琼氏不动杆菌株MWY001及其在去除污水中的氨氮或总氮中的应用的制作方法

琼氏不动杆菌株mwy001及其在去除污水中的氨氮或总氮中的应用
技术领域
1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种琼氏不动杆菌株mwy001及其在去除污水中的氨氮或总氮中的应用。


背景技术：

2.随着人类社会的快速发展，工农业废水中的氮素含量日益增加，氮是造成水体富营养化和环境污染的一个很重要的污染因子，对高浓度含氮污水的处理显得尤为迫切。
3.传统的生物脱氮是基于好氧自养硝化作用和厌氧异养反硝化的过程，硝化和反硝化不能同时发生，硝化反应在有氧的条件下进行，而反硝化反应需要在严格的厌氧或缺氧的条件下进行。该过程中发生硝化作用的硝化菌是一类自养化能细菌，包括亚硝酸盐菌和硝酸盐菌两个生理菌群，该类型硝化菌世代周期长，对溶解氧、水温、有毒物质敏感。造成了这种传统的工艺水力停留时间长、能耗大，且基建费用高，同时，自养菌在高浓度的氨氮和有机废水中难以存活，从而限制其在处理高浓度氨氮废水中的应用。近年来为了克服这些限制因素，通过分离同步硝化
‑
反硝化细菌，深入研究该菌的生长特性、反硝化特性及其污水脱氮中的应用，对提高污水的脱氮处理效率和经济性有着重要的理论价值和实际意义。
4.近年来多个种属的具有异养硝化
‑
好氧反硝化的细菌被报道，包括粪产碱菌(alcaligenes faecalis)、施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、土壤杆菌属(agrobacterium sp.)、克雷伯氏肺炎杆菌(klebsiella pneumoniae)、芽孢杆菌属(bacillus sp.)等。与自养菌相比，异养硝化细菌具有更高的生长率，在有氧条件下以有机质为碳源和能源将氨氮转变为n2。此外，脱氮过程中产生的碱性可以同步中和产生的酸。从而，利用同步硝化反硝化可以实现低成本运营，以及利用单个反应器达到高速脱氮的良好效果。
5.虽然同步硝化反硝化相关的脱氮菌株已经被报道，但是对其基础的反应机理仍然不够充分，其在废水脱氮中的应用研究绝大部分也仅局限于实验室小试水平，有关其在实际工厂运营中的应用研究鲜有报道。
6.因此，同步硝化反硝化相关脱氮菌株创造价值的瓶颈在于其产业化应用推广，而破解这个瓶颈的前提是要解决以下问题：高效的同步硝化反硝化相关脱氮菌株、工业用菌的规模化高密度培养、与污水运营设施、工况相适应的工艺方法。


