一种多重信号放大系统及其在组织细胞病理检测中的应用的制作方法

1.本发明属于组织病理/细胞病理检测领域，具体涉及一种多重信号放大系统及其在组织、细胞病理成像中的应用。


背景技术：

2.组织、细胞病理检测技术也被称之为免疫组化技术、免疫细胞化学技术，该技术均是根据抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶
‑
底物沉积、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及相对定量的研究，根据病理样本的不同，可分为免疫组织化学技术(immunohistochemistry，简写ihc)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry，简写icc)。根据显色方式的不同，可分为传统的明场染色
‑
酶&底物沉积显色(brightfield,简写bf)和免疫荧光染色(immunofluorescence,简写if)，免疫荧光染色是将抗原或抗体标记荧光探针制成荧光标记物，再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光探针，利用荧光显微镜或组织切片扫描设备观察标本，荧光探针在激发光的照射而产生较强的荧光信号，看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术进行含量测定。
3.但是，现有的免疫荧光技术，存在抗体种属的限制，因此染色种类有限，针对于低丰度的抗原(或抗体)灵敏度很低，且针对一份样本染色种类较多时，实现难度大，过程复杂，时间长效率低，不容易实现自动化、容易出现串色的情况。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种利用多重信号放大系统进行组织、细胞病理检测的方法，包括下述步骤：
5.(1)组织切片、细胞涂片进行前期预处理后，进行抗原修复；
6.(2)根据待测抗原种类，加入相应的抗体
‑
dna/rna连接链，作用一定时间，洗涤；
7.(3)加入dna/rna放大链，作用一定时间；
8.(4)加入dna/rna检测链，反应一定时间；
9.(5)组织切片、细胞涂片洗涤后封片；
10.(6)对dna/rna检测链上的信号进行检测。
11.本发明的优选技术方案中，步骤(1)中，组织切片、细胞涂片抗原修复后，室温自然冷却，洗涤并加入封闭液进行封闭。
12.本发明的优选技术方案中，步骤(2)中，所述洗涤为加入固定液固定后洗涤，再加入固定反应终止液反应后洗涤。
13.本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，所述待检测抗原或抗体选自人、小鼠、羊、骆驼、兔、细菌、病毒的组织、细胞样本的任一种或其组合。
14.本发明的优选技术方案中，步骤(2)中，所述抗体
‑
dna/rna连接链中，每个抗体分子连接一个或多个连接中间体。
15.本发明优选的技术方案中，所述抗体与连接中间体连接时使用巯基、氨基、羧基、羟基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或其组合。
16.本发明的优选技术方案中，步骤(2)中，所述抗体
‑
dna/rna连接链中，每个连接中间体连接一个或多个dna/rna连接链。
17.本发明优选的技术方案中，所述连接中间体与dna/rna连接链连接时使用巯基、氨基、羧基、羟基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基的任一种或其组合。
18.本发明优选的技术方案中，用于连接抗体和dna/rna连接链的连接中间体中的两种双官能团的比例为一比一、一比多中的任一种或多种。
19.本发明优选的技术方案中，所述两种官能团不同时为相同的官能团。
20.本发明的优选技术方案中，步骤(3)中，可先连接一级dna/rna放大链，连接后再加入二级dna/rna放大链，根据需要连接更多级别dna/rna放大链。
21.本发明优选的技术方案中，步骤(5)中，洗涤后加入抗淬灭剂封片。
22.本发明的优选技术方案中，步骤(6)中，可先进行第一轮dna/rna检测链进行检测，然后进行解离，再加入第二轮dna/rna检测链进行检测；然后进行解离，再加入第三轮dna/rna检测链进行检测；根据需要进行多轮检测。
23.本发明优选的技术方案中，检测过程中不低于1轮的检测，优选为2轮到10轮；每轮检测中同时检测1种或1种以上的抗原。
24.本发明优选的技术方案中，所述多重信号放大系统的连接链与放大链、放大链与放大链、放大链与检测链、连接链与检测链之间可进行一轮或多轮检测。
25.本发明优选的技术方案中，每一轮检测后下一轮检测前解离洗脱的位置可以为检测链与放大链互补配对的位置、放大链与放大链互补配对的位置、放大链与连接链互补配对的位置、连接链与检测链互补配对的位置。
26.本发明优选的技术方案中，通过调节洗脱液的浓度实现不同位置的解离。
27.本发明优选的技术方案中，所述检测信号可以连接于dna/rna检测链的任何位置，可以为5’端、3’端、或者检测链中间的任何位置。
28.本发明优选的技术方案中，所述检测信号包括但不限于荧光、磷光、化学发光、电磁信号、核磁信号、放射性信号、酶
‑
底物显色信号中的任一种或其组合。
29.本发明的优选技术方案中，加入各步骤物质反应后，去除多余物质，然后进行洗涤操作。
30.本发明优选的技术方案中，dna/rna连接链、dna/rna放大链、dna/rna检测链中可含有碱基重复单元。
31.本发明优选的技术方案中，dna/rna放大链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
32.gtgatgtaggtggtagaggaattt
‑
tt
‑
ataaaccta
‑
a
‑
(ataaaccta
‑
a)
n
‑
ataaaccta
‑
a(5≤n≤250)、
33.ctagatcgaactattcgaacactaaata
‑
tt
‑
catcatcat
‑
a
‑
(catcatcat
‑
a)
n
‑
catcatcat
‑
a(5≤n≤250)、
34.gggttattgcgaggatatagggcgtggcggtgtcatagaatt
‑
tt
‑
aatactctc
‑
a
‑
(aatactctc
‑
a)
n
‑
aatactctc
‑
a(5≤n≤250)、
35.ctgttgcgcgggagaacgacacggacgctaaatataggaaac
‑
tt
‑
a
‑
caacttaac
‑
a
‑
(caacttaac
‑
a)
n
‑
caacttaac
‑
a(5≤n≤250)、
36.attgagacggtacggttcactgctaacggacgatttggattc
‑
tt
‑
ttcatttac
‑
a
‑
(ttcatttac
‑
a)
n
‑
ttcatttac
‑
a(5≤n≤250)、
37.gagtatgcgtcggagaccttgacggaccttggactagacttg
‑
tt
‑
caatcaaaa
‑
a
‑
(caatcaaaa
‑
a)
n
‑
caatcaaaa
‑
a(5≤n≤250)、
38.gacggtgaatgtacgactatgcgacgggatactacaggaact
‑
tt
‑
ccaataata
‑
a
‑
(ccaataata
‑
a)
n
‑
ccaataata
‑
a(5≤n≤250)、
39.taggtttat
‑
t
‑
taggtttat
‑
t
‑
taggtttat
‑
ttt
‑
ttcatttac
‑
a
‑
(ttcatttac
‑
a)
n
‑
ttcatttac
‑
a(5≤n≤250)、
40.atgatgatg
‑
t
‑
atgatgatg
‑
t
‑
atgatgatg
‑
ttt
‑
ttttctacc
‑
a
‑
(ttttctacc
‑
a)
n
‑
ttttctacc
‑
a(5≤n≤250)、
41.gagagtatt
‑
t
‑
gagagtatt
‑
t
‑
gagagtatt
‑
ttt
‑
tccttttat
‑
a
‑
(tccttttat
‑
a)
n
‑
tccttttat
‑
a(5≤n≤250)、
42.gttaagttg
‑
t
‑
gttaagttg
‑
t
‑
gttaagttg
‑
ttt
‑
ccttctatt
