用于发酵酒陈酿过程中变质菌的富集培养基及的检测方法与流程

1.本发明涉及发酵酒微生物监控技术领域，具体是一种用于发酵酒陈酿过程中变质菌的富集培养基及检测方法。


背景技术：

2.传统酿造酒生产陈化过程中，均会面临发酵酒升酸、返浑的质量波动。但是当前发酵酒中变质菌的微生物和理化指标的检测存在一定的滞后性，当发酵酒酸败微生物大量繁殖并产生代谢产物后才可能检测到总酸、ph值的变化，无法在微生物大量繁殖之前进行及时灭菌，导致发酵酒往往在检测周期内出现质量波动，同时如果仅仅对浊度进行监控，无法排除发酵酒中化学返浑的特性，所以为确保储存发酵酒陈酿过程的品质，开发一种可快速有效变质菌的监控方法尤为重要。而目前暂无关于发酵酒陈酿过程变质菌监控方法的相关专利报道。在实际生产过程中发现，常规微生物监控手段不能很好实现发酵酒陈酿过程变质菌监控：如使用营养琼脂培养基等无法有效检测到发酵酒中的有活性微生物，同时mrs平板培养检测周期为72h，存在滞后性；发酵酒总酸及ph值的变化具有滞后性，当发酵酒酸败微生物大量繁殖并产生代谢产物后才可能检测到总酸及ph值的变化，不能及时发现发酵酒变质菌的生长情况。
3.在微生物检测培养基和检测方法方面的相关报道例如：
4.中国发明专利申请201811113012.x(发明名称为《一种料酒中产气菌的培养基和检测方法》)公开了如下内容：将待测料酒样品稀释，然后接种入含有培养基的发酵管中，在30℃
±
1℃条件下培养48
±
2h后，根据发酵管的产气与否来检测产气菌；培养基由以下重量份的原料组成：蔗糖10份
‑
30份，酵母膏3份
‑
6份，蛋白胨4份
‑
10份，氯化钠3份
‑
10份，黄酒2份
‑
8份，吐温
‑
80 1份
‑
2份，巯基乙酸钠0.05份
‑
1份，七水硫酸镁0.2份
‑
0.6份，甲硫氨酸0.01份
‑
0.1份，半胱氨酸0.01份
‑
0.2份，蒸馏水1000份。该技术方案涉及采用含有黄酒等成分的培养基培养料酒中产气菌以此达到高效、简单、低成本、易推广的检测目的。但是该技术方案，对料酒中产气菌有一定效果，但是并不适合发酵酒陈酿过程中产酸、返浑类微生物的检测。中国发明专利申请201610574728.4(发明名称为《一种检测黄酒腐败微生物的方法》)中，设计了5对用于荧光定量pcr的耐酸乳杆菌的特异性引物，并详细介绍了一种黄酒腐败微生物耐酸乳杆菌的荧光定量检测方法，且该检测方法具有很好的准确性、重复性和稳定性。然而，荧光定量检测方法复杂，检测成本及技术要求较高，不适合绝大多数中小发酵酒生产企业在实际生产过程中的使用。
5.中国发明专利申请201611075676.2(发明名称为《一种评价污泥臭氧处理过程中活菌含量和组成的方法》)，该方法通过atp检测方法检测不同臭氧处理过程中污泥中活菌总量变化，对于有意义的臭氧处理污泥进行pma辅助的pcr测序分析，完成臭氧处理后污泥中活菌组成分析。该技术方案没有对样品中微生物进行富集，直接的atp检测不利于发酵酒中微生物低浓度，同时该方法未进行微生物膜外微生物的排除，需要进行二次检测，检测成本上升。
6.中国发明专利申请202010585358.0(发明名称为《一种用于检测调味品中难培养菌的培养基及检测方法》)公开了一种用于检测调味品中难培养菌的培养基，包含mrs 0.040g/ml
‑
0.070g/ml、蔗糖0.005g/ml
‑
0.030g/ml、复配生长因子0.0005g/ml
‑
0.0020g/ml和待测调味品稀释液200g/ml
‑
500ml/l；所述复配生长因子包含以下重量份的组分：l
‑
半胱氨酸30份
‑
70份、feso4·
7h2o 30份
‑
70份和吐温
‑
80 0份
‑
30份；所述待测调味品稀释液中待测调味品的质量浓度为40％
‑
70％。其中，所述待测调味品可以为调味料酒。该技术方案涉及向含mrs的培养基中添加待测调味品稀释液和复配生长因子，为变质菌的生长提供适宜的微量元素和生长因子，缩短了变质菌的培养时间，提高了检测效率。然而，该技术方案所涉培养基在培养例如调味料酒的过程中，耗时依然较长。


技术实现要素：

7.鉴于以上背景技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种用于发酵酒陈酿过程中变质菌的富集培养基，用该富集培养基对待测发酵酒所含微生物(包括发酵酒陈酿过程中变质菌)进行培养，可明显促进微生物繁殖，缩短微生物富集耗时，便于快速制备微生物样品用于检测。
