酵母和霉菌的生长。此外，其不易被人体吸收，少量吸收后也能够被降解为无毒的赖氨酸，其由此被美国fda认定为gras化合物(generally recognized as safe)，并在2014年被我国卫计委批准作为食品防腐剂而使用，具有较大的社会需求和经济价值。当前，ε
‑
聚赖氨酸的市场价为1200
‑
1500元/kg，是一种高值产品。
5.发明人前期研究发现，黑曲霉胞内以及胞外分泌的一些产物能够大幅促进ε
‑
聚赖氨酸生物合成。基于此发现，发明人开发出一种基于外源添加柠檬酸发酵废水提取物、废渣提取物，进而促进ε
‑
聚赖氨酸合成的生产工艺。无论是添加的柠檬酸发酵废水提取物，还是废渣提取物，均能够(1)在分批发酵中大幅促进菌体生长以及ε
‑
聚赖氨酸合成，缩减发酵时间，提高生长效率；(2)在补料分批发酵中大幅促进ε
‑
聚赖氨酸合成。因此，本发明在柠檬酸发酵废弃物资源化，以及ε
‑
聚赖氨酸工业生产中具有重要的应用价值。
技术实现要素：
6.为促进ε
‑
聚赖氨酸合成，同时实现柠檬酸发酵废液、废渣的资源化，本发明提供了一种基于柠檬酸发酵废弃物的ε
‑
聚赖氨酸生物合成方法。本发明采用有机溶剂对柠檬酸发
酵废水、废渣进行提取，并将其添加到ε
‑
聚赖氨酸分批发酵以及补料分批发酵中，进而促进了ε
‑
聚赖氨酸的合成。
7.为实现本发明的目的，本发明中柠檬酸发酵采用的碳源为葡萄糖、蔗糖、糖蜜、木薯粉、玉米淀粉。
8.本发明的反应器包括250ml三角瓶、5l液态发酵罐两种。
9.柠檬酸发酵废水提取物添加ε
‑
聚赖氨酸发酵实验相关条件优化、柠檬酸发酵废渣提取物添加ε
‑
聚赖氨酸发酵实验相关条件优化均在250ml三角瓶中完成，柠檬酸发酵种子培养、ε
‑
聚赖氨酸发酵种子培养均在500ml三角瓶中进行，柠檬酸发酵废水提取物添加ε
‑
聚赖氨酸分批发酵、补料分批发酵均在5l发酵罐中进行。
10.本发明基于柠檬酸发酵废弃物的ε
‑
聚赖氨酸生物合成方法，包括如下步骤：
11.步骤1：柠檬酸发酵种子培养
12.将黑曲霉孢子接种于pda固体培养基中，在37℃培养箱培养5天直至长出黑色孢子。用接种环接种2环孢子(约7
×
107个)进入柠檬酸发酵种子培养基中，于37℃、160rpm摇床中培养20
‑
22h。
13.步骤2：柠檬酸发酵
14.将步骤1获得的成熟种子以15％接种量接入装有3l柠檬酸发酵培养基的5l发酵罐中(上海保兴)进行发酵，发酵72h；发酵罐温度、通气量以及搅拌转速分别控制在37℃、2vvm和600rpm直至发酵结束。
15.步骤3：柠檬酸发酵废水、废渣提取物的制备
16.步骤2获得的发酵液采用4层纱布过滤，获得滤液及滤渣；滤液及滤渣分别采用以下方法进行处理，获得柠檬酸发酵废水提取物以及废渣提取物：
17.3a、滤液采用当前通用的钙盐法进行柠檬酸提取，即添加过量轻质碳酸钙于滤液中，充分搅拌直至体系ph接近6.5
‑
6.8，此后3000rpm离心10min，上清液中加入1/5体积的正丁醇，充分搅拌，离心分层后，取丁醇相，剩余萃余液再加入1/5体积正丁醇，重复如上步骤萃取2次；萃取液合并后旋转蒸发，获得纯溶剂并浓缩提取物；浓缩液与乙醇溶液混合(乙醇终浓度75％)，静置2h后4000rpm离心10min，上清液置于90℃干燥箱中干燥，此后用去离子水按照发酵废水和提取水比为5：1对该提取物进行复溶，提取液115℃高温高压灭菌后于4℃保存备用，即为柠檬酸发酵废水提取物；
18.3b、滤渣用水洗2次后，加入终浓度为75％的乙醇，浸泡3h后于研钵中研磨，浸泡8
‑
12h，3000rpm离心10min，上清液置于旋转蒸发仪中蒸发回收溶剂并获得浓缩液，浓缩液置于90℃干燥箱中干燥，此后用去离子水按照渣水比1：3对该提取物进行复溶，提取液115℃高温高压灭菌后置于4℃保存备用，即为柠檬酸发酵废渣提取物；
19.步骤4：ε