‑
a
‑
(ccttctatt
‑
a)
n
‑
ccttctatt
‑
a(5≤n≤250)、
43.gtaaatgaa
‑
t
‑
gtaaatgaa
‑
t
‑
gtaaatgaa
‑
ttt
‑
ttattcact
‑
a
‑
ttattcact
‑
a
‑
(ttattcact
‑
a)
n
‑
ttattcact
‑
a(5≤n≤250)、
44.ttttgattg
‑
t
‑
ttttgattg
‑
t
‑
ttttgattgttt
‑
tcattactt
‑
a
‑
tcattactt
‑
a
‑
(tcattactt
‑
a)
n
‑
tcattactt
‑
a(5≤n≤250)、
45.tattattgg
‑
t
‑
tattattgg
‑
t
‑
tattattgg
‑
ttt
‑
ttcttactc
‑
a
‑
ttcttactc
‑
a
‑
(ttcttactc
‑
a)
n
‑
ttcttactc
‑
a(5≤n≤250)。
46.本发明优选的技术方案中，dna/rna连接链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
47.aaauuccucuaccaccuaca、
48.aaattcctctaccacctacatcac、tatttagtgttcgaatagtt、
49.tatttagtgttcgaatagttcgatctag、
50.aattctatgacaccgccacgccctatatcctcgcaataaccc、
51.gtttcctatatttagcgtccgtgtcgttctcccgcgcaacag、
52.gaatccaaatcgtccgttagcagtgaaccgtaccgtctcaat、
53.caagtctagtccaaggtccgtcaaggtctccgacgcatactc、
54.agttcctgtagtatcccgtcgcatagtcgtacattcaccgtc、
55.aaauuccucuaccaccuacaucac。
56.本发明优选的技术方案中，dna/rna检测链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
57.待检测信号
‑
tt
‑
taggtttat
‑
t
‑
taggtttat
‑
t、
58.待检测信号
‑
tt
‑
atgatgatg
‑
t
‑
atgatgatg
‑
t、
59.待检测信号
‑
tt
‑
gagagtatt
‑
t
‑
gagagtatt
‑
t、
60.待检测信号
‑
tt
‑
gttaagttg
‑
t
‑
gttaagttg
‑
t、
61.待检测信号
‑
tt
‑
gtaaatgaa
‑
t
‑
gtaaatgaa
‑
t、
62.待检测信号
‑
tt
‑
ttttgattg
‑
t
‑
ttttgattg
‑
t、
63.待检测信号
‑
tt
‑
tattattgg
‑
t
‑
tattattgg
‑
t、
64.待检测信号
‑
tt
‑
gtaaatgaa
‑
t
‑
gtaaatgaa
‑
t、
65.待检测信号
‑
tt
‑
ggtagaaaa
‑
t
‑
ggtagaaaa
‑
t、
66.待检测信号
‑
tt
‑
ataaaagga
‑
t
‑
ataaaagga
‑
t、
67.待检测信号
‑
tt
‑
aatgaaaga
‑
t
‑
aatgaaaga
‑
t、
68.待检测信号
‑
tt
‑
agtgaataa
‑
t
‑
agtgaataa
‑
t、
69.待检测信号
‑
tt
‑
aagtaatga
‑
t
‑
aagtaatga
‑
t、
70.待检测信号
‑
tt
‑
gagtaagaa
‑
t
‑
gagtaagaa
‑
t、
71.待检测信号
‑
uu
‑
guaaaugaa
‑
u
‑
guaaaugaa
‑
u。
72.本发明的另一目的在于提供一种利用多重信号放大系统进行组织、细胞病理检测的检测系统，所述检测系统包括组织切片或细胞涂片、待检测抗原或抗体、抗体/抗原
‑
dna/rna连接链、dna/rna放大链、连有待检测信号的dna/rna检测链，其中，多重信号放大系统包括抗体/抗原
‑
dna/rna连接链、dna/rna放大链、连有待检测信号的dna/rna检测链，用于将待检测抗原或抗体的信号放大后进行检测。
73.本发明的优选技术方案中，组织切片、细胞涂片抗原修复后，室温自然冷却，洗涤并加入封闭液进行封闭。
74.本发明的优选技术方案中，加入相应的抗体
‑
dna/rna连接链后洗涤，洗涤为加入固定液固定后洗涤，再加入固定反应终止液反应后洗涤。
75.本发明优选的技术方案中，所述待检测抗原或者抗体可来自人、小鼠、羊、骆驼、兔、细菌、病毒的组织、细胞样本任一种或多种。
76.本发明的优选技术方案中，所述抗体或抗原直接存在于组织切片、细胞涂片样本。
77.本发明优选的技术方案中，所述待检测信号可以连接于dna/rna检测链的任何位置，可以为5’端、3’端、或者检测链中间的任何位置。
78.本发明优选的技术方案中，dna/rna连接链、dna/rna放大链、dna/rna检测链中可含有碱基重复单元。
79.本发明优选的技术方案中，dna/rna放大链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
80.gtgatgtaggtggtagaggaattt
‑
tt
‑
ataaaccta
‑
a
‑
(ataaaccta
‑
a)
n
‑
ataaaccta
‑
a(5≤n≤250)、
81.ctagatcgaactattcgaacactaaata
‑
tt
‑
catcatcat
‑
a
‑
(catcatcat
‑
a)
n
‑
catcatcat
‑
a(5≤n≤250)、
82.gggttattgcgaggatatagggcgtggcggtgtcatagaatt
‑
tt
‑
aatactctc
‑
a
‑
(aatactctc
‑
a)
n
‑
aatactctc
‑
a(5≤n≤250)、
83.ctgttgcgcgggagaacgacacggacgctaaatataggaaac
‑
tt
‑
a
‑
caacttaac
‑
a
‑
(caacttaac
‑
a)
n
‑
caacttaac
‑
a(5≤n≤250)、
84.attgagacggtacggttcactgctaacggacgatttggattc
‑
tt
‑
ttcatttac
‑
a
‑
(ttcatttac
‑
a)
n
‑
ttcatttac
‑
a(5≤n≤250)、
85.gagtatgcgtcggagaccttgacggaccttggactagacttg
‑
tt
‑
caatcaaaa
‑
a
‑
(caatcaaaa
‑
a)
n
‑
caatcaaaa
‑
a(5≤n≤250)、
86.gacggtgaatgtacgactatgcgacgggatactacaggaact
‑
tt
‑
ccaataata
‑
a
‑
(ccaataata
‑
a)
n
‑
ccaataata
‑
a(5≤n≤250)、
87.taggtttat
‑
t
‑
taggtttat
‑
t
‑
taggtttat
‑
ttt
‑
ttcatttac
‑
a
‑
(ttcatttac
‑
a)
n
‑
ttcatttac
‑
a(5≤n≤250)、
88.atgatgatg
‑
t
‑
atgatgatg
‑
t
‑
atgatgatg
‑
ttt
‑
ttttctacc
‑
a
‑
(ttttctacc
‑
a)
n
‑
ttttctacc
‑
a(5≤n≤250)、
89.gagagtatt
‑
t
‑
gagagtatt
‑
t
‑
gagagtatt
‑
ttt
‑
tccttttat
‑
a
‑
(tccttttat
‑
a)
n
‑
tccttttat
‑
a(5≤n≤250)、
90.gttaagttg
‑
t
‑
gttaagttg
‑
t
‑
gttaagttg
‑
ttt
‑
ccttctatt
‑
a
‑
(ccttctatt
‑
a)
n
‑
ccttctatt
‑
a(5≤n≤250)、
91.gtaaatgaa
‑
t
‑
gtaaatgaa
‑
t
‑
gtaaatgaa
‑
ttt
‑
ttattcact
‑
a
‑
ttattcact
‑
a
‑
(ttattcact
‑
a)
n
‑
ttattcact
‑
a(5≤n≤250)、