8.本发明的目的可以通过如下技术方案实现：
9.第一方面，本发明提供一种培养基，所述培养基包含发酵酒浓缩液的上清液和mrs培养基，所述发酵酒浓缩液为未变质发酵酒的浓缩液；每100ml所述培养基包含40ml
‑
60ml所述发酵酒浓缩液的上清液和5g
‑
6g所述mrs培养基，所述发酵酒浓缩液为未变质发酵酒的0.3倍
‑
0.7倍体积的浓缩液。
10.在其中一个实施例中，所述发酵酒包含黄酒、米酒、啤酒和葡萄酒中的至少一种。
11.第二方面，本发明提供一种如上所述的培养基的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：将所述发酵酒浓缩液的上清液、所述mrs培养基与水混合。
12.在其中一个实施例中，所述发酵酒浓缩液的上清液的制备包括如下步骤：对所述未变质发酵酒进行浓缩，收集浓缩液；对所述浓缩液进行离心，收集上清液。
13.在其中一个实施例中，浓缩所采用的温度为40℃
‑
50℃。
14.在其中一个实施例中，离心的条件包括：离心温度为3.5℃
‑
4.5℃，离心转速为4500r/min
‑
5500r/min，离心时长为4.5min
‑
5.5min。
15.在其中一个实施例中，所述制备方法还包括对混合所得产物进行灭菌的步骤。
16.第三方面，本发明提供一种发酵酒陈酿过程中变质菌的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
17.采用如上所述的培养基对待测发酵酒进行富集培养，并收集微生物；
18.对所述微生物进行检测。
19.其中一个实施例中，富集培养的条件包括：温度为35℃
‑
37℃，时长为11h
‑
13h。
20.其中一个实施例中，收集所述微生物的方式采用离心。
21.其中一个实施例中，对所述微生物进行检测的步骤包括：
22.将所述微生物制备成悬液；
23.对所述悬液进行超声裂解；
24.对超声裂解所得产物进行离心，收集待测上清液；
25.将所述待测上清液与atp检测试剂反应，测定所述待测上清液的荧光强度；
26.检测梯度浓度的atp标准液的荧光强度，绘制标准曲线；
27.将所述待测上清液的荧光强度带入所述标准曲线，根据所得结果判定所述待测发酵酒是否存在变质菌。
28.其中一个实施例中，根据所得结果判定所述待测发酵酒是否存在变质菌包括：
29.所述待测上清液的荧光强度＞20，则所述待测发酵酒存在变质菌；
30.所述待测上清液的荧光强度≤20，则所述待测发酵酒不存在变质菌。
31.其中一个实施例中，所述悬液包含pbs缓冲液。
32.其中一个实施例中，超声裂解的过程包括：超声2.8s
‑
3.2s，停顿5s
‑
7s，超声和停顿互相交替20轮次
‑
30轮次，超声所得产物置于95℃
‑
105℃下2min
‑
3min。
33.其中一个实施例中，对超声裂解所得产物进行离心所采用的离心条件包括：离心温度为3.5℃
‑
4.5℃，离心转速为4500r/min
‑
5500r/min，离心时长为4.5min
‑
5.5min。
34.其中一个实施例中，所述atp检测试剂于20℃
‑
30℃放置3min
‑
4min后再与所述待测上清液反应。
35.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
36.本发明提供一种包含合适浓度的发酵酒(未变质发酵酒)浓缩液的上清液和mrs培养基的配方简单的培养基，采用该培养基能对待测发酵酒所含微生物(包括发酵酒陈酿过程中变质菌)进行培养，可明显促进微生物繁殖，缩短微生物富集耗时(12h左右)，便于快速制备微生物样品用于检测。例如相对于传统技术202010585358.0公开的富集培养最短两天，本发明发酵酒所含微生物的富集培养耗时明显缩短。
37.并且，采用本发明提供的培养基对待测发酵酒所含微生物进行富集培养后，通过atp检测法对微生物进行检测并以此结果评判是否有变质菌滋生，整个检测周期可在15h
‑
18h内完成，相比与传统的mrs平板检测，由72h缩短至15h
‑
