用于现场恒温可视化和荧光检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的引物组、试剂盒及方法

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种用于现场快速恒温可视化和荧光检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的引物组、试剂盒及方法。

背景技术：

黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumbergreenmottlemosaicvirus,cgmmv)属于芜菁花叶病毒科，烟草花叶病毒属。病毒粒子为直杆状，长度为300nm，直径为18nm。cgmmv的基因组为正义单链rna，全长约6.4kb，至少有四个开放阅读框，编码4个蛋白质，分别对应186kb、129kb、29kb和17.3kb蛋白质。其中29kb蛋白质为移动蛋白；17.3kb蛋白质为外壳蛋白；186kb和129kb蛋白质为病毒复制和转录所必须的酶。cgmmv是世界上许多国家和地区葫芦科作物的重要检疫性有害生物，严重威胁着西瓜、甜瓜、黄瓜等作物的生产。受cgmmv感染的植物往往表现为叶片斑驳、果实变形和植株发育迟缓，产量显著下降。cgmmv的主要传播途径是机械传播，另外也可以通过植物的花粉及种子传播。1935年，英国ainsworth首次报道了cgmmv在黄瓜上的危害，此后该病毒传到加拿大、波兰、西班牙、印度、巴基斯坦、日本、韩国、缅甸以及我国等20多个国家和地区。在我国，2004年首次在广西观赏南瓜上发现该病毒。目前，我国广东、湖南、江苏、海南、辽宁等地均发现疫情。农业部已将cgmmv确定为我国检疫性有害生物。

由于cgmmv可感染葫芦科作物并造成重大危害损失，因此极早发现、及时阻断感染源，对于葫芦科作物的健康培育极其重要。目前该病害的主要检测技术有病害形态生物学鉴定、电镜观察、血清学及分子生物学等。病害形态生物学检测可以确定病毒的侵染能力但是所需时间较长，工作量较大，容易出现假阳性，并且不适用于寄主范围不明确的病毒，必须结合其他的检测方法才能确定。电子显微镜检测方法结果直观、准确，可以快速鉴定病毒到属的水平，但是电镜检测所需的设备昂贵，并且需要具有较高的操作技术，并不适用于大量样品的病毒检测及鉴定。血清学检测方法较多，其中，酶联免疫吸附法(elisa)在cgmmv检测方面应用广泛，具有快速、简便、载体易于标准化等优点，并且易于在实验室中建立，但是在样本病毒含量较低的情况下，elisa检测的灵敏度较低，可能会存在假阴性的情况。近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，cgmmv检测已逐渐从传统的生物学检测手段向基于核酸扩增的分子检测技术发展，其特异性强、灵敏度高、检测速度快等优点，已成为快速检测cgmmv的重要手段。目前国内外报道的cgmmv分子检测方法主要有基于核酸变温扩增的分子检测技术包括常规rt-pcr、免疫捕捉rt-pcr以及实时荧光定量rt-pcr等；基于核酸恒温扩增的分子检测技术包括rpa、rt-lamp等。商明清等2008～2011年对39份疑似样本进行das-elisa和rt-pcr检测，其中有3份样本elisa与rt-pcr结果不一致，表明elisa对于低浓度cgmmv检测易出现假阴性结果。chen等建立了rt-qpcr检测方法该病毒感染的甜瓜幼苗，该方法相比较而言，检测时间长。zeng等建立了rpa技术检测cgmmv的方法，但是，rpa技术存在着稳定性较差及试剂成本较高的普适性问题。li等建立了rt-lamp方法检测西瓜种子样本，但该方法仍需昂贵的荧光pcr仪检测荧光信号以确定检测结果，仍然不适用于现场检测。因此建立一种简便、快捷、仪器设备要求低的适合于现场恒温可视化的快速检测方法对于cgmmv现场快速检测具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，提供用于现场恒温可视化和荧光检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的引物组、试剂盒及方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种用于现场可视化快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒恒温扩增的引物组，包括seqidno.1所示的外引物cgmmv-of、seqidno.2所示的外引物cgmmv-ob、seqidno.3所示的内引物cgmmv-if、seqidno.4所示的内引物cgmmv-ib、seqidno.5所示的环引物cgmmv-lf和seqidno.6所示的环引物cgmmv-lb。所述引物组可灵敏、特异性的有效用于现场可视化快速检测植物叶片、种子、植株、苗木、土壤、田间废弃物以及植物产品(如瓜果)等样品中的黄瓜绿斑驳花叶病毒。