92.ttttgattg
‑
t
‑
ttttgattg
‑
t
‑
ttttgattgttt
‑
tcattactt
‑
a
‑
tcattactt
‑
a
‑
(tcattactt
‑
a)
n
‑
tcattactt
‑
a(5≤n≤250)、
93.tattattgg
‑
t
‑
tattattgg
‑
t
‑
tattattgg
‑
ttt
‑
ttcttactc
‑
a
‑
ttcttactc
‑
a
‑
(ttcttactc
‑
a)
n
‑
ttcttactc
‑
a(5≤n≤250)。
94.本发明优选的技术方案中，dna/rna连接链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
95.aaauuccucuaccaccuaca、
96.aaattcctctaccacctacatcac、tatttagtgttcgaatagtt、
97.tatttagtgttcgaatagttcgatctag、
98.aattctatgacaccgccacgccctatatcctcgcaataaccc、
99.gtttcctatatttagcgtccgtgtcgttctcccgcgcaacag、
100.gaatccaaatcgtccgttagcagtgaaccgtaccgtctcaat、
101.caagtctagtccaaggtccgtcaaggtctccgacgcatactc、
102.agttcctgtagtatcccgtcgcatagtcgtacattcaccgtc、
103.aaauuccucuaccaccuacaucac。
104.本发明优选的技术方案中，dna/rna检测链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
105.待检测信号
‑
tt
‑
taggtttat
‑
t
‑
taggtttat
‑
t、
106.待检测信号
‑
tt
‑
atgatgatg
‑
t
‑
atgatgatg
‑
t、
107.待检测信号
‑
tt
‑
gagagtatt
‑
t
‑
gagagtatt
‑
t、
108.待检测信号
‑
tt
‑
gttaagttg
‑
t
‑
gttaagttg
‑
t、
109.待检测信号
‑
tt
‑
gtaaatgaa
‑
t
‑
gtaaatgaa
‑
t、
110.待检测信号
‑
tt
‑
ttttgattg
‑
t
‑
ttttgattg
‑
t、
111.待检测信号
‑
tt
‑
tattattgg
‑
t
‑
tattattgg
‑
t、
112.待检测信号
‑
tt
‑
gtaaatgaa
‑
t
‑
gtaaatgaa
‑
t、
113.待检测信号
‑
tt
‑
ggtagaaaa
‑
t
‑
ggtagaaaa
‑
t、
114.待检测信号
‑
tt
‑
ataaaagga
‑
t
‑
ataaaagga
‑
t、
115.待检测信号
‑
tt
‑
aatgaaaga
‑
t
‑
aatgaaaga
‑
t、
116.待检测信号
‑
tt
‑
agtgaataa
‑
t
‑
agtgaataa
‑
t、
117.待检测信号
‑
tt
‑
aagtaatga
‑
t
‑
aagtaatga
‑
t、
118.待检测信号
‑
tt
‑
gagtaagaa
‑
t
‑
gagtaagaa
‑
t、
119.待检测信号
‑
uu
‑
guaaaugaa
‑
u
‑
guaaaugaa
‑
u。
120.本发明的目的在于提供一种多重信号放大系统，所述多重信号放大系统包括连有待检测信号的dna/rna检测链、dna/rna放大链、dna/rna连接链、抗体或抗原分子、连接dna/rna连接链与抗体或抗原的连接中间体，其中，dna/rna检测链与dna/rna连接链可互补配对后连接，或者，dna/rna检测链通过dna/rna放大链与dna/rna连接链连接，其中，各链之间通过碱基互补配对可相互连接。
121.本发明优选的技术方案中，一个抗体或抗原的连接中间体可以连接一条或多条dna/rna连接链。
122.本发明优选的技术方案中，所述dna/rna检测链与dna/rna连接链互补配对为dna/rna检测链的碱基可直接与dna/rna连接链的碱基互补配对。
123.本发明优选的技术方案中，dna/rna检测链直接与dna/rna连接链互补配对时，互补配对部分碱基长度为5
‑
180个碱基对，优选为7
‑
140个，更优选为8
‑
100个，再优选9
‑
70个，还优选10
‑
50个。
124.本发明71优选的技术方案中，所述dna/rna检测链通过dna/rna放大链与dna/rna连接链连接时，dna/rna连接链与一条或多条dna/rna放大链的部分片段的碱基互补配对，同时dna/rna放大链的部分片段与一条或多条dna/rna检测链的碱基互补配对。
125.本发明优选的技术方案中，所述dna/rna检测链通过dna/rna放大链与dna/rna连接链连接时，dna/rna连接链与一条或多条dna/rna放大链部分片段碱基互补配对，然后，所述dna/rna放大链再与一条或多条dna/rna放大链部分片段的碱基互补配对，同时后者dna/rna放大链部分片段与一条或多条dna/rna检测链的碱基互补配对。
126.本发明优选的技术方案中，所述dna/rna检测链通过dna/rna放大链与dna/rna连接链连接时，dna/rna连接链与一级dna/rna放大链的部分片段的碱基互补配对，一级dna/rna放大链与一条或多条二级dna/rna放大链部分片段的碱基互补配对，同时二级dna/rna放大链与一条或多条dna/rna检测链的碱基互补配对。
127.本发明优选的技术方案中，根据需要二级放大链可连接三级放大链，三级放大链连接四级放大链，依次连接，实现多级放大。
128.本发明优选的技术方案中，所述多条放大链为两条及以上放大链。
129.本发明优选的技术方案中，所述多级放大为两级及以上放大。
130.本发明优选的技术方案中，所述dna/rna连接链全部碱基或者部分片段的碱基可与dna/rna放大链或者dna/rna检测链通过碱基互补配对连接。
131.本发明优选的技术方案中，所述dna/rna检测链全部碱基或者部分片段的碱基可
与dna/rna放大链或者dna/rna连接链通过碱基互补配对连接。
132.本发明优选的技术方案中，dna/rna检测链与dna/rna放大链部分片段互补配对时，配对部分碱基长度为5
‑
180个碱基对，优选为7
‑
140个，更优选为8
‑
100个，再优选9
‑
70个，还优选10
‑
50个。
133.本发明优选的技术方案中，一条dna/rna放大链与其他多条放大链的部分片段互补配对时，配对部分碱基长度为5
‑
180个碱基对，优选为7
‑
140个，更优选为8
‑
100个，再优选9
‑
70个，还优选10
‑
50个。
134.本发明优选的技术方案中，不同级dna/rna放大链之间互补配对时(例如，一级连接二级时，二级连接三级时，以此类推)，配对部分碱基长度为5
‑
180个碱基对，优选为7
‑
140个，更优选为8
‑
100个，再优选9
‑
70个，还优选10
‑
50个。
135.本发明优选的技术方案中，dna/rna放大链与dna/rna连接链互补配对时，配对部分碱基长度为5
‑
180个碱基对，优选为7
‑
140个，更优选为8
‑
100个，再优选9
‑
70个，还优选10
‑
50个。
136.本发明的优选技术方案中，dna/rna连接链之间、同一级dna/rna放大链之间(例如，一级链之间的配对，二级链之间的配对)、dna/rna检测链之间的可配对部分碱基长度为0
‑
5个碱基对。
137.本发明优选的技术方案中，所述多重信号放大系统的连接链与放大链、放大链与放大链、放大链与检测链、连接链与检测链之间可进行一轮或多轮检测。
138.本发明优选的技术方案中，每一轮检测后下一轮检测前采用洗脱液解离洗脱掉的位置可以为检测链与放大链互补配对的位置、放大链与放大链互补配对的位置、放大链与连接链互补配对的位置、检测链与连接链互补配对的位置。
139.本发明优选的技术方案中，通过调节洗脱液的浓度实现不同位置的解离。
140.本发明优选的技术方案中，dna/rna连接链、dna/rna放大链、dna/rna检测链中可含有碱基重复单元。
141.本发明优选的技术方案中，所述dna/rna放大链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