18h，避免了检测期间内发酵酒变质的风险，可提前对发酵酒进行灭菌处理。并且，该检测方法灵敏准确，经验证，该检测方法可有效定性出菌浓度小于10cfu/ml的染菌发酵酒样品。本发明提供的检测方法，为发酵酒陈酿过程中启动灭菌的判断依据，可及时准确的监控到陈酿酒的卫生质量情况，实现酒体在感官、风味、体态及指标变化前完成灭菌处理，从而确保陈酿酒感官风味、体态及理化指标稳定。
附图说明
38.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
39.图1为本发明培养基制备及微生物检测流程图。
具体实施方式
40.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使
对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
41.术语
42.除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
43.本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
44.本文中，“一种或几种”指所列项目的任一种、任两种或任两种以上。其中，“几种”指任两种或任两种以上。
45.本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
46.本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本发明的技术方案、解决本发明的技术问题、实现本发明预期的技术效果为准。
47.本文中，“优选”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。
48.本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。
49.本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
50.本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，则包括数值区间的两个端点。
51.本发明中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相
‑
固相混合均指质量百分比，对于液相
‑
液相混合指体积百分比。
52.本发明中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
53.本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
54.第一方面，本发明提供一种培养基，所述培养基包含发酵酒浓缩液的上清液和mrs培养基，所述发酵酒浓缩液为未变质发酵酒的浓缩液；每100ml所述培养基包含40ml
‑
60ml(例如40ml、50ml、60ml)所述发酵酒浓缩液的上清液和5g
‑
6g(例如5g、5.4g、6g)所述mrs培养基，所述发酵酒浓缩液为未变质发酵酒的0.3倍
‑
0.7倍(例如0.3倍、0.5倍、0.7倍)体积的浓缩液。
55.本发明所述的“未变质发酵酒”也即没有滋生变质菌的正常发酵酒。
56.本发明对所述发酵酒的具体种类不做特别限定，包括但不限于黄酒、米酒、啤酒、葡萄酒等。
57.第二方面，本发明提供一种如上所述的培养基的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：将所述发酵酒浓缩液的上清液、所述mrs培养基与水混合。
58.在其中一个示例中，所述发酵酒浓缩液的上清液的制备包括如下步骤：对所述未变质发酵酒进行浓缩，收集浓缩液；对所述浓缩液进行离心，收集上清液。
59.在其中一个示例中，浓缩所采用的温度为40℃
‑
50℃。可以理解的是，为了便于保存及后续使用，可以将浓缩所得浓缩液密封保存于低温环境(例如4℃)中。本发明对浓缩所采用的仪器种类不做特别限定，包括但不限于采用旋转蒸发仪进行浓缩。
60.在其中一个示例中，离心的条件包括：离心温度为3.5℃
‑
4.5℃，离心转速为4500r/min
‑
5500r/min，离心时长为4.5min
‑
5.5min。例如：3.5℃、4500r/min、4.5min，4℃、5000r/min、5min，4.5℃、5500r/min、5.5min。