‑
聚赖氨酸发酵种子培养
20.将小白链霉菌接种于固体贝塔纳培养基上，于30℃恒温培养箱中培养10天，直至长出孢子；用接种环挑取2环孢子(约7
×
107个)置于装液量80ml的500mlm3g培养基摇瓶中，于30℃恒温振荡培养箱中200rpm培养1天，获得可用于ε
‑
聚赖氨酸发酵的成熟小白链霉菌种子液；
21.步骤5：添加柠檬酸发酵废水提取物的ε
‑
聚赖氨酸发酵
22.选择5l液态发酵罐，其中装配2组圆盘六直页涡轮搅拌器；将m3g液体培养基配好
加入到5l发酵罐中，总装液量设置为3l，于115
‑
121℃灭菌20
‑
30min，结束冷却至室温后将以115
‑
121℃单独灭菌20
‑
30min的葡萄糖加入发酵罐；以8％的接种量接种小白链霉菌成熟发酵种子，于初始ph值6.8、温度30℃、溶氧保持在30％以上(调控转速控制)的培养条件下发酵，直至发酵液中葡萄糖消耗殆尽，于发酵24h时添加柠檬酸发酵废水提取物；在碳源耗完后立即补充预灭菌的60％葡萄糖溶液，以控制碳源浓度在5
‑
15g/l之间，并以预灭菌的600g/l的硫酸铵溶液流加补充氨氮使其浓度位于0.5
‑
1g/l之间，发酵持续168h(7d)。本发酵过程中，每隔12h取样测定ε
‑
聚赖氨酸浓度、菌体干重和残葡萄糖浓度。
23.步骤6：添加柠檬酸发酵废渣提取物的ε
‑
聚赖氨酸发酵
24.选择5l液态发酵罐，其中装配2组圆盘六直页涡轮搅拌器。将m3g液体培养基配好加入到5l发酵罐中，总装液量设置为3l，于115
‑
121℃灭菌20
‑
30min，结束冷却至室温后将以115
‑
121℃单独灭菌20
‑
30min的葡萄糖加入发酵罐。以8％的接种量接种小白链霉菌成熟发酵种子，于初始ph值6.8、温度30℃、溶氧保持在30％以上(调控转速控制)的培养条件下发酵，直至发酵液中葡萄糖消耗殆尽，于发酵24h时添加柠檬酸发酵废渣提取物；在碳源耗完后立即补充预灭菌的60％葡萄糖溶液，以控制碳源浓度在5
‑
15g/l之间，并以预灭菌的600g/l的硫酸铵溶液流加补充氨氮使其浓度位于0.5
‑
1g/l之间，发酵持续168h(7d)。本发酵过程中，每隔12h取样测定ε
‑
聚赖氨酸浓度、菌体干重和残葡萄糖浓度。
25.本发明工艺中采用的菌种：黑曲霉cicc 40102(aspergillus niger cicc40102)，小白链霉菌ifo14147(streptomycesalbulusifo14147，streptomyces albulus cicc 11022)，购于中国工业微生物菌种保藏中心(cicc)。
26.本发明工艺中采用的培养基：
27.(1)pda培养基(g/l)：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂20，ph自然。
28.(2)柠檬酸发酵种子培养基(g/l)：葡萄糖30，(nh4)2so
4 8，kh2po
4 1,ph 5.5。
29.(3)柠檬酸发酵培养基(g/l)：碳源(总糖160)，玉米粉180，mgso4·
7h2o 2.5,kh2po
4 5，添加高温α
‑
淀粉酶于90℃预液化直至碘试合格为止，ph6.0。
30.(4)贝塔纳培养基(g/l)：葡萄糖10，酵母粉1，蛋白胨2，琼脂20，ph 7.5。
31.(5)m3g培养基(g/l)：葡萄糖50，酵母粉5，(nh4)2so
4 10，mgso4·
7h2o 0.5，k2hpo4·
3h2o 0.8，kh2po
4 1.36，feso4·
7h2o 0.03，znso4·
7h2o 0.04，ph 6.8。
32.以上凡涉及到葡萄糖或葡萄糖水解，均将含糖物与其他成分分开配制/液化，121℃高温灭菌20min后再合并于同一体系培养基中。
33.样品的检测：