142.gtgatgtaggtggtagaggaattt
‑
tt
‑
ataaaccta
‑
a
‑
(ataaaccta
‑
a)
n
‑
ataaaccta
‑
a(5≤n≤250)、
143.ctagatcgaactattcgaacactaaata
‑
tt
‑
catcatcat
‑
a
‑
(catcatcat
‑
a)
n
‑
catcatcat
‑
a(5≤n≤250)、
144.gggttattgcgaggatatagggcgtggcggtgtcatagaatt
‑
tt
‑
aatactctc
‑
a
‑
(aatactctc
‑
a)
n
‑
aatactctc
‑
a(5≤n≤250)、
145.ctgttgcgcgggagaacgacacggacgctaaatataggaaac
‑
tt
‑
a
‑
caacttaac
‑
a
‑
(caacttaac
‑
a)
n
‑
caacttaac
‑
a(5≤n≤250)、
146.attgagacggtacggttcactgctaacggacgatttggattc
‑
tt
‑
ttcatttac
‑
a
‑
(ttcatttac
‑
a)
n
‑
ttcatttac
‑
a(5≤n≤250)、
147.gagtatgcgtcggagaccttgacggaccttggactagacttg
‑
tt
‑
caatcaaaa
‑
a
‑
(caatcaaaa
‑
a)
n
‑
caatcaaaa
‑
a(5≤n≤250)、
148.gacggtgaatgtacgactatgcgacgggatactacaggaact
‑
tt
‑
ccaataata
‑
a
‑
(ccaataata
‑
a)
n
‑
ccaataata
‑
a(5≤n≤250)、
149.taggtttat
‑
t
‑
taggtttat
‑
t
‑
taggtttat
‑
ttt
‑
ttcatttac
‑
a
‑
(ttcatttac
‑
a)
n
‑
ttcatttac
‑
a(5≤n≤250)、
150.atgatgatg
‑
t
‑
atgatgatg
‑
t
‑
atgatgatg
‑
ttt
‑
ttttctacc
‑
a
‑
(ttttctacc
‑
a)
n
‑
ttttctacc
‑
a(5≤n≤250)、
151.gagagtatt
‑
t
‑
gagagtatt
‑
t
‑
gagagtatt
‑
ttt
‑
tccttttat
‑
a
‑
(tccttttat
‑
a)
n
‑
tccttttat
‑
a(5≤n≤250)、
152.gttaagttg
‑
t
‑
gttaagttg
‑
t
‑
gttaagttg
‑
ttt
‑
ccttctatt
‑
a
‑
(ccttctatt
‑
a)
n
‑
ccttctatt
‑
a(5≤n≤250)、
153.gtaaatgaa
‑
t
‑
gtaaatgaa
‑
t
‑
gtaaatgaa
‑
ttt
‑
ttattcact
‑
a
‑
ttattcact
‑
a
‑
(ttattcact
‑
a)
n
‑
ttattcact
‑
a(5≤n≤250)、
154.ttttgattg
‑
t
‑
ttttgattg
‑
t
‑
ttttgattgttt
‑
tcattactt
‑
a
‑
tcattactt
‑
a
‑
(tcattactt
‑
a)
n
‑
tcattactt
‑
a(5≤n≤250)、
155.tattattgg
‑
t
‑
tattattgg
‑
t
‑
tattattgg
‑
ttt
‑
ttcttactc
‑
a
‑
ttcttactc
‑
a
‑
(ttcttactc
‑
a)
n
‑
ttcttactc
‑
a(5≤n≤250)。
156.本发明优选的技术方案中，所述dna/rna连接链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
157.aaauuccucuaccaccuaca、
158.aaattcctctaccacctacatcac、
159.tatttagtgttcgaatagtt、
160.tatttagtgttcgaatagttcgatctag、
161.aattctatgacaccgccacgccctatatcctcgcaataaccc、
162.gtttcctatatttagcgtccgtgtcgttctcccgcgcaacag、
163.gaatccaaatcgtccgttagcagtgaaccgtaccgtctcaat、
164.caagtctagtccaaggtccgtcaaggtctccgacgcatactc、
165.agttcctgtagtatcccgtcgcatagtcgtacattcaccgtc、
166.aaauuccucuaccaccuacaucac。
167.本发明优选的技术方案中，所述dna/rna检测链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
168.待检测信号
‑
tt
‑
taggtttat
‑
t
‑
taggtttat
‑
t、
169.待检测信号
‑
tt
‑
atgatgatg
‑
t
‑
atgatgatg
‑
t、
170.待检测信号
‑
tt
‑
gagagtatt
‑
t
‑
gagagtatt
‑
t、
171.待检测信号
‑
tt
‑
gttaagttg
‑
t
‑
gttaagttg
‑
t、
172.待检测信号
‑
tt
‑
gtaaatgaa
‑
t
‑
gtaaatgaa
‑
t、
173.待检测信号
‑
tt
‑
ttttgattg
‑
t
‑
ttttgattg
‑
t、
174.待检测信号
‑
tt
‑
tattattgg
‑
t
‑
tattattgg
‑
t、
175.待检测信号
‑
tt
‑
gtaaatgaa
‑
t
‑
gtaaatgaa
‑
t、
176.待检测信号
‑
tt
‑
ggtagaaaa
‑
t
‑
ggtagaaaa
‑
t、
177.待检测信号
‑
tt
‑
ataaaagga
‑
t
‑
ataaaagga
‑
t、
178.待检测信号
‑
tt
‑
aatgaaaga
‑
t
‑
aatgaaaga
‑
t、
179.待检测信号
‑
tt
‑
agtgaataa
‑
t
‑
agtgaataa
‑
t、
180.待检测信号
‑
tt
‑
aagtaatga
‑
t
‑
aagtaatga
‑
t、
181.待检测信号
‑
tt
‑
gagtaagaa
‑
t
‑
gagtaagaa
‑
t、
182.待检测信号
‑
uu
‑
guaaaugaa
‑
u
‑
guaaaugaa
‑
u。
183.本发明优选的技术方案中，所述连接中间体两端或中间任意位置双功能化，一官能团连接抗体或抗原上对应的官能团，另一官能团连接dna/rna连接链上对应的官能团，连接中间体的双官能团中两种官能团的比例为一比一或一比多的任一种或多种。
184.本发明优选的技术方案中，所述抗体、抗原、dna或rna上用于与连接中间体反应或连接的官能团包括但不限于氨基、羧基、羟基、巯基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或多种。
185.本发明优选的技术方案中，所述连接中间体上的双官能团中的一种官能团与抗原或抗体上的包括但不限于氨基、羧基、羟基、巯基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或多种官能团反应连接。
186.本发明优选的技术方案中，所述连接中间体上的双官能团中的另一种官能团可以与dna/rna上的包括但不限于氨基、羧基、羟基、巯基、腙基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或多种官能团反应连接。
187.本发明优选的技术方案中，所述与连接中间体相连的抗体或抗原分子，一个抗体或抗原分子可连接一个或同时连接多个连接中间体。
188.本发明优选的技术方案中，所述与连接中间体相连的dna连接链，一个一个连接中间体可连接一个或同时连接多个dna连接链。
189.本发明优选的技术方案中，所述检测链连接有待检测信号。
190.本发明优选的技术方案中，所述待检测信号可以连接于dna/rna检测链的任何位置，可以为5’端、3’端、或者检测链中间的任何位置。
191.本发明优选的技术方案中，所述待检测信号选自但不限于荧光、磷光、化学发光、电磁信号、核磁信号、放射性信号中的任一种或其组合。
