一种封闭区pH调控触发的破骨细胞囊泡及其应用

一种封闭区ph调控触发的破骨细胞囊泡及其应用
技术领域
1.本发明属于生物材料领域，具体涉及一种封闭区ph调控触发的破骨细胞囊泡及其应用。


背景技术：

2.细胞外囊泡是由细胞分泌的一类微颗粒，通常携带蛋白质、mrna、mirna和脂质等生物活性分子，可实现细胞交互，在细胞的信号传递中起重要作用。尤其是外泌体，已在组织修复领域获得广泛研究，其生物活性分子的作用及机制明确。
3.破骨细胞封闭区是成熟破骨细胞形成的封闭吸收区，内部ph约为4.5，富含trap、ctsk等基质降解酶，在破骨细胞功能行使中起重要作用，同时作为破骨细胞微环境的重要组成部分，其形成机制及影响因素也受到广泛关注。
4.目前对于破骨细胞细胞外囊泡相关材料的专利十分少见，均停留于异种细胞来源囊泡对破骨细胞的作用。申请号为cn202011412766.2的专利公开了一种靶向破骨细胞的外泌体药物递送系统的制备方法及其应用，从细胞系获取外泌体并包载药物，实现对破骨细胞功能的调控。申请号cn202110034338.9的专利公开了一种肿瘤来源外泌体在制备促进破骨分化和骨溶解药物中的用途，同样只背了肿瘤来源外泌体并进行破骨细胞调控，未进行材料来源和调控机制的创新。诸如此类的专利均限制于异体细胞来源的外泌体材料，生物安全性低。因此需要一种自体细胞来源的破骨细胞囊泡，使其具有高度生物安全性，且机制创新明确。