第二方面，本发明提供了一种用于现场可视化快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒扩增的试剂盒，包括所述的用于现场可视化快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒恒温扩增的引物组。所述试剂盒的检测灵敏度优于荧光定量rt-pcr，检测时间相比荧光定量rt-pcr缩短一半，可在35分钟内完成，操作简便、快捷，既可以使用廉价的恒温荧光检测仪，又可以使用荧光定量pcr仪，可适用于现场检测，具有很好的市场竞争力，有良好的产业化前景。

进一步的，所述试剂盒还包括2×rna恒温扩增反应缓冲液、钙黄绿素、bstdna聚合酶、amv逆转录酶。

更进一步的，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含如seqidno.33所示序列的阳性质粒体外转录rna，所述阴性对照为去核酸的超纯水。

第三方面，本发明提供了一种检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法，包括如下步骤：

s1、提取待测病毒的总rna；

s2、对所述总rna进行恒温扩增；其中，在反应体系中，采用所述的用于现场恒温可视化检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的引物组进行扩增；

s3、结果判定：

使用水浴锅或者普通的金属浴，在紫外下观察扩增产物的颜色变化，若为绿色荧光，则判断为阳性；

若为黄色无荧光，则判断为阴性。

本发明提供的检测方法可以现场可视化快速检测在植物种子、种苗、植株、叶片等植物及其制品中的黄瓜绿斑驳花叶病毒，操作简单，核酸扩增在63℃恒温条件下即可进行；快速高效，不需要预先的双链dna热变性，避免了温度循环而造成的时间损失，特别是添加环引物后在20-30min即可检测到扩增产物，且产物可以扩增到10⁹倍，准确、灵敏度高、特异性强，成本较低，对实验操作人员和仪器设备要求不高，适合规模性推广和应用。

进一步的，s2的反应体系包括以下终浓度的反应混合物：0.75～1.25×rna恒温扩增反应缓冲液、0.03～0.05×钙黄绿素、0.28～0.36u/μlbstdna聚合酶、0.03～0.05u/μlamv逆转录酶、1.5～1.7μm内引物cgmmv-if、1.5～1.7μm内引物cgmmv-ib、0.1～0.3μm外引物cgmmv-of、0.1～0.3μm外引物cgmmv-ob、0.7～0.9μm环引物cgmmv-lf、0.7～0.9μm环引物cgmmv-lb。

更进一步的，s2的反应总体积为20～50μl。

更进一步的，s2中，所述恒温可视化检测的反应程序为：程序恒温63℃反应30分钟，95℃分钟终止反应或者冰浴终止反应；使用荧光pcr仪或者lamp实时浊度仪，63℃，30秒；63℃，15秒，63℃，45秒，45个循环，在每一循环的63℃，45秒结束时收集fam荧光信号。

更进一步的，s2中，同时设置以如seqidno.33所示序列的质粒阳性对照，以去核酸的超纯水为空白对照进行检测。

进一步的，s3中，若荧光在绿色、黄色之间，重复s1-s2，然后进行结果判定：

使用荧光pcr仪或者lamp实时浊度仪，观察荧光扩增曲线，若有“s”型荧光信号扩增曲线，ct值<35，则判断为阳性；

若无“s”型荧光信号扩增曲线，无ct值或ct值>45则判断为阴性；

若ct值在35-45之间，重复实验，若ct值<45，荧光信号扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的引物组可特异、灵敏、快速地扩增检测黄瓜绿斑驳花叶病毒，检测方法操作方法简单、检测快速准确、特异性好、灵敏度高、仪器设备要求低，适用于现场快速检测并且能够通过紫外下肉眼观察确定检测结果，也可用于荧光检测。