192.本发明优选的技术方案中，所述多重信号放大系统可应用于免疫吸附直接法的检测中。
193.本发明的另一目的在于提供一种信号放大系统，所述的信号放大系统采用dna/rna放大链，其中，所述的dna/rna放大链可为一条或多条。
194.本发明的优选技术方案中，所述的dna/rna放大链可为一级放大或多级放大。
195.本发明的优选技术方案中，当dna/rna放大链为一条或多条时，dna/rna放大链部分片段与dna/rna连接链碱基互补配对，同时dna/rna放大链的部分片段与一条或多条dna/rna检测链的碱基互补配对。本发明的优选技术方案中，当dna/rna放大链为多条时，一条dna/rna放大链部分片段与dna/rna检测链互补配对，同时与其他多条dna/rna放大链互补配对。
196.本发明优选的技术方案中，当dna/rna放大链为多条时，dna/rna连接链与一条或多条dna/rna放大链部分片段碱基互补配对，然后，所述dna/rna放大链再与一条或多条dna/rna放大链部分片段的碱基互补配对，同时后者dna/rna放大链部分片段与一条或多条
dna/rna检测链的碱基互补配对。
197.本发明优选的技术方案中，当dna/rna放大链为多级放大时，dna/rna连接链与一级dna/rna放大链的部分片段的碱基互补配对，一级dna/rna放大链与一条或多条二级dna/rna放大链部分片段的碱基互补配对，同时二级dna/rna放大链与一条或多条dna/rna检测链的碱基互补配对。
198.本发明优选的技术方案中，所述dna/rna连接链全部碱基或者部分片段的碱基可与dna/rna放大链或者dna/rna检测链通过碱基互补配对连接。
199.本发明优选的技术方案中，所述dna/rna检测链全部碱基或者部分片段的碱基可与dna/rna放大链或者dna/rna连接链通过碱基互补配对连接。
200.本发明优选的技术方案中，根据需要二级放大链可连接三级放大链，三级放大链连接四级放大链，依次连接，实现多级放大。
201.本发明优选的技术方案中，所述多条放大链为两条及以上放大链。
202.本发明优选的技术方案中，所述多级放大为两级及以上放大。
203.本发明的另一目的在于提供一种dna/rna放大链，该放大链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
204.gtgatgtaggtggtagaggaattt
‑
tt
‑
ataaaccta
‑
a
‑
(ataaaccta
‑
a)n
‑
ataaaccta
‑
a(5≤n≤250)、
205.ctagatcgaactattcgaacactaaata
‑
tt
‑
catcatcat
‑
a
‑
(catcatcat
‑
a)n
‑
catcatcat
‑
a(5≤n≤250)、
206.gggttattgcgaggatatagggcgtggcggtgtcatagaatt
‑
tt
‑
aatactctc
‑
a
‑
(aatactctc
‑
a)n
‑
aatactctc
‑
a(5≤n≤250)、
207.ctgttgcgcgggagaacgacacggacgctaaatataggaaac
‑
tt
‑
a
‑
caacttaac
‑
a
‑
(caacttaac
‑
a)n
‑
caacttaac
‑
a(5≤n≤250)、
208.attgagacggtacggttcactgctaacggacgatttggattc
‑
tt
‑
ttcatttac
‑
a
‑
(ttcatttac
‑
a)n
‑
ttcatttac
‑
a(5≤n≤250)、
209.gagtatgcgtcggagaccttgacggaccttggactagacttg
‑
tt
‑
caatcaaaa
‑
a
‑
(caatcaaaa
‑
a)n
‑
caatcaaaa
‑
a(5≤n≤250)、
210.gacggtgaatgtacgactatgcgacgggatactacaggaact
‑
tt
‑
ccaataata
‑
a
‑
(ccaataata
‑
a)n
‑
ccaataata
‑
a(5≤n≤250)、
211.taggtttat
‑
t
‑
taggtttat
‑
t
‑
taggtttat
‑
ttt
‑
ttcatttac
‑
a
‑
(ttcatttac
‑
a)n
‑
ttcatttac
‑
a(5≤n≤250)、
212.atgatgatg
‑
t
‑
atgatgatg
‑
t
‑
atgatgatg
‑
ttt
‑
ttttctacc
‑
a
‑
(ttttctacc
‑
a)n
‑
ttttctacc
‑
a(5≤n≤250)、
213.gagagtatt
‑
t
‑
gagagtatt
‑
t
‑
gagagtatt
‑
ttt
‑
tccttttat
‑
a
‑
(tccttttat
‑
a)n
‑
tccttttat
‑
a(5≤n≤250)、
214.gttaagttg
‑
t
‑
gttaagttg
‑
t
‑
gttaagttg
‑
ttt
‑
ccttctatt
‑
a
‑
(ccttctatt
‑
a)n
‑
ccttctatt
‑
a(5≤n≤250)、
215.gtaaatgaa
‑
t
‑
gtaaatgaa
‑
t
‑
gtaaatgaa
‑
ttt
‑
ttattcact
‑
a
‑
ttattcact
‑
a
‑
(ttattcact
‑
a)n
‑
ttattcact
‑
a(5≤n≤250)、
216.ttttgattg
‑
t
‑
ttttgattg
‑
t
‑
ttttgattgttt
‑
tcattactt
‑
a
‑
tcattactt
‑
a
‑
(tcattactt
‑
a)n
‑
tcattactt
‑
a(5≤n≤250)、
217.tattattgg
‑
t
‑
tattattgg
‑
t
‑
tattattgg
‑
ttt
‑
ttcttactc
‑
a
‑
ttcttactc
‑
a
‑
(ttcttactc
‑
a)
n
‑
ttcttactc
‑
a(5≤n≤250)。
218.本发明的另一目的在于提供一种dna/rna连接链，该连接链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
219.aaauuccucuaccaccuaca、
220.aaattcctctaccacctacatcac、
221.tatttagtgttcgaatagtt、
222.tatttagtgttcgaatagttcgatctag、
223.aattctatgacaccgccacgccctatatcctcgcaataaccc、
224.gtttcctatatttagcgtccgtgtcgttctcccgcgcaacag、
225.gaatccaaatcgtccgttagcagtgaaccgtaccgtctcaat、
226.caagtctagtccaaggtccgtcaaggtctccgacgcatactc、
227.agttcctgtagtatcccgtcgcatagtcgtacattcaccgtc、
228.aaauuccucuaccaccuacaucac。
229.本发明的另一目的在于提供一种dna/rna检测链，该检测链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
230.待检测信号
‑
tt
‑
taggtttat
‑
t
‑
taggtttat
‑
t、
231.待检测信号
‑
tt
‑
atgatgatg
‑
t
‑
atgatgatg
‑
t、
232.待检测信号
‑
tt
‑
gagagtatt
‑
t
‑
gagagtatt
‑
t、
233.待检测信号
‑
tt
‑
gttaagttg
‑
t
‑
gttaagttg
‑
t、
234.待检测信号
‑
tt
‑
gtaaatgaa
‑
t
‑
gtaaatgaa
‑
t、
235.待检测信号
‑
tt
‑
ttttgattg
‑
t
‑
ttttgattg
‑
t、
236.待检测信号
‑
tt
‑
tattattgg
‑
t
‑
tattattgg
‑
t、
237.待检测信号
‑
tt
‑
gtaaatgaa
‑
t
‑
gtaaatgaa
‑
t、
238.待检测信号
‑
tt
‑
ggtagaaaa
‑
t
‑
ggtagaaaa
‑
t、
239.待检测信号