34.发酵液样品经4500rpm离心10min后，上清液用于测定ε
‑
聚赖氨酸浓度和葡萄糖浓度，下层菌体用于测定菌体干重。ε
‑
聚赖氨酸浓度采用甲基橙法测定，即用0.7mm ph 7.0磷酸钠缓冲液将发酵上清液适当稀释，取2ml稀释液与2ml 1mm甲基橙溶液进行反应，混合液在30℃条件下反应30min后4,500
×
g离心15min。上清经上述磷酸缓冲液稀释20倍后在465nm处测定吸光度，并参照预先制备得到的吸光度与ε
‑
聚赖氨酸标准品对应的标准曲线计算得到ε
‑
聚赖氨酸的浓度。葡萄糖采用hplc法测定，即采用高效液相色谱仪(dionex,u
‑
3000,usa)测定发酵上清液中的葡萄糖浓度。硬件配置：有机酸柱(bio
‑
rad,aminex hpx
‑
87h300
×
7.8mm,usa)及示差检测器(shodex,ri
‑
101,japan)。样品物质由5mm h2so4流动相载负，以0.6ml/min流速通过柱温为60℃的有机酸分析柱，所分离得到的各组分分别由示差
检测器测定其含量。菌体干重(dcw)采用滤纸差量测重法。菌体沉淀加蒸馏水洗涤两次，用预先105℃烘干并称重的滤纸进行抽滤，之后滤纸置于105℃烘干至恒重后称重，计算前后重量差值。
35.与传统ε
‑
聚赖氨酸液态发酵相比，本发明提供的添加柠檬酸发酵废水、废渣提取物的ε
‑
聚赖氨酸发酵方法能够显著提高ε
‑
聚赖氨酸产量、生产强度，在柠檬酸发酵废弃物资源化以及ε
‑
聚赖氨酸工业化生产中具有重要的意义和应用价值。
具体实施方式
36.下面结合具体实施例，可以更好地理解本发明。实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件以及结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权力要求书中所详细描述的本发明。
37.实施例中使用到的菌种和培养基如下：
38.菌种：黑曲霉cicc 40102(aspergillus niger cicc40102)，小白链霉菌ifo14147(streptomyces albulus ifo14147，streptomyces albulus cicc 11022)，购于中国工业微生物菌种保藏中心(cicc)。
39.培养基配方：
40.(1)pda培养基(g/l)：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂20，ph自然。
41.(2)柠檬酸发酵种子培养基(g/l)：葡萄糖30，(nh4)2so
4 8，kh2po
4 1,ph 5.5。
42.(3)柠檬酸发酵培养基(g/l)：碳源(总糖160)，玉米粉180，mgso4·
7h2o 2.5,kh2po
4 5，添加高温α
‑
淀粉酶于90℃预液化直至碘试合格为止，ph6.0。
43.(4)贝塔纳培养基(g/l)：葡萄糖10，酵母粉1，蛋白胨2，琼脂20，ph 7.5。
44.(5)m3g培养基(g/l)：葡萄糖50，酵母粉5，(nh4)2so
4 10，mgso4·
7h2o 0.5，k2hpo4·
3h2o 0.8，kh2po
4 1.36，feso4·
7h2o 0.03，znso4·
7h2o 0.04，ph 6.8。
45.本发明的反应器包括250ml三角瓶、5l液态发酵罐两种。
46.柠檬酸发酵废水提取物添加ε
‑
聚赖氨酸发酵实验相关条件优化、柠檬酸发酵废渣提取物添加ε
‑
聚赖氨酸发酵实验相关条件优化均在250ml三角瓶中完成，柠檬酸发酵种子培养、ε
‑
聚赖氨酸发酵种子培养均在500ml三角瓶中进行，柠檬酸发酵废水提取物添加ε
‑
聚赖氨酸分批发酵、补料分批发酵均在5l发酵罐中进行。
47.以上凡涉及到葡萄糖或葡萄糖水解，均将含糖物与其他成分分开配制/液化，121℃高温灭菌20min后再合并于同一体系培养基中。