附图说明

图1为黄瓜绿斑驳花叶病毒保守序列种内blast比对结果；

图2为黄瓜绿斑驳花叶病毒保守序列种外blast比对结果；

图3为采用黄瓜绿斑驳花叶病毒第一组引物组进行恒温扩增观察荧光扩增曲线获得的结果；

图4为采用黄瓜绿斑驳花叶病毒第二组引物组进行恒温扩增观察荧光扩增曲线获得的结果；

图5为采用黄瓜绿斑驳花叶病毒第三组引物组进行恒温扩增观察荧光扩增曲线获得的结果；

图6为采用黄瓜绿斑驳花叶病毒第四组引物组进行恒温扩增观察荧光扩增曲线获得的结果

图7为采用黄瓜绿斑驳花叶病毒第五组引物组进行恒温扩增观察荧光扩增曲线获得的结果；

图8为采用黄瓜绿斑驳花叶病毒第六组引物组进行恒温扩增观察荧光扩增曲线获得的结果；

图9为采用黄瓜绿斑驳花叶病毒最佳引物组对20份10pg/μl阳性对照进行重复性恒温扩增观察荧光扩增曲线获得的结果；

图10为采用黄瓜绿斑驳花叶病毒最佳引物组对20份1pg/μl阳性对照进行重复性恒温扩增观察荧光扩增曲线获得的结果；

图11为采用黄瓜绿斑驳花叶病毒最佳引物组对20份阴性对照进行重复性恒温扩增的结果；

图12为采用黄瓜绿斑驳花叶病毒最佳引物组进行恒温扩增观察荧光扩增曲线的特异性验证结果图；

图13为采用黄瓜绿斑驳花叶病毒最佳引物组进行恒温扩增紫外下可视化观察扩增产物颜色变化的特异性验证结果图；

图14为观察荧光扩增曲线检测黄瓜绿斑驳花叶病毒灵敏度结果图，扩增曲线从左往右依次浓度(每个浓度三个平行样)为1ng/μl(编号1)、100pg/μl(编号2)、10pg/μl(编号3)、1pg/μl(编号4)、100fg/μl(编号5)、10fg/μl(编号6)、1fg/μl(编号7)，0.1fg/μl和阴性对照无扩增曲线；

图15为紫外下可视化观察扩增产物颜色变化检测黄瓜绿斑驳花叶病毒灵敏度结果图，绿色荧光从左往右依次浓度为1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl，0.1fg/μl和阴性对照无绿色荧光；

图16为2份阳性样品中检测黄瓜绿斑驳花叶病毒阳性的荧光扩增曲线结果图；

图17为2份阳性样品中检测黄瓜绿斑驳花叶病毒阳性的紫外下可视化观察扩增产物颜色变化结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、黄瓜绿斑驳花叶病毒恒温可视化检测的引物组设计及筛选

1.引物组设计

根据genbank上公布的黄瓜绿斑驳花叶病毒分离株dy13全基因组序列(登录号：km873789.1)筛选高度保守区域，采用lampprimerexplorer5软件自行设计引物，筛选设计六组特异性引物组。一组有五～六个的引物，包括两个外引物(of和ob)、两个内引物(if和ib)和一个或两个环引物(lb和/或lf)，并使用primerblast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)进行评估。本发明设计的黄瓜绿斑驳花叶病毒六组引物组基因序列如表1所示。

表1六组现场恒温可视化检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的引物组

2.特异性扩增基因片段的序列比对

根据genbank下载黄瓜绿斑驳花叶病毒分离株dy13全基因组，经限制在100株黄瓜绿斑驳花叶病毒分离株种内保守性blast比对分析，黄瓜绿斑驳花叶病毒分离株dy13全基因组(登录号：km873789.1)种内保守性较好，序列同源性为100％。经限制在种外特异性blast比对分析，序列同源性仅为5％。所设计的引物组能够特异性鉴定出黄瓜绿斑驳花叶病毒。

图1为黄瓜绿斑驳花叶病毒保守序列种内blast比对结果；

图2为黄瓜绿斑驳花叶病毒保守序列种外blast比对结果。

3.引物组筛选

3.1筛选试验方法

将表1中自行设计的六组特异性引物组，分别进行恒温荧光扩增反应，每组反应体系总体积为25μl，其中含有：2×rna恒温扩增反应缓冲液12.5μl，8u/μlbstdna聚合酶1.0μl，5u/μlamv酶0.2μl，1×钙黄绿素1.0μl，阳性质粒模板2μl，用于筛选的六组引物组(包括：40μmol/l内引物if/ib、5μmol/l外引物of/ob、20μmol/l环引物lf/lb)分别各为1μl，每组用depc处理水补足体积至25μl。采用荧光pcr仪的反应参数：63℃30秒；63℃15秒，63℃45秒，45个循环，在每一循环的63℃45秒结束时收集fam荧光信号。利用恒温荧光扩增反应探究摸索最佳引物组合，通过荧光扩增曲线观察结果。