61.可以理解的是，所述制备方法还包括对混合所得产物进行灭菌的步骤。灭菌的方式可以是高压蒸汽灭菌，例如在121℃高压蒸汽灭菌30min。可以理解的是，本发明的培养基，为了使用方便，可以分装于合适大小的容器中，然后再进行灭菌，例如分装于18mm
×
180mm的试管中，每支试管分装8ml。
62.本发明对制备培养基所采用的种类不做特别限定，包括但不限于采用蒸馏水。
63.第三方面，本发明提供一种发酵酒陈酿过程中变质菌的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
64.采用如上所述的培养基对待测发酵酒进行富集培养，并收集微生物；
65.对所述微生物进行检测。
66.在其中一个示例中，富集培养的条件包括：温度为35℃
‑
37℃，时长为11h
‑
13h。例如：35℃、11h，36℃、12h，37℃、13h。
67.在其中一个示例中，收集所述微生物的方式采用离心。具体操作步骤包括但不限于如下：对富集培养所得产物进行离心，去掉上清液，所得沉淀采用pbs缓冲液清洗(清洗的方式也可以采用离心)3次
‑
4次；该处的离心的条件包括：离心温度为3.5℃
‑
4.5℃，离心转速为4500r/min
‑
5500r/min，离心时长为4.5min
‑
5.5min。例如：3.5℃、4500r/min、4.5min，4℃、5000r/min、5min，4.5℃、5500r/min、5.5min。
68.在其中一个示例中，对所述微生物进行检测的步骤包括：
69.将所述微生物制备成悬液；
70.对所述悬液进行超声裂解；
71.对超声裂解所得产物进行离心，收集待测上清液；
72.将所述待测上清液与atp检测试剂反应，测定所述待测上清液的荧光强度；
73.检测梯度浓度的atp标准液的荧光强度，绘制标准曲线；
74.将所述待测上清液的荧光强度带入所述标准曲线，根据所得结果判定所述待测发酵酒是否存在变质菌。
75.在其中一个示例中，根据所得结果判定所述待测发酵酒是否存在变质菌包括：
76.所述待测上清液的荧光强度＞20，则所述待测发酵酒存在变质菌；
77.所述待测上清液的荧光强度≤20，则所述待测发酵酒不存在变质菌。
78.在其中一个示例中，所述悬液包含pbs缓冲液。
79.在其中一个示例中，超声裂解的过程包括：超声2.8s
‑
3.2s(例如2.8s、3s、3.2s)，停顿5s
‑
7s(例如5s、6s、7s)，超声和停顿互相交替20轮次
‑
30轮次，超声所得产物置于95℃
‑
105℃下2min
‑
3min(例如100℃下2.5min、100℃下2.5min、105℃下3min)。超声结束后，可以立即将超声所得产物至于95℃
‑
105℃下2min
‑
3min。
80.在其中一个示例中，对超声裂解所得产物进行离心所采用的离心条件包括：离心
温度为3.5℃
‑
4.5℃，离心转速为4500r/min
‑
5500r/min，离心时长为4.5min
‑
5.5min。例如：3.5℃、4500r/min、4.5min，4℃、5000r/min、5min，4.5℃、5500r/min、5.5min。
81.在其中一个示例中，所述atp检测试剂于20℃
‑
30℃(例如常温下)放置3min
‑
4min后再与所述待测上清液反应。
82.下述实施例中所述试验方法，如无特别说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特别说明，均可从商业途径获得。
83.实施例一：
84.步骤1、发酵酒浓缩液的制备：取正常黄酒500ml，使用旋转蒸发仪控制48℃浓缩至250ml，4℃、5000r/min冷冻离心5min，取上清液。
85.步骤2、培养基制备：取上述浓缩液50ml，mrs培养基5.4g，加蒸馏水溶解混合均匀定容至100ml，取8ml分装于18mm
×
180mm的试管中，121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却备用。
86.步骤3、接种培养：试管接种1ml待测试黄酒样品，36℃恒温培养12h。
87.同步将待测试黄酒样品进行mrs平板检测。