技术实现要素：

5.本发明针对现有技术的不足，提供一种封闭区ph调控触发的破骨细胞囊泡及其应用。通过对破骨细胞封闭区ph进行调控，可使破骨细胞分泌大量细胞外囊泡，这种囊泡富含rank，可用于拮抗rankl，从而达到抑制破骨细胞效果。。
6.为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：提取骨髓来源单核巨噬细胞，m
‑
csf+rankl诱导破骨细胞，使用药物调控破骨细胞封闭区ph，收集破骨细胞囊泡。
7.进一步，所述m
‑
csf浓度为10
‑
50ng/ml，优选地，采用20ng/ml浓度。
8.进一步，所述rankl浓度为25
‑
100ng/ml，优选地，采用50ng/ml浓度。
9.进一步，所述药物调控方式包括培养基ph调控和靶向封闭区ph调控，优选地，采用靶向封闭区ph调控，更优选地，采用碱性内容脂质体调控。
10.进一步，所述破骨细胞囊泡收集方式包括差速离心法、密度梯度离心法、超滤法、沉淀法、免疫分离法、筛分离法。优选地，采用差速离心+超滤法。
11.相比现有破骨细胞调控的材料，本发明显著的进步在于：
12.1)封闭区ph调控触发产生破骨细胞囊泡，机制创新。
13.2)采用破骨细胞来源的囊泡进行破骨细胞调控，具有自体优势，生物安全性高。
14.3)效果明确，可有效抑制破骨细胞。
15.因此，封闭区ph调控触发的破骨细胞囊泡可保证生物安全性和机制创新性，并具有高效性。
附图说明
16.图1破骨细胞成熟过程中rank的伴随表达荧光图；
17.图2破骨细胞成熟过程中rank的伴随表达蛋白印迹图；
18.图3封闭区ph调控引起的破骨细胞囊泡的rank蛋白印迹图；
19.图4封闭区ph调控引起的破骨细胞囊泡的流式计数；
20.图5封闭区ph调控引起的破骨细胞囊泡用于破骨细胞抑制的示意图；
21.图6封闭区ph调控引起的破骨细胞囊泡用于破骨细胞抑制的效果trap染色。
具体实施方式
22.下面结合实施例对本发明提供的一种封闭区ph调控触发的破骨细胞囊泡及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
23.本发明中的封闭区ph调控触发的破骨细胞囊泡优选案例为采用骨靶向碳酸氢钠脂质体靶向破骨细胞封闭区，并使用差速离心+超滤法获得破骨细胞囊泡，见实施例1。
24.本发明还可以使用其他封闭区ph调控方式、其他的破骨细胞囊泡收集方式，均可获得相同的技术效果。
25.实施例1、骨靶向碳酸氢钠脂质体靶向破骨细胞封闭区,差速离心+超滤法获得破骨细胞囊泡
26.1、培养骨髓来源单核巨噬细胞，加入20ng/ml m
‑
csf诱导。
27.2、5天后，采用20ng/ml m
‑
csf+50ng/ml rankl诱导破骨细胞。
28.3、3天后，加入四环素修饰的骨靶向碳酸氢钠脂质体，并换无血清培养基，每天收集上清。
29.4、梯度离心，200
×
g离心15min，2500
×
g离心15min。
30.5、取上清，使用0.22μm过滤器过滤上清液，以去除残留的细胞和碎片。
31.6、用超速离心过滤器装置转移溶液。将溶液以4,000
×
g离心，直到上层隔室中的体积浓缩至约200μl。
32.7、用磷酸盐缓冲液洗涤超滤溶液，并重复离心3次。
33.8、将洗涤后的含有外泌体的超滤液体超速离心1小时。将沉淀重悬于pbs中，并以4,000
×
g离心以将体积浓缩至约200μl。
34.实施例2、骨靶向磷酸氢二钠磷酸氢二钠脂质体靶向破骨细胞封闭区,密度梯度法获得破骨细胞囊泡
35.1、培养骨髓来源单核巨噬细胞，加入20ng/ml m
‑
csf诱导。
36.2、5天后，采用20ng/ml m
‑
csf+50ng/ml rankl诱导破骨细胞。
37.3、3天后，加入四环素修饰的骨靶向磷酸氢二钠脂质体，并换无血清培养基，每天收集上清。
38.4、使用percoll密度梯度离心液1000
×
g，20min离心。
39.5、吸取上层交界面的外泌体层液体，加入2倍体积pbs混匀。
40.6、使用0.22μm过滤器过滤，以去除残留的细胞和碎片，用超速离心过滤器装置转移溶液。将溶液以4,000
×
g离心，直到上层隔室中的体积浓缩至约200μl。
41.7、用磷酸盐缓冲液洗涤，并重复离心3次。
42.8、将沉淀用200μl pbs重悬
43.实施例3、培养基ph改变调控破骨细胞封闭区ph,差速离心法获得破骨细胞囊泡
44.1、培养骨髓来源单核巨噬细胞，加入20ng/ml m
‑
csf诱导。
45.2、5天后，采用20ng/ml m
‑
csf+50ng/ml rankl诱导破骨细胞。
46.3、3天后，换无血清培养基，并调节ph至8.0，每天收集上清。
47.4、梯度离心，以300
×
g离心10分钟，取上清。
48.5、以2000
×
g离心10分钟，取上清。
49.6、10，000
×
g离心30分钟，取上清。
50.7、100，000
×
g，在4℃下持续离心90分钟，去掉上清，留下的沉淀pbs重悬后，再次以100，000
×
g离心90分钟。
51.8、将沉淀用200μl pbs重悬
52.实施例1中破骨细胞成熟过程中rank的伴随表达荧光图，如图1所示；
53.1、分别取rankl诱导0天和5天的破骨细胞，使用罗丹明、dapi、rank抗体标记细胞骨架、细胞核和rank，荧光吸纳为镜观察；
54.2、镜下可见5天的破骨细胞rank量远高于0天，提示破骨细胞成熟过程中rank的伴随表达。
55.实施例1中破骨细胞成熟过程中rank的伴随表达蛋白印迹图，如图2所示；
56.1、分别取rankl诱导0、1、2、3、4、5天的破骨细胞，进行蛋白提取后进行rank的蛋白印迹实验。
57.2、结果显示随着诱导时间的增长，rank表达量呈上升趋势。
58.实施例1中封闭区ph调控引起的破骨细胞囊泡的rank蛋白印迹图，如图3所示；
59.1、分别取普通破骨细胞和封闭区调控破骨细胞的囊泡分离，进行蛋白提取后进行rank的蛋白印迹实验。
60.2、结果显示封闭区调控破骨细胞囊泡的rank表达量显著提高。
61.实施例1中封闭区ph调控引起的破骨细胞囊泡的流式计数，如图4所示；
62.1、分别取普通破骨细胞和封闭区调控破骨细胞的囊泡分离，标记cd81和rank荧光直标抗体后进行基于beads的流式计数。
63.2、结果显示封闭区调控破骨细胞囊泡的数量及rank表达量显著提高
64.实施例1中封闭区ph调控引起的破骨细胞囊泡用于破骨细胞抑制的示意图，如图5所示；
65.1、诱导破骨细胞三天，加入四环素修饰的骨靶向碳酸氢钠脂质体，并换无血清培养基，每天收集上清，分离囊泡。
66.2、将破骨细胞囊泡加入破骨细胞诱导体系，以实现对培养基中rankl的结合，降低游离rankl浓度，抑制破骨细胞形成。
67.实施例1中封闭区ph调控引起的破骨细胞囊泡用于破骨细胞抑制的效果trap染色，如图6所示；
68.1、分别取普通破骨细胞和封闭区调控破骨细胞的囊泡分离，加入破骨细胞诱导体系，诱导培养5天。
69.2、结果显示封闭区调控破骨细胞囊泡trap阳性破骨细胞面积及数量显著下降，可有效抑制破骨细胞形成
70.对实施例2、3所得的封闭区ph调控触发的破骨细胞囊泡分别进行破骨细胞成熟过程中rank的伴随表达荧光图、破骨细胞成熟过程中rank的伴随表达蛋白印迹图、封闭区ph调控引起的破骨细胞囊泡的rank蛋白印迹图、封闭区ph调控引起的破骨细胞囊泡的流式计数、封闭区ph调控引起的破骨细胞囊泡用于破骨细胞抑制的示意图、封闭区ph调控引起的破骨细胞囊泡用于破骨细胞抑制的效果trap染色，与实施例1中封闭区ph调控触发的破骨细胞囊泡结果相似，这表明可通过上述其他封闭区ph调控方式、其他的破骨细胞囊泡收集方式，实现效果类似的封闭区ph调控触发的破骨细胞囊泡的制备。
71.由上述实施例可知，本发明提供的封闭区ph调控触发的破骨细胞囊泡及其应用，所提取囊泡富含rank，可用于拮抗rankl，从而达到抑制破骨细胞效果。
72.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本技术领域的技术人员来应当理解，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围，不偏离本发明权利要求书所限定的范围。