‑
tt
‑
ataaaagga
‑
t
‑
ataaaagga
‑
t、
240.待检测信号
‑
tt
‑
aatgaaaga
‑
t
‑
aatgaaaga
‑
t、
241.待检测信号
‑
tt
‑
agtgaataa
‑
t
‑
agtgaataa
‑
t、
242.待检测信号
‑
tt
‑
aagtaatga
‑
t
‑
aagtaatga
‑
t、
243.待检测信号
‑
tt
‑
gagtaagaa
‑
t
‑
gagtaagaa
‑
t、
244.待检测信号
‑
uu
‑
guaaaugaa
‑
u
‑
guaaaugaa
‑
u。
245.本发明的另一目的在于提供一种多重信号放大系统的制备方法，包括抗原或抗体
‑
dna/rna连接链的制备、dna/rna放大链的制备。
246.本发明优选的技术方案中，所述抗原或抗体
‑
dna/rna连接链的制备为抗体或抗原通过连接中间体与dna/rna连接链相连，其中，所述连接中间体具有双官能团，一官能团与抗体或抗原相连，另一官能团与dna/rna连接链相连。
247.本发明优选的技术方案中，所述抗体或抗原或者dna连接链上的用于与连接中间
体连接的官能团包括但不限于腙基、氨基、羧基、羟基、巯基、炔基、叠氮基团、烯基中的任一种或多种。
248.本发明优选的技术方案中，所述连接中间体的双官能团中一个官能团可与氨基反应连接，另一官能团可与羧基反应连接；或者一个官能团可以氨基反应连接，另一官能团可与羟基的反应连接；或者一个官能团可与氨基反应连接，另一官能团可与巯基反应连接；或者一个官能团可与羧基结合，另一官能团可与羟基结合；或者一个官能团可与羧基反应连接，另一官能团可与巯基反应连接；或者一个官能团可与羟基反应连接，另一官能团可与巯基反应连接；或任何其他可行的连接方案。
249.本发明优选的技术方案中，抗体或抗原上的氨基与连接中间体上的一个官能团反应连接，而dna/rna连接链上的巯基与连接中间体上的另一个官能团反应连接。
250.本发明优选的技术方案中，所述抗原或抗体
‑
dna/rna连接链的制备包括下述步骤：
251.(1)将抗原或抗体、连接中间体，按摩尔比1:0.01
‑
1:10000进行混合，0
‑
50℃反应，形成抗原或抗体
‑
连接中间体；
252.(2)将抗原或抗体
‑
连接中间体、dna/rna连接链，按摩尔比1:0.01
‑
1:10000进行混合，0
‑
50℃反应，形成抗原或抗体
‑
dna/rna连接链。
253.本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，抗体或抗原、连接中间体的摩尔比为1:0.05
‑
1:1000，优选为1:0.1
‑
1:100。
254.本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，反应温度为1
‑
25℃，优选为2
‑
8℃。
255.本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，抗原或抗体
‑
连接中间体可通过脱盐离心柱或超滤进行纯化。
256.本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，抗原或抗体
‑
连接中间体、dna/rna连接链的摩尔比为1:0.05
‑
1:1000，优选为1:0.1
‑
1:100。
257.本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，反应温度为1
‑
25℃，优选为2
‑
8℃。
258.本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，所述的抗原或抗体
‑
dna/rna连接链可采用超滤离心纯化或透析纯化。
259.本发明优选的技术方案中，所述抗原或抗体
‑
dna/rna连接链连接成功的验证方法，包括使用质谱进行验证。
260.本发明优选的技术方案中，所述质谱选自基质辅助激光解吸飞行时间质谱(maldi
‑
tof)、电喷雾离子化质谱(esi
‑
ms)的任一种或其组合。
261.本发明的优选技术方案中，dna/rna放大链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
262.gtgatgtaggtggtagaggaattt
‑
tt
‑
ataaaccta
‑
a
‑
(ataaaccta
‑
a)n
‑
ataaaccta
‑
a(5≤n≤250)、
263.ctagatcgaactattcgaacactaaata
‑
tt
‑
catcatcat
‑
a
‑
(catcatcat
‑
a)n
‑
catcatcat
‑
a(5≤n≤250)、
264.gggttattgcgaggatatagggcgtggcggtgtcatagaatt
‑
tt
‑
aatactctc
‑
a
‑
(aatactctc
‑
a)n
‑
aatactctc
‑
a(5≤n≤250)、
265.ctgttgcgcgggagaacgacacggacgctaaatataggaaac
‑
tt
‑
a
‑
caacttaac
‑
a
‑
(caacttaac
‑
a)n
‑
caacttaac
‑
a(5≤n≤250)、
266.attgagacggtacggttcactgctaacggacgatttggattc
‑
tt
‑
ttcatttac
‑
a
‑
(ttcatttac
‑
a)n
‑
ttcatttac
‑
a(5≤n≤250)、
267.gagtatgcgtcggagaccttgacggaccttggactagacttg
‑
tt
‑
caatcaaaa
‑
a
‑
(caatcaaaa
‑
a)n
‑
caatcaaaa
‑
a(5≤n≤250)、
268.gacggtgaatgtacgactatgcgacgggatactacaggaact
‑
tt
‑
ccaataata
‑
a
‑
(ccaataata
‑
a)n
‑
ccaataata
‑
a(5≤n≤250)、
269.taggtttat
‑
t
‑
taggtttat
‑
t
‑
taggtttat
‑
ttt
‑
ttcatttac
‑
a
‑
(ttcatttac
‑
a)n
‑
ttcatttac
‑
a(5≤n≤250)、
270.atgatgatg
‑
t
‑
atgatgatg
‑
t
‑
atgatgatg
‑
ttt
‑
ttttctacc
‑
a
‑
(ttttctacc
‑
a)n
‑
ttttctacc
‑
a(5≤n≤250)、
271.gagagtatt
‑
t
‑
gagagtatt
‑
t
‑
gagagtatt
‑
ttt
‑
tccttttat
‑
a
‑
(tccttttat
‑
a)n
‑
tccttttat
‑
a(5≤n≤250)、
272.gttaagttg
‑
t
‑
gttaagttg
‑
t
‑
gttaagttg
‑
ttt
‑
ccttctatt
‑
a
‑
(ccttctatt
‑
a)n
‑
ccttctatt
‑
a(5≤n≤250)、
273.gtaaatgaa
‑
t
‑
gtaaatgaa
‑
t
‑
gtaaatgaa
‑
ttt
‑
ttattcact
‑
a
‑
ttattcact
‑
a
‑
(ttattcact
‑
a)n
‑
ttattcact
‑
a(5≤n≤250)、
274.ttttgattg
‑
t
‑
ttttgattg
‑
t
‑
ttttgattgttt
‑
tcattactt
‑
a
‑
tcattactt
‑
a
‑
(tcattactt
‑
a)n
‑
tcattactt
‑
a(5≤n≤250)、
275.tattattgg
‑
t
‑
tattattgg
‑
t
‑
tattattgg
‑
ttt
‑
ttcttactc
‑
a
‑
ttcttactc
‑
a
‑
(ttcttactc
‑
a)n
‑
ttcttactc
‑
a(5≤n≤250)。
276.本发明优选的技术方案中，所述dna/rna放大链的制备方法包括下述步骤：
277.(1)将聚合酶和相应的引物按一定比例混合并反应一定时间；
278.(2)反应完成后，灭活聚合酶，制得的dna/rna放大链反应产物；
279.(3)所得dna/rna放大链直接使用或进行纯化后使用。