48.实施例1：柠檬酸废水提取物添加条件优化
49.柠檬酸废水、废渣的获取：将黑曲霉孢子接种于pda固体培养基中，在37℃培养箱培养5天直至长出黑色孢子。用接种环接种2环孢子(约7
×
107个)进入柠檬酸发酵种子培养基中，于37℃、160rpm摇床中培养20
‑
22h。将以上成熟种子以15％接种量接入装有3l柠檬酸发酵培养基的5l发酵罐中(上海保兴)进行发酵，发酵72h。发酵罐温度、通气量以及搅拌转速分别控制在37℃、2vvm和600rpm直至发酵结束。
50.柠檬酸废水经如下步骤进行提取：(1)柠檬酸发酵液采用4层纱布过滤，获得滤液；(2)滤液采用当前通用的钙盐法进行柠檬酸提取，即添加过量轻质碳酸钙于滤液中，充分搅拌直至体系ph接近6.5
‑
6.8，此后3000rpm离心10min，获得上清液；(3)上清液中加入1/5体
积正丁醇，充分搅拌，离心分层后，取丁醇相，剩余萃余液再加入1/5体积正丁醇，重复如上步骤萃取2次，萃取液汇总进行旋转蒸发，获得纯溶剂并浓缩提取物；(4)浓缩液与乙醇溶液混合(乙醇终浓度75％)，静置2h后4000rpm离心10min，上清液置于90℃干燥箱中干燥，此后用去离子水按照发酵废水和提取水比为5：1对该提取物进行复溶，提取液115℃高温高压灭菌后置于4℃冰箱备用。
51.对于废水提取物添加时间优化：ε
‑
聚赖氨酸三角瓶发酵中，在发酵0h，6h，12h，18h，24h，30h，36h，42h时，分别添加以上终浓度为500ml废水/l培养基量的废水提取液(以葡萄糖为碳源)，并在24h时添加终浓度为20g/l柠檬酸钠(ph 4.0)缓冲液控制发酵ph，48h结束发酵，测定ε
‑
聚赖氨酸浓度。其ε
‑
聚赖氨酸产量分别为，0.52g/l(对照，添加等量去离子水)，0.82g/l(0h)，0.75g/l(6h)，0.85g/l(12h)，1.15g/l(18h)，1.37g/l(24h)，1.32g/l(30h)，0.91g/l(36h)，0.62g/l(42h)，数据说明在ε
‑
聚赖氨酸发酵24h时添加最优。
52.对于废水提取物添加浓度优化：ε
‑
聚赖氨酸三角瓶发酵中，在发酵24h时，分别添加以上终浓度为100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000(ml废水/l培养基)量的废水提取液(以葡萄糖为碳源)，并在24h时添加终浓度为20g/l柠檬酸钠(ph 4.0)缓冲液控制发酵ph，48h结束发酵，测定ε
‑
聚赖氨酸浓度。其ε
‑
聚赖氨酸产量分别为，0.54g/l(对照，添加等量去离子水)，0.72g/l(100ml废水/l培养基)，0.81g/l(200ml废水/l培养基)，0.92g/l(300ml废水/l培养基)，1.15g/l(400ml废水/l培养基)，1.33g/l(500ml废水/l培养基)，1.32g/l(600ml废水/l培养基)，1.31g/l(700ml废水/l培养基)，1.29g/l(800ml废水/l培养基)，1.22g/l(900ml废水/l培养基)，1.03g/l(1000ml废水/l培养基)，数据说明最优废水提取物添加量为终浓度500ml废水/l培养基。
53.不同碳源柠檬酸发酵废水诱导效果评估：ε
‑
聚赖氨酸三角瓶发酵中，在发酵24h时，分别添加终浓度为500ml废水/l培养基量的废水提取液，提取液来自于不同碳源(总糖160g/l)发酵废水，包括葡萄糖、蔗糖、糖蜜、木薯粉、玉米淀粉，并在24h时添加终浓度为20g/l柠檬酸钠(ph 4.0)缓冲液控制发酵ph，48h结束发酵，测定ε
‑
聚赖氨酸浓度。其ε
‑