88.步骤4、微生物收集：使用冷冻离心机(5000r/min 5min、4℃)，收集2ml上述培养基中的微生物，去掉上清液后使用2ml灭菌后的pbs溶液(即pbs缓冲液)清洗3次(5000r/min、5min、4℃)，得到微生物pbs溶液样品。
89.步骤5、超声裂解：将微生物pbs溶液样品进行水浴超声，超声3s，停顿5s，重复超声25轮次，超声过程中探头处于溶液中心，超声结束后，立即将样品放置与100℃中处理120s。
90.步骤6、样品处理：使用冷冻离心机(5000r/min 5min)，取上清液，将atp检测试剂0.1ml添加至检测孔内，室温放置3min，向检测孔内加入上清液0.1ml，迅速混匀。
91.步骤7、标准曲线及判定：atp标准液用检测裂解液稀释成0.001μmol/l、0.01μmol/l和0.1μmol/l 3个浓度梯度，以绘制荧光强度与atp浓度间的标准曲线，同时测定上清液的荧光强度为100，判定微生物指标为阳性。本发明实施例的整个流程见图1。
92.检测用时16h，mrs平板检测用时72h，检测指标为5cfu/ml。
93.对比实例一：
94.步骤1、培养基制备：取mrs培养基5.4g，加蒸馏水溶解混合均匀定容至100ml，分装于18mm
×
180mm的试管中，每支试管分装8ml，121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却备用；
95.步骤2、接种培养：每支试管接种1ml待检测试黄酒样品，同步设置对照组，将待测试黄酒样品进行121℃高压蒸汽灭菌30min，分别将待测试黄酒样品和灭菌处理后的待测试黄酒样品36℃恒温培养12h。
96.同步将待测样品进行mrs平板检测。
97.步骤3、微生物收集：使用冷冻离心机(5000r/min 5min、4℃)，收集2ml上述培养基中的微生物，去掉上清液后使用2ml灭菌后的pbs溶液清洗3次(5000r/min、5min、4℃)，得到微生物pbs溶液样品。
98.步骤4、超声裂解：将2个微生物pbs溶液样品(即待测试黄酒样品对应的微生物pbs溶液样品、灭菌处理后的待测试黄酒样品对应的微生物pbs溶液样品)进行水浴超声，超声3s，停顿5s，重复超声25轮次，超声过程中探头处于溶液中心，超声结束后，立即将样品放置与100℃中处理120s。
99.步骤5、样品处理：使用冷冻离心机(5000r/min 5min、4℃)，取上清液，将atp检测
试剂0.1ml添加至检测孔内，室温放置3min，向检测孔内加入上清液0.1ml，迅速混匀。
100.步骤6、标准曲线及判定：atp标准液用检测裂解液稀释成0.001μmol/l、0.01μmol/l和0.1μmol/l 3个浓度梯度，以绘制荧光强度与atp浓度间的标准曲线，同时测定试验组上清液(即待测试黄酒样品对应的上清液)的荧光强度为5，对照组为6(说明直接进行mrs培养，无法在12h达到富集微生物的作用)，判定微生物指标为阴性。
101.mrs平板检测用时72h，检测指标为5cfu/ml。
102.对比实例二：
103.本对比例实例是实施例一的对比实例，具体如下：
104.步骤1、发酵酒浓缩液的制备：分别取含有变质菌的黄酒(记作对照组)黄酒500ml和正常未含有变质菌的黄酒(记作试验组)500ml，分别使用旋转蒸发仪控制48℃浓缩至250ml，4℃、5000r/min冷冻离心5min，分别收集上清液，记作对照组浓缩液和试验组浓缩液。
105.步骤2、培养基制备：取上述对照组浓缩液50ml，mrs培养基5.4g，加蒸馏水溶解混合均匀定容至100ml，取8ml分装于18mm
×
180mm的试管中，121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却备用，记作对照组培养基；同法，取试验组浓缩液制备试验组培养基。
106.步骤3、接种培养：分别向对照组培养基和试验组培养基中接种1ml待测试黄酒样品，36℃恒温培养12h。
107.同步将待测试黄酒样品进行mrs平板检测。
108.步骤4、微生物收集：使用冷冻离心机(5000r/min 5min、4℃)，分别收集2ml上述培养基中的微生物，去掉上清液后使用2ml灭菌后的pbs溶液清洗3次(5000r/min、5min、4℃)，得到对照组微生物pbs溶液样品、试验组微生物pbs溶液样品。