技术实现要素：

7.针对现有的产业化应用推广存在的瓶颈，本发明从上海某煤制甲醇化工厂a/o工艺污水处理系统活性污泥中分离出一株可以在好氧条件进行同步进行硝化反硝化的细菌(编号mwy001)，该菌能对焦化废水等高氨氮废水中氨氮进行生物强化处理。该菌是以氨氮为氮源，利用硝化培养基进行不断长期驯化培养，并通过平板稀释涂布法分离纯化得到。
8.该菌为革兰氏阴性，经16s rdna鉴定为acinetobacterjunii(琼氏不动杆菌)，编
号为mwy001，于2021年5月19日保藏于中国典型微生物保藏中心(武汉大学)，编号为cctcc no:m 2021559。该菌株为革兰氏阴性菌，菌落乳白色，边缘整齐，呈圆形，中心凸起。
9.该菌株脱氮性能验证研究表明，在好氧、无碳源培养条件下，19天去除氨氮去除率99％以上，培养过程中，亚硝态氮和硝态氮积累水平较少，说明该菌株实验过程中发生了同步硝化反硝化反应。
10.4l序批式活性污泥法验证表明，进水氨氮100～110mg/l，投加菌种的实验组出水指标要好于未投加菌种的对照组，特别是进水超过400mg/l，两者之间的差异更加显著。
11.50m3a/o装置验证结果发现：系统进水q＝1.0～1.5m3/h，t＝15.3～15.7℃，好氧池do＝3.89～4.4mg/l、缺氧池do<0.5mg/l，好氧池ph＝7.3～7.4，缺氧池ph＝7.6～7.9，mlss＝5100mg/l。实验组以好氧池30m3的0.1％比例投加该菌株种源，其在出水指标、耐冲击性以及冲击后恢复速度等方面具有明显的优势。结合4l序批式活性污泥法验证试验可知，mwy001可以配合只有好氧池，没有缺氧池的污水处理系统工作，去除污水中的氨氮或总氮。
12.本发明的琼氏不动杆菌株mwy001，能有效降低污水中的氨氮、总氮的含量，在各种污染水体治理中具有较高的应用价值。
附图说明：
13.图1为acinetobacterjunii(琼氏不动杆菌)mwy001的菌落形态图。
14.图2为acinetobacterjunii(琼氏不动杆菌)mwy001的硝化反硝化能力效果图。
15.图3为acinetobacterjunii(琼氏不动杆菌)mwy001分子进化遗传分析图。
16.图4为序批式活性污泥法中acinetobacterjunii(琼氏不动杆菌)mwy001对低氨氮焦化废水去除效果图。
17.图5为序批式活性污泥法中acinetobacterjunii(琼氏不动杆菌)mwy001对高氨氮焦化废水去除效果图。
18.图6为a/o一体化生物反应器(s
‑
ibr)连续2天冲击运行效果图。
19.图7为a/o一体化生物反应器(s
‑
ibr)连续10天冲击投加acinetobacter junii(琼氏不动杆菌)mwy001的工程应用效果图。
具体实施方式
20.以下参考附图和具体实施方式来做进一步详细说明。
21.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
22.1、acinetobacter junii(琼氏不动杆菌)mwy001菌株获得及性能验证
23.取活性污泥接种到亚硝化培养基中，30
±
1℃恒温振荡摇床上180r/min振荡培养，7天后将培养的菌液转接到新鲜的培养基中继续培养，根据原始污泥中所含硝化细菌浓度，富集培养6周。亚硝化富集培养基：(nh4)2so
4 2.0g；mnso4·
4h2o 0.01g；mgso4·
7h2o 0.03g；caco
3 5.08g；nah2po
4 0.25g；k2hpo
4 0.75g(磷酸盐单独灭菌，在培养液冷却至室温后加入)，用蒸馏水溶解，定容至1000ml，调ph值为7.8，121℃灭菌30分钟。
24.将6周后的含菌富集培养液培养物加入无菌水试管中，取振荡培养后的富集培养基分别逐级稀释101、102、103、104和105倍，用无菌移液管取0.2ml105倍菌悬液于分离琼脂平
板培养基上，用灭菌涂棒将样品在琼脂培养基表面上均匀涂布，使样品中的菌体在培养基上经培养后能形成单个菌落。置于30
±
1℃培养箱中，有氧条件下培养至长出足够大的菌落，该菌株为革兰氏阴性菌，菌落乳白色，边缘整齐，呈圆形，中心凸起，如图2所示。接种针挑取单菌落，转接到富集培养基中进行扩增培养。重复上述操作，直至获得纯菌种。分离琼脂平板培养基：在亚硝化富集培养基加入2％琼脂，121℃灭菌20分钟。
25.硝化反硝化能力验证表明：在好氧、无碳源培养条件下，初始ph8.0、硫酸铵为5g/l的反应体系中，30℃时，180rpm摇床培养19天后，nh3浓度由初始的89.9mg/l逐步下降至0.5mg/l，硝化反硝化能力如图3所示，培养过程中，亚硝态氮和硝态氮变化趋势呈现“下开口抛物线”规律，培养中期最高积累水平分别小于30mg/l和10mg/l，说明该菌株实验过程中发生了同步硝化反硝化反应。
26.2、acinetobacter junii(琼氏不动杆菌)mwy001菌株的分子生物学鉴定