280.本发明优选的技术方案中，所述dna/rna放大链合成后不纯化直接使用。本发明优选的技术方案中，所述dna/rna放大链合成后纯化时所采用的纯化方法包括但不限于切胶回收、高效液相色谱法，凝胶渗透色谱法、离子交换色谱法、超滤离心、透析、沉淀法、结晶法等纯化方法中的一种或多种。
281.本发明的优选技术方案中，dna/rna连接链包括但不限于以下序列(5’端到3’端序列)：
282.aaauuccucuaccaccuaca、
283.aaattcctctaccacctacatcac、
284.tatttagtgttcgaatagtt、
285.tatttagtgttcgaatagttcgatctag、
286.aattctatgacaccgccacgccctatatcctcgcaataaccc、
287.gtttcctatatttagcgtccgtgtcgttctcccgcgcaacag、
288.gaatccaaatcgtccgttagcagtgaaccgtaccgtctcaat、
289.caagtctagtccaaggtccgtcaaggtctccgacgcatactc、
290.agttcctgtagtatcccgtcgcatagtcgtacattcaccgtc、
291.aaauuccucuaccaccuacaucac。
292.本发明的另一目的在于多重信号放大系统在组织、细胞病理检测中的应用。
293.本发明的另一目的在于多重信号放大检测系统在组织、细胞病理检测中的应用。
294.本发明中，“dna/rna”是指dna或rna。
295.本发明中，“抗体/抗原”是指抗体或抗原。
296.与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：
297.1、本发明是一种基于dna或rna互补配对的信号放大系统，通过dna/rna连接链和一条dna/rna放大链连接，dna/rna放大链与多个dna/rna检测链连接，实现信号单级多重放大；另外，dna/rna放大链还可与多个放大链连接，实现二级多重放大，甚至三级以上放大。本发明不仅解除了传统组织、细胞病理检测抗体种属的限制，实现了同时进行多种或超多种抗原或抗体的同时检测，而且信号放大系统实现了超低丰度的待检测抗原或抗体，极大降低了检测限，提升了灵敏度；极大的降低了自动化检测的复杂程度。
298.2、本发明每一轮可以同时检测多种抗原或抗体的浓度。
299.3、本发明可以实现组织、细胞病理样本中抗体或抗原的多轮检测，配合图像配准技术，实现了超过30种抗原或抗体在同一个组织切片、细胞涂片上的检测；而且可实现检测链、放大链、连接链互补配对部分的选择洗脱，对于组织、细胞病理检测适用性更广，降低时间成本和材料成本。
300.4、本发明中可量化偶联到每个抗原或抗体上的dna/rna连接链的数量，对于实现组织、细胞病理检测定量具有巨大的意义。
附图说明
301.图1抗体与dna/rna连接链的缀合过程。抗体与中间连接体结合；抗体缀合中间连接体，制得的抗体
‑
连接中间体偶联物，再与dna/rna连接链结合；抗体与dna/rna连接成为抗体
‑
dna/rna连接链。
302.图2本发明所述检测系统信号放大的原理机制。其中图a表示一级多重信号放大系统示意图，图b表示二级多重信号放大系统示意图。(1)引物z*
‑
a和发夹在酶的催化下，引物不断循环生成长链复合物1:z*
‑
aaaa
…
aa；(2)长链复合物1与抗体上的dna/rna连接链z结合；(3)检测链a*a*与已经连接到抗体上的长链复合物1结合并发光，实现单次多重信号放大；(4)与步骤1同理，引物在a*a*
‑
b和发夹在酶的催化下，引物不断循环生成长链复合物2:a*a*
‑
bbbb
…
bb；(5)长链复合物2与已经连接到抗体上的长链复合物1结合；(6)检测链b*b*与已经连接到抗体上的长链复合物2结合并发光，实现2次多重信号放大。
303.代表抗体。
304.代表互补链。例如单链dna或rna：a链表示某一dna或rna的序列，那么a*表示a链的互补链的序列。
305.代表荧光基团
306.图3二级多重放大系统在组织、细胞病理检测的工作流程。(1)制作合格的组织切片或细胞涂片，并完成抗原修复；(2)抗原与抗体
‑
dna/rna连接链结合；(3)加入一级dna放
大链进行一次信号放大；(4)加入二级dna放大链进行二次信号放大；(5)孵育4条检测链并随之进行检测；
307.代表抗体。
308.代表互补链。例如单链dna或rna：a链表示某一dna或rna片段序列，那么a*表示a链互补链的序列。
309.○
代表抗原1
310.△
代表抗原2
311.代表抗原3
312.□
代表抗原4
313.代表绿色荧光基团a
314.代表红色荧光基团b
315.代表黄色荧光基团c
316.代表紫色荧光基团d
317.图4实施例1中的图像检测结果。
318.图5实施例2中的图像检测结果。
具体实施方式
319.下面列举一部分具体实施例对本发明进行说明，有必要在此指出的是以下具体实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。表1
‑
表6为本发明实施例中dna/rna连接链、dna/rna放大链、dna/rna检测链的序列信息。
320.表1.用于连接抗体的dna/rna连接链序列(从5’端到3’端)
321.dna/rna连接链序列编号dna/rna连接链序列rna连接链1aaauuccucuaccaccuacadna连接链2tatttagtgttcgaatagttdna连接链3aattctatgacaccgccacgccctatatcctcgcaataacccdna连接链4gtttcctatatttagcgtccgtgtcgttctcccgcgcaacagdna连接链5gaatccaaatcgtccgttagcagtgaaccgtaccgtctcaatdna连接链6caagtctagtccaaggtccgtcaaggtctccgacgcatactcdna连接链7agttcctgtagtatcccgtcgcatagtcgtacattcaccgtc
322.表2.用于放大链制备的引物和发夹序列(从5’端到3’端)
[0323][0324][0325]
表3.dna放大链序列(从5’端到3’端)
[0326][0327]
表4.用于荧光检测的dna检测链序列信息(从5’端到3’端)
[0328]
[0329][0330]
表5.实施例1中用于一级多重信号放大组织、细胞病理检测的连接链、放大链和检测链
[0331]
被检测抗原dna/rna连接链dna一级放大链dna/rna检测链cd4rna连接链1c.1i.1*cd68dna连接链2c.2i.2*foxp3dna连接链3c.3i.3*
[0332]
表6.实施例2中用于二级多重信号放大组织成像检测的连接链、放大链和检测链
[0333][0334]
实施例1 采用一级多重放大系统同时检测人扁桃体切片样本的三种抗原
[0335]
本实施例中采用病理成像的方式同时检测扁桃体组织样本三种抗原表达丰度，抗体分别为cd4抗体，cd68抗体，foxp3抗体。
[0336]
一、抗体
‑
dna/rna连接链的制备(以人cd68抗体和dna连接链2的连接为例)
[0337]
(1)将人cd68抗体通过超滤离心(100kda mwco)浓缩至2mg/ml，去除叠氮化物和其他防腐剂。
[0338]
(2)抗体与连接中间体聚乙二醇化的长链sm(peg)2(摩尔比1:20)在4℃反应3小时，sm(peg)2具有双官能团，一个官能团可与抗体上氨基反应连接，另一个官能团可与巯基反应连接。
[0339]
(3)通过脱盐离心柱(7000da mwco)去除多余的sm(peg)2。
[0340]
(4)将巯基化修饰的dna连接链2(tatttagtgttcgaatagtt)与连接中间体修饰的抗体混合(摩尔比15:1)，4℃反应12小时。
[0341]
(5)通过超滤离心管(100kda mwco)纯化抗体
‑
dna连接链。
[0342]
(6)抗体与dna连接成功的验证：使用基质辅助激光解吸飞行时间质谱(maldi
‑
tof)验证是否成功地将dna连接链偶联到抗原上，并量化偶联到每个抗体上的dna数量。结果显示，每个抗体上连接上了1个dna连接链。
[0343]
用同样方法制备其他所需抗体
‑
dna/rna连接链。
[0344]
二、dna放大链的制备(以c.1放大链的制备为例)
[0345]
(1)在100μlpbs反应液中分别加入10mm mgso4，80units/ml的聚合酶，600μm的datp/dctp/dttp，10μm发卡结构h.1.1和10μm相应的引物p.1，将反应液置于37℃反应9小时。