聚赖氨酸产量分别为，0.57g/l(对照，添加等量去离子水)，1.37g/l(葡萄糖碳源发酵废水)，1.31g/l(蔗糖碳源发酵废水)，1.12g/l(糖蜜碳源发酵废水)，1.19g/l(木薯粉碳源发酵废水)，1.33g/l(玉米淀粉碳源发酵废水)，数据说明最优废水提取物是来自于较为纯净的发酵体系，糖蜜、木薯粉等底物可能携带部分抑制物，进而在提取过程融入提取液中，对后期ε
‑
聚赖氨酸带来少量抑制。不过尽管如此，几种不同碳源的柠檬酸发酵废水均表现出对ε
‑
聚赖氨酸合成的强化作用。
54.实施例2：添加柠檬酸废水提取物的5l发酵罐发酵
55.分批发酵对比：选择5l液态发酵罐，其中装配2组圆盘六直页涡轮搅拌器。将m3g液体培养基配好，加入到5l发酵罐中，总装液量设置为3l，于115
‑
121℃灭菌20
‑
30min，结束冷却至室温后将以115
‑
121℃单独灭菌20
‑
30min的葡萄糖加入发酵罐。以8％的接种量接种小白链霉菌成熟发酵种子，于初始ph值6.8、温度30℃、溶氧保持在30％以上(调控转速控制)的培养条件下发酵，直至发酵液中葡萄糖消耗殆尽；待发酵ph值自发下降到4.0时，采用自动流加12.5％氨水的方式控制ph值为4.0直至分批发酵结束。柠檬酸废水提取物于24h时，以终浓度为500ml废水/l培养基量添加进发酵罐，对照发酵罐添加进等体积去离子水。本发酵过程中，每隔12h取样测定ε
‑
聚赖氨酸浓度、菌体干重和残葡萄糖浓度。其中，实验组发酵
总时间为55.1h，ε
‑
聚赖氨酸产量为3.92g/l，菌体干重为15.2g/l，生产强度为0.071g/l/h；对照组(添加等体积水)发酵总时间为61.4h，ε
‑
聚赖氨酸产量为2.75g/l，菌体干重为11.53g/l，生产强度为0.045g/l/h。可知，相比对照组，实验组ε
‑
聚赖氨酸产量为对照的1.42倍，菌体干重为对照的1.32倍，发酵时间缩短了10.3％，生产强度提升至对照的1.58倍，发酵提升效果显著。
56.补料分批发酵对比：选择与上述分批发酵相同的发酵罐及相关培养基、培养条件，不同之处在于在碳源耗完后立即补充预灭菌的60％葡萄糖溶液，以控制碳源浓度在5
‑
15g/l之间，以预灭菌的600g/l的硫酸铵溶液流加补充氨氮使其浓度位于0.5
‑
1g/l之间。发酵持续168h(7d)，本发酵过程中，每隔12h取样测定ε
‑
聚赖氨酸浓度、菌体干重和残葡萄糖浓度。其中，实验组(添加柠檬酸废水提取物)发酵ε
‑
聚赖氨酸最终产量为32.25g/l，菌体干重为29.14g/l；对照组(添加等体积水)发酵ε
‑
聚赖氨酸最终产量为23.55g/l，菌体干重为24.57g/l；可知，相比对照组，实验组ε
‑
聚赖氨酸产量为对照的1.37倍，这说明废水提取物同样在ε
‑
聚赖氨酸补料发酵中有着显著的促进效果。
57.实施例3：柠檬酸废渣提取物添加条件优化
58.柠檬酸废渣的获取方式与实施例1中相同，获得的废渣采用下述步骤提取：(1)柠檬酸发酵液采用4层纱布过滤，获得滤渣；(2)滤渣用水洗2次后，加入终浓度为75％的乙醇，浸泡3h后于研钵中研磨，过夜浸泡，3000rpm离心10min，获得上清液；(3)上清液置于旋转蒸发仪中蒸发回收溶剂并获得浓缩液，浓缩液置于90℃干燥箱中干燥，此后用去离子水按照渣水比1：3对该提取物进行复溶，提取液115℃高温高压灭菌后置于4℃冰箱备用。
59.对于废渣提取物添加时间优化：ε
‑
聚赖氨酸三角瓶发酵中，在发酵0h，6h，12h，18h，24h，30h，36h，42h时，分别添加以上终浓度为40g废渣湿重/l培养基量的废渣提取液(以葡萄糖为碳源)，并在24h时添加终浓度为20g/l柠檬酸钠(ph 4.0)缓冲液控制发酵ph，48h结束发酵，测定ε
‑
聚赖氨酸浓度。其ε
‑