109.步骤5、超声裂解：将2个微生物pbs溶液样品分别进行水浴超声，超声3s，停顿5s，重复超声25轮次，超声过程中探头处于溶液中心，超声结束后，立即将样品放置与100℃中处理120s。
110.步骤6、样品处理：使用冷冻离心机(5000r/min 5min、4℃)，分别取对照组上清液、试验组上清液，将atp检测试剂0.1ml添加至检测孔内，室温放置3min，向1个检测孔内加入对照组上清液0.1ml，向另1个检测孔内加入试验组上清液0.1ml，迅速混匀。
111.步骤7、标准曲线及判定：atp标准液用检测裂解液稀释成0.001μmol/l、0.01μmol/l和0.1μmol/l 3个浓度梯度，以绘制荧光强度与atp浓度间的标准曲线，同时测定对照组上清液(含有变质菌黄酒浓缩液)的荧光强度为10，试验组上清液的荧光强度为90，依据对照组上清液的荧光强度需判定微生物指标为阴性，而根据试验组上清液的荧光强度需判定微生物指标为阳性，结果相反，这说明采用含有变质菌黄酒浓缩液制备的培养基，对黄酒所含微生物富集效果不明显。
112.mrs平板检测用时72h，检测指标为4cfu/ml。
113.实施例二：
114.步骤1、发酵酒浓缩液的制备：取正常米酒500ml，使用旋转蒸发仪控制48℃浓缩至250ml，4℃、5000r/min冷冻离心5min，取上清液。
115.步骤2、培养基制备：取上述浓缩液50ml，mrs培养基5.4g，加蒸馏水溶解混合均匀定容至100ml，取8ml分装于18mm
×
180mm的试管中，121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却备用。
116.步骤3、接种培养：试管接种1ml待测试米酒样品，36℃恒温培养12h。
117.同步将待测试米酒样品进行mrs平板检测。
118.同时检测待测试米酒样品浊度为8.3ntu，总酸指标为4.3g/l。
119.步骤4、微生物收集：使用冷冻离心机(5000r/min 5min、4℃)，收集2ml上述培养基中的微生物，去掉上清液后使用2ml灭菌后的pbs溶液清洗3次(5000r/min、5min、4℃)，得到微生物pbs溶液样品。
120.步骤5、超声裂解：将微生物pbs溶液样品进行水浴超声，超声3s，停顿7s，重复超声30轮次，超声过程中探头处于溶液中心，超声结束后，立即将样品放置与100℃中处理150s。
121.步骤6、样品处理：使用冷冻离心机(5000r/min 5min、4℃)，取上清液，将atp检测试剂0.1ml添加至检测孔内，室温放置3min，向检测孔内加入上清液0.1ml，迅速混匀。
122.步骤7、标准曲线及判定：atp标准液用检测裂解液稀释成0.001μmol/l、0.01μmol/l和0.1μmol/l 3个浓度梯度，以绘制荧光强度与atp浓度间的标准曲线，同时测定上清液的荧光强度为28，判定微生物指标为阳性。检测用时16h，mrs平板检测用时72h，检测指标为1cfu/ml。
123.步骤8、原酒样品(即步骤3中“待测试米酒样品”)16h后继续检测：样品浊度为8.6ntu，总酸指标为4.3g/l；原酒样品72h后继续检测：样品浊度为11ntu，总酸指标为4.5g/l，说明浊度上升为微生物返浑，传统mrs平板检测的及时性无法满足发酵酒质量稳定性的需求。
124.对比实例三：
125.本对比例实例是实施例二的对比实例，具体如下：
126.步骤1、发酵酒浓缩液的制备：取正常米酒500ml，使用旋转蒸发仪控制48℃浓缩至250ml，4℃、5000r/min冷冻离心5min，取上清液。
127.步骤2、培养基制备：取上述发酵酒浓缩液50ml，mrs培养基5.4g，加蒸馏水溶解混合均匀定容至100ml，取8ml分装于18mm
×
180mm的试管中，121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却备用。
128.步骤3、接种培养：试管接种1ml待测米酒样品，36℃恒温培养12h。
129.同步将待测样品进行mrs平板检测。
130.同时检测待测样品浊度为9.0ntu，总酸指标为4.5g/l。
131.步骤4、微生物收集：使用冷冻离心机(5000r/min 5min、4℃)，收集2ml上述培养基中的微生物，去掉上清液后使用2ml灭菌后的pbs溶液清洗3次(5000r/min、5min、4℃)，得到微生物pbs溶液样品。