27.将菌株mwy001送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行鉴定。测序结果在genbank中进行blast比对，发现该菌株的16s rdna与库中的acinetobacter junii 16s rdna序列相似度达到100％，该16s rdna序列长度为1473bp，具体序列见序列表seq id no.1。将blast比对结果利用mega7.0分析软件依照neighbor
‑
joining法建立分子进化遗传分析图，如图1所示。于2021年5月19日保藏于中国典型微生物保藏中心(武汉大学)，编号为cctcc no:m 2021559。
28.3、acinetobacter junii(琼氏不动杆菌)mwy001菌株的高密度扩大培养
29.本方法成功地将该菌株进行了扩大培养，该方法采用三级培养的方式进行，具体实施步骤如下：
30.活菌浓度测定采用稀释平板计数法；用哈希dr1900多参数分光光度计在波长560nm测定发酵液的od值。
31.一级种子液的制备：取一环活化的菌种，接入装液量为50ml一级种子培养基的250ml三角瓶中，30℃，150r/min培养12
‑
15h。培养终点菌液浓度为1
×
105cfu/ml，od值0.1
‑
0.15。
32.二级种子液的制备：取一级种子液40ml，接入装液量为1000ml一级种子培养基的5000ml三角瓶中，30℃，100r/min培养12
‑
18h。培养终点菌液浓度为1
×
107cfu/ml，od值0.2
‑
0.25。
33.一、二级种子液培养基：(nh4)2so
4 0.5g；k2hpo
4 1.3g；mgso4·
7h2o 0.3g；feso4·
7h2o 0.2g；caco
3 1.0g；nahco
3 0.8g；nacl 1.2g；酵母浸出物3.5g；微量元素溶液5ml；蒸馏水1000ml。
34.发酵液的制备：取二级种子液300ml，接入装液量为发酵培养基35l的50l发酵培养罐，30℃，100r/min培养15
‑
24h。培养终点菌液浓度为1
×
10
10
cfu/ml，od值0.1
‑
0.15。
35.发酵液培养基：(1)基础培养基，(nh4)2so
4 0.5g；k2hpo
4 1.3g；mgso4·
7h2o 0.3g；feso4·
7h2o 0.2g；；nacl 1.2g；酵母浸出物3.5g；蒸馏水1000ml；(2)流加培养基，nahco
3 0.8％、1％酵母浸出物+微量元素溶液2％。
36.微量元素溶液：edta 10.0g、znso41.2 g、cacl21.5g、mncl2·
4h2o 1.0g、(nh4)6mo7o
24
·
4h2o 1.0g、cuso4·
5h2o 1.0g、cocl2·
6h2o 1.0g，蒸馏水1000ml，ph＝7.2。
37.4、acinetobacter junii(琼氏不动杆菌)mwy001菌株在序批式活性污泥法生物反
应器(sbr)中的小试效果验证
38.实施例1：各取8l好氧池水样加氯化铵1.8g,初始氨氮100mg/l左右，对照组4l，实验组4l+200ml菌液，室温0～15℃，考察氨态氮变化趋势，结果如图4所示。实验组优于对照组。
39.实施例2：取8l好氧池水样，加硫酸铵16g，初始氨氮400mg/l左右，对照组4l，实验组4l+400ml菌液，室温0～15℃，考察氨态氮变化趋势，结果如图5所示。通过连续五天的连续运行，添加硝化菌菌剂的实验组要好于对照组。
40.5、acinetobacter junii(琼氏不动杆菌)mwy001菌株在a/o一体化生物反应器(s
‑
ibr)中的工程应用效果验证
41.50m3a/o中试装置验证控制条件：系统进水q＝1.0～1.5m3/h，t＝15.3～15.7℃，好氧池do＝3.89～4.4mg/l、缺氧池do<0.5mg/l，好氧池ph＝7.3～7.4，缺氧池ph＝7.6～7.9，mlss＝5100mg/l。
42.(1)a/o一体化生物反应器(s
‑
ibr)连续2天冲击实验：人为连续额外投加氯化铵3天，进水氨氮增至400～450mg/l，出水氨氮、总氮分别迅速地由原来的0.4mg/l、38mg/l迅速上升到80mg/l、120mg/l以上，停止投加氯化铵9天后，经人工干预，该系统缓慢恢复正常，系统出水总氮30～60mg/l左右，氨氮0.2，硝态氮30～60mg/l，连续运行变化趋势如图6所示。
43.(2)a/o一体化生物反应器(s
‑
ibr)连续10天冲击实验：人为连续额外投加氯化铵10天，进水氨氮增至400～450mg/l，同时以好氧池容积0.1％的比例投加该菌株种源，停止投加氯化铵2天后，未经人工干预，该系统即可恢复正常，且系统出水总氮10mg/l以下、氨氮0.06mg/l以下、硝态氮6mg/l左右，连续运行变化趋势如图7所示。
44.以上对比实验结果充分说明了该菌株中试试验取得了良好的预期效果，具有产业化推广应用的社会和经济价值。
45.上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡如本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。