聚赖氨酸产量分别为，0.52g/l(对照，添加等量去离子水)，0.93g/l(0h)，0.95g/l(6h)，0.92g/l(12h)，1.25g/l(18h)，1.57g/l(24h)，1.42g/l(30h)，1.31g/l(36h)，1.12g/l(42h)，数据说明在ε
‑
聚赖氨酸发酵24h时添加废渣提取物最优。
60.对于废渣提取物添加浓度优化：ε
‑
聚赖氨酸三角瓶发酵中，在发酵24h时，分别添加以上终浓度为10、20、30、40、50、60、70、80(g废渣湿重/l培养基)量的废渣提取液(以葡萄糖为碳源)，并在24h时添加终浓度为20g/l柠檬酸钠(ph 4.0)缓冲液控制发酵ph，48h结束发酵，测定ε
‑
聚赖氨酸浓度。其ε
‑
聚赖氨酸产量分别为，0.55g/l(对照，添加等量去离子水)，0.92g/l(10g废渣湿重/l培养基)，1.04g/l(20g废渣湿重/l培养基)，1.26g/l(30g废渣湿重/l培养基)，1.55g/l(40g废渣湿重/l培养基)，1.53g/l(50g废渣湿重/l培养基)，1.52g/l(60g废渣湿重/l培养基)，1.41g/l(70g废渣湿重/l培养基)，1.33g/l(80g废渣湿重/l培养基)，数据说明最优废渣提取物添加量为终浓度40g废渣湿重/l培养基。
61.不同碳源柠檬酸发酵废渣诱导效果评估：ε
‑
聚赖氨酸三角瓶发酵中，在发酵24h时，分别添加终浓度为40g废渣湿重/l培养基量的废渣提取液，提取液来自于不同碳源(总糖160g/l)发酵废渣，包括葡萄糖、蔗糖、糖蜜、木薯粉、玉米淀粉，并在24h时添加终浓度为20g/l柠檬酸钠(ph 4.0)缓冲液控制发酵ph，48h结束发酵，测定ε
‑
聚赖氨酸浓度。其ε
‑
聚赖氨酸产量分别为，0.53g/l(对照，添加等量去离子水)，1.56g/l(葡萄糖碳源发酵废渣)，
1.53g/l(蔗糖碳源发酵废渣)，1.41g/l(糖蜜碳源发酵废渣)，1.31g/l(木薯粉碳源发酵废渣)，1.51g/l(玉米淀粉碳源发酵废渣)，数据说明废渣提取物添加对以上常用碳源均适用，木薯粉碳源产量稍低可能是因为废渣中存在部分不能降解的木薯渣导致实际菌体量较少的原因。
62.实施例4：添加柠檬酸废渣提取物的5l发酵罐发酵
63.分批发酵对比：选择与实施例2中所述分批发酵相同的发酵罐及相关培养基、培养条件及操作，不同之处在于在24h添加终浓度40g废渣湿重/l培养基量的废渣提取液进入发酵罐。发酵至碳源耗完结束，本发酵过程中，每隔12h取样测定ε
‑
聚赖氨酸浓度、菌体干重和残葡萄糖浓度。最终，实验组(添加柠檬酸废渣提取物)发酵总时间为51.5h，ε
‑
聚赖氨酸产量为5.21g/l，菌体干重为16.2g/l，生产强度为0.101g/l/h；对照组(添加等体积水)发酵总时间为61.4h，ε
‑
聚赖氨酸产量为2.75g/l，菌体干重为11.53g/l，生产强度为0.045g/l/h。可知，相比对照组，实验组ε
‑
聚赖氨酸产量为对照的1.89倍，菌体干重为对照的1.40倍，发酵时间缩短了16.1％，生产强度提升至对照的2.24倍，发酵提升效果显著。
64.补料分批发酵对比：选择与上述分批发酵相同的发酵罐及相关培养基、培养条件，不同之处在于在碳源耗完后立即补充预灭菌的60％葡萄糖溶液，以控制碳源浓度在5
‑
15g/l之间，以预灭菌的600g/l的硫酸铵溶液流加补充氨氮使其浓度位于0.5
‑
1g/l之间。发酵持续168h(7d)，本发酵过程中，每隔12h取样测定ε
‑
聚赖氨酸浓度、菌体干重和残葡萄糖浓度。其中，实验组(添加柠檬酸废渣提取物)发酵ε
‑
聚赖氨酸最终产量为40.45g/l，菌体干重为30.14g/l；对照组(添加等体积水)发酵ε
‑
聚赖氨酸最终产量为23.55g/l，菌体干重为24.57g/l；可知，相比对照组，实验组ε
‑
聚赖氨酸产量为对照的1.72倍，这说明废渣提取物同样在ε
‑
聚赖氨酸补料发酵中有着显著的促进效果。