132.步骤5、样品处理：使用冷冻离心机(5000r/min 5min)，取上清液，将atp检测试剂0.1ml添加至检测孔内，室温放置3min，向检测孔内加入上清液0.1ml，迅速混匀。
133.步骤6、标准曲线及判定：atp标准液用检测裂解液稀释成0.001μmol/l、0.01μmol/l和0.1μmol/l 3个浓度梯度，以绘制荧光强度与atp浓度间的标准曲线，同时测定上清液的荧光强度为8，判定微生物指标为阳性。mrs平板检测用指标为10cfu/ml。这说明样品需要进行裂解处理，进行atp的释放。
134.实施例三：
135.本实施例是实施例一的变化例，相对于实施例一的变化之处包括每个步骤所采用
的参数有所调整，具体地，本实施例包括：
136.步骤1、发酵酒浓缩液的制备：取正常黄酒500ml，使用旋转蒸发仪控制40℃浓缩至150ml(0.3倍)，3.5℃、4500r/min冷冻离心4.5min，取上清液。
137.步骤2、培养基制备：取上述浓缩液40ml，mrs培养基5.0g，加蒸馏水溶解混合均匀定容至100ml，取8ml分装于18mm
×
180mm的试管中，121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却备用。
138.步骤3、接种培养：试管接种1ml待测试黄酒样品，35℃恒温培养11h。
139.同步将待测试黄酒样品进行mrs平板检测。
140.步骤4、微生物收集：使用冷冻离心机(4500r/min 4.5min、3.5℃)，收集2ml上述培养基中的微生物，去掉上清液后使用2ml灭菌后的pbs溶液清洗3次(4500r/min 4.5min、3.5℃)，得到微生物pbs溶液样品。
141.步骤5、超声裂解：将微生物pbs溶液样品进行水浴超声，超声2.8s，停顿5s，重复超声20轮次，超声过程中探头处于溶液中心，超声结束后，立即将样品放置与95℃中处理150s。
142.步骤6、样品处理：使用冷冻离心机(4500r/min 4.5min、3.5℃)，取上清液，将atp检测试剂0.1ml添加至检测孔内，室温放置3min，向检测孔内加入上清液0.1ml，迅速混匀。
143.步骤7、标准曲线及判定：atp标准液用检测裂解液稀释成0.001μmol/l、0.01μmol/l和0.1μmol/l 3个浓度梯度，以绘制荧光强度与atp浓度间的标准曲线，同时测定上清液的荧光强度为16，判定微生物指标为阴性。
144.检测用时16h，mrs平板检测用时72h，检测指标为5cfu/ml。
145.实施例四：
146.本实施例是实施例一的变化例，相对于实施例一的变化之处包括每个步骤所采用的参数有所调整，具体地，本实施例包括：
147.步骤1、发酵酒浓缩液的制备：取正常黄酒500ml，使用旋转蒸发仪控制50℃浓缩至350ml(0.7倍)，4.5℃、5500r/min冷冻离心5.5min，取上清液。
148.步骤2、培养基制备：取上述发酵酒浓缩液60ml，mrs培养基6g，加蒸馏水溶解混合均匀定容至100ml，取8ml分装于18mm
×
180mm的试管中，121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却备用。
149.步骤3、接种培养：试管接种1ml待测试样品，37℃恒温培养13h。
150.同步将待测试样品进行mrs平板检测。
151.步骤4、微生物收集：使用冷冻离心机(5500r/min 5.5min、4.5℃)，收集2ml上述培养基中的微生物，去掉上清液后使用2ml灭菌后的pbs溶液清洗3次(5500r/min 5.5min、4.5℃)，得到微生物pbs溶液样品。
152.步骤5、超声裂解：将微生物pbs溶液样品进行水浴超声，超声3.2s，停顿7s，重复超声30轮次，超声过程中探头处于溶液中心，超声结束后，立即将样品放置与105℃中处理180s。
153.步骤6、样品处理：使用冷冻离心机(5500r/min 5.5min、4.5℃)，取上清液，将atp检测试剂0.1ml添加至检测孔内，室温放置3min，向检测孔内加入上清液0.1ml，迅速混匀。