[0346]
(2)反应完成后将反应液置于80℃作用20分钟以灭活酶。
[0347]
(3)将反应产物与蛋白上样缓冲液(含30mm乙二胺四乙酸，50％甘油，0.25％二甲苯青，0.25％溴酚蓝)按照9:1的体积比混合后在95℃反应5分钟。
[0348]
(4)制备6％tbe
‑
urea page胶，采用gelred为染料。
[0349]
(5)凝胶放入电泳液中，将电压调至75v，运行30分钟，在泳道中分别加入样品和dl 1000dna marker，将电压调至200v，运行25分钟。
[0350]
(6)将目的dna条带从凝胶中切下，通过dna回收试剂盒进行纯化回收，冻干回收的dna，
‑
20℃保存。
[0351]
同理制得其他所需放大链。
[0352]
三、采用病理成像的方式同时检测人扁桃体组织样本三种抗原表达丰度
[0353]
(1)将人扁桃体组织样本进行标准透明液脱蜡水化流程后，蒸馏水冲洗2次，用ar9抗原修复液微波修复，预热5min，高火2min，中低火15min；室温自然冷却；用tbst缓冲液洗涤3次，5min/次；用bsa抗体封闭液，室温封闭10min；
[0354]
(2)加入三种一抗dna/rna连接链混合液(一抗dna/rna接连链工作液100ul：cd4 1.0ul；cd68 2.0ul；foxp3 1.0ul，三种连接链的稀释比分别是1:100、1:50、1:100，37℃孵育1h；bsa封闭液洗3次，10min/次；pbs缓冲液洗涤2次，5min/次；
[0355]
(3)加入100ul反应固定液(含bs(peg)5的pbs溶液)，固定30min；再用pbs缓冲液洗涤2次，5min/次，再加入100ul固定反应终止液(含100mm nh4cl的pbs溶液)5min；最终用pbs缓冲液洗涤2次，5min/次，triton洗液洗涤15min；
[0356]
(4)加入三种一级dna放大链(c.1/c.2/c.3浓度范围60nm
‑
150nm)，混合液300ul，42℃ 90min孵育；杂交缓冲液(含ssc和tween
‑
20的水溶液)洗3次，5min/次；信号显示缓冲液洗涤1次，5min；
[0357]
(5)加入rna检测链i.1*、dna检测链i.2*(1μm)和dna检测链i.3*的混合液300ul，42℃孵育1小时.i.1*上连有绿色荧光信号(激发波长485nm，发射波长528nm)，i.2*上连接有红色荧光信号(激发波长579nm，发射波长620nm),i.3*上连接有深红色荧光信号(激发波长650nm,发射波长670nm)；
[0358]
(6)信号显示缓冲液(含有triton
‑
x的pbs溶液)洗涤2次，5min/次；dapi复染细胞核,封片；
[0359]
(7)用vectra 3(perkinelmer,usa)进行成像检测及分析。
[0360]
四、实验结果
[0361]
可实现三种抗体信号同时检出，且强度优于传统的检测技术，其对应抗原的表达模式均精确并符合预期。
[0362]
实施例2 采用二级多重放大系统同时检测人扁桃体切片样本的三种抗原
[0363]
本实施例中采用病理成像的方式检测扁桃体组织样本三种抗原表达丰度，抗体分别为cd4抗体，cd68抗体，foxp3抗体。
[0364]
一、抗体和dna/rna连接链的制备(以cd68抗体和dna连接链2的连接为例)
[0365]
(1)将抗体(cd68)通过超滤离心管(100kda mwco)浓缩到2mg/ml，去除掉叠氮化物和其他防腐剂。
[0366]
(2)通过脱盐离心柱(7000da mwco)将抗体交换至pbs缓冲液中(ph 7.4)。
[0367]
(3)抗体与连接中间体smcc(琥珀酰亚胺基4
‑
[n
‑
马来酰亚胺甲基]环己烷
‑1‑
羧化物)(摩尔比1:20)在4℃下反应3小时。
[0368]
(4)通过脱盐离心柱(7000da mwco)去除多余的连接中间体。
[0369]
(5)将与连接中间体相连接的抗体与巯基化修饰的dna连接链2混合(摩尔比1:15)，4℃下反应12小时。
[0370]
(6)通过超滤离心管(100kda mwco)纯化抗体
‑
dna连接链。
[0371]
(7)抗体与dna连接链连接成功的验证：使用基质辅助激光解吸飞行时间质谱(maldi
‑
tof)验证是否成功地将dna连接链偶联到抗体上，并量化偶联到每个抗体上的dna的数量。实验结果显示，每个抗体上连接上了1个dna连接链。
[0372]
用同样方法制备其他所需抗体
‑
dna/rna连接链。
[0373]
二、dna放大链的制备(以c.1放大链的制备为例)
[0374]
以可以部分互补配对的一级放大链c.1和二级放大链c.8为例。
[0375]
c.1一级放大链的制备同实施例1，c.8二级放大链的制备过程如下：
[0376]
(1)在100μl反应液中分别加入10mm mgso4，80units/ml的聚合酶，600μm的datp/dctp/dttp，10μm h.8.8和10μm相应的引物p.8，将反应液置于37℃作用9小时。
[0377]
(2)反应完成后将反应液置于80℃作用20分钟以灭活酶。
[0378]
(3)将反应产物与蛋白上样缓冲液(含30mm乙二胺四乙酸，50％甘油，0.25％二甲苯青，0.25％溴酚蓝)按照体积比9:1混合后在95℃反应5分钟。
[0379]
(4)制备6％tbe
‑
urea page胶或者1％琼脂糖凝胶，采用gelred为染料。
[0380]
(5)凝胶放入电泳液中，将电压调至75v，运行30分钟，之后在泳道中分别加入样品和dl 1000dna marker，将电压调至200v，运行25分钟。
[0381]
(6)将目的dna条带从凝胶中切下，通过dna回收试剂盒进行纯化回收，回收后的dna进行冻干，之后放入
‑
20℃进行保存。
[0382]
同理制得其他所需放大链。
[0383]
三、采用病理成像的方式同时检测人扁桃体组织样本三种抗原表达丰度
[0384]
(1)人扁桃体组织样本进行标准透明液脱蜡水化，用蒸馏水冲洗2次5min；用ar9抗原修复液微波修复，预热5min，高火2min，中低火15min；室温自然冷却；tbst缓冲液洗涤3次，5min/次；用抗体封闭液，室温封闭10min；
[0385]
(2)加入三种一抗dna/rna连接链混合液(一抗dna/rna接连链工作液100ul：cd4 1.0ul；cd68 2.0ul；foxp3 1.0ul,三种连接链的稀释比分别是1:100、1:50、1:100，37℃孵育1h；bsa封闭液洗3次，10min/次；pbs缓冲液洗涤2次，5min/次；
[0386]
(3)加入100ul反应固定液(含bs(peg)5的pbs溶液)，固定30min；再用pbs缓冲液洗涤2次，5min/次，再加入100ul固定反应终止液(含100mm nh4cl的pbs溶液)5min；最终用pbs缓冲液洗涤2次，5min/次，triton洗液洗涤15min；
[0387]
(4)加入三种一级dna放大链(c.1/c.2/c.3浓度范围60nm
‑
150nm)，混合液300ul，42℃ 90min孵育；杂交缓冲液(含ssc和tween
‑
20的水溶液)洗3次，5min/次；
[0388]
(5)加入三种二级dna放大链(c.8/c.9/c.10浓度范围60nm
‑
150nm)，混合液300ul，37℃60min孵育；
[0389]
(6)信号显示缓冲液(含有triton
‑
x的pbs溶液)洗涤1次，5min/次；
[0390]
(7)加入rna检测链i.1*、dna检测链i.2*(1μm)和dna检测链i.3*的混合液300ul,42℃孵育1小时.i.1*上连有绿色荧光信号(激发波长485nm，发射波长528nm)，i.2*上连接有红色荧光信号(激发波长579nm，发射波长620nm),i.3*上连接有深红色荧光信号(激发波长650nm,发射波长670nm)；
[0391]
(8)信号显示缓冲液洗涤2次，5min/次；
[0392]
(9)dapi复染细胞核,封片；
[0393]
(10)用vectra 3(perkinelmer,usa)进行成像检测及分析。
[0394]
四、实验结果
[0395]
可实现三种抗体信号同时检出，且强度优于一级放大链的检测技术，其对应抗原的表达模式均精确并符合预期。
[0396]
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。