154.步骤7、标准曲线及判定：atp标准液用检测裂解液稀释成0.001μmol/l、0.01μmol/l和0.1μmol/l 3个浓度梯度，以绘制荧光强度与atp浓度间的标准曲线，同时测定上清液的
荧光强度为10，判定微生物指标为阴性。
155.检测用时16h，mrs平板检测用时72h，检测指标为5cfu/ml。
156.对比实例四
157.本对比例实例是实施例一的对比例，相对于实施例一的差别之处包括：
158.步骤1、发酵酒浓缩液的制备：取正常黄酒500ml，使用旋转蒸发仪控制48℃浓缩至100ml(0.2倍)，4℃、5000r/min冷冻离心5min，取上清液。
159.步骤2、培养基制备：取上述浓缩液65ml，mrs培养基5.4g，加蒸馏水溶解混合均匀定容至100ml，取8ml分装于18mm
×
180mm的试管中，121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却备用。
160.步骤3、接种培养：试管接种1ml待测试黄酒样品(同实施例1)，36℃恒温培养12h。
161.同步将待测试样品进行mrs平板检测。
162.步骤4、微生物收集：使用冷冻离心机(5000r/min 5min、4℃)，收集2ml上述培养基中的微生物，去掉上清液后使用2ml灭菌后的pbs溶液清洗3次(5000r/min、5min)，得到微生物pbs溶液样品。
163.步骤5、超声裂解：将微生物pbs溶液样品进行水浴超声，超声3s，停顿5s，重复超声25轮次，超声过程中探头处于溶液中心，超声结束后，立即将样品放置与100℃中处理120s。
164.步骤6、样品处理：使用冷冻离心机(5000r/min 5min)，取上清液，将atp检测试剂0.1ml添加至检测孔内，室温放置3min，向检测孔内加入上清液0.1ml，迅速混匀。
165.步骤7、标准曲线及判定：atp标准液用检测裂解液稀释成0.001μmol/l、0.01μmol/l和0.1μmol/l 3个浓度梯度，以绘制荧光强度与atp浓度间的标准曲线，同时测定上清液的荧光强度为6，判定微生物指标为阴性。
166.检测用时16h，mrs平板检测用时72h，检测指标为3cfu/ml。
167.对比例实例五
168.本对比实例是实施例一的对比例，相对于实施例一的差别之处包括：
169.步骤1、发酵酒浓缩液的制备：取正常发酵酒500ml，使用旋转蒸发仪控制48℃浓缩至250ml，4℃、5000r/min冷冻离心5min，取上清液。
170.步骤2、培养基制备：取上述发酵酒浓缩液50ml，mrs培养基7g，加蒸馏水溶解混合均匀定容至100ml，取8ml分装于18mm
×
180mm的试管中，121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却备用。
171.步骤3、接种培养：试管接种1ml待测黄酒试样品，36℃恒温培养12h。
172.同步将待测试样品进行mrs平板检测。
173.步骤4、微生物收集：使用冷冻离心机(5000r/min 5min、4℃)，收集2ml上述培养基中的微生物，去掉上清液后使用2ml灭菌后的pbs溶液清洗3次(5000r/min、5min)，得到微生物pbs溶液样品。
174.步骤5、超声裂解：将微生物pbs溶液样品进行水浴超声，超声3s，停顿5s，重复超声25轮次，超声过程中探头处于溶液中心，超声结束后，立即将样品放置与100℃中处理120s。
175.步骤6、样品处理：使用冷冻离心机(5000r/min 5min)，取上清液，将atp检测试剂0.1ml添加至检测孔内，室温放置3min，向检测孔内加入上清液0.1ml，迅速混匀。
176.步骤7、标准曲线及判定：atp标准液用检测裂解液稀释成0.001μmol/l、0.01μmol/l和0.1μmol/l 3个浓度梯度，以绘制荧光强度与atp浓度间的标准曲线，同时测定上清液的
荧光强度为13，判定微生物指标为阴性。
177.检测用时16h，mrs平板检测用时72h，检测指标为3cfu/ml。
178.以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
179.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。