3.2引物组筛选结果

对本发明设计的黄瓜绿斑驳花叶病毒六组引物组进行筛选优化，筛选试验结果表明，第一组引物组2个阳性对照在63℃反应47分钟时才出现扩增曲线，阴性对照无扩增曲线，检测结果如图3所示；第二组引物组2个阳性对照在63℃反应约26分钟时出现扩增曲线，阴性对照无扩增曲线，检测结果如图4所示；第三组引物组2个阳性对照在63℃反应约10分钟时出现扩增曲线，可是阴性对照在50min处出现翘尾，检测结果如图5所示；第四组引物组2个阳性对照在63℃反应约27分钟时出现扩增曲线，阴性对照无扩增曲线，检测结果如图6所示；第五组引物组2个阳性对照在63℃反应约16分钟时出现扩增曲线，阴性对照31分钟出现扩增曲线(假阳性结果)，检测结果如图7所示；第六组引物组2个阳性对照在63℃反应约7分钟时出现扩增曲线，阴性对照无扩增曲线，检测结果如图8所示。由此可见，表明本发明所设计的黄瓜绿斑驳花叶病毒恒温可视化扩增第六组引物组具有很好的特异性。在引物筛选试验中，第六套引物组的扩增效率最好，阴性对照无扩增，故选择扩增效果最佳的第六套引物组用于重复性实验。第六组引物组20个阳性对照(10pg/μl)在63℃反应约7分钟时全部出现扩增曲线，阴性对照无扩增曲线，检测结果如图9所示。第六组引物组20个阳性对照(1pg/μl)在63℃反应约9分钟时全部出现扩增曲线，阴性对照无扩增曲线，检测结果如图10所示。第六组引物组20个阴性对照(去核酸的超纯水)在63℃反应60分钟均未出现扩增曲线，阳性对照有扩增曲线，检测结果如图11所示。由此可见，表明本发明所设计的黄瓜绿斑驳花叶病毒恒温可视化扩增第六组引物组具有很好的重复性。因此，确定选用第六组引物组为最佳的可供特异性恒温可视化检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的引物组序列。本实施例最终确定的黄瓜绿斑驳花叶病毒检测引物组基因序列如表1第六组所示，其中阳性对照为实施例2中制备的阳性对照品，阴性对照为去核酸的超纯水。

实施例2引物组的特异性扩增验证

1.阳性对照品的制备

根据实施例1获得的黄瓜绿斑驳花叶病毒最佳第六组引物组特异性恒温可视化扩增基因序列，选取含黄瓜绿斑驳花叶病毒基因组序列如seqidno.33。黄瓜绿斑驳花叶病毒阳性对照品如seqidno.33经人工合成基因制备质粒，作为阳性对照(委托宝生物工程(大连)有限公司完成制备)，分装并于-20℃保存备用。

2.特异性验证病毒

本发明为验证所设计的恒温可视化检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的特异性，选取黄瓜绿斑驳花叶病毒感染阳性叶片样本、西葫芦黄色花叶病毒感染阳性叶片样本、黄瓜花叶病毒感染阳性叶片样本进行检测特异性验证。

3.恒温可视化检测

恒温可视化检测是指在恒温条件下(60～65℃左右)对目标基因进行高效扩增，因此可在水浴锅或者普通的金属浴内完成扩增反应，利用荧光目视检测试剂(钙黄绿素)为检测指示剂，在反应结束后可以在紫外下肉眼可视化观察扩增产物的颜色变化，也可以通过荧光pcr仪或者lamp实时浊度仪观察荧光扩增曲线。

3.1恒温可视化扩增反应体系

恒温可视化扩增反应体系总体积为25μl，其中含有：2×rna恒温扩增反应缓冲液(2.8mmol/ldntpmixture、40mmol/ltris-hcl、20mmol/lkcl、16mmol/lmgso4、20mmol/l(nh4)2so4、1.6mol/l甜菜碱)12.5μl，8u/μlbstdna聚合酶1.0μl，5u/μlamv酶0.2μl，1×钙黄绿素1.0μl，引物组1μl(包括：40μmol/l内引物cgmmv-if/ib、5μmol/l外引物cgmmv-of/ob、20μmol/l环引物cgmmv-lf/lb)、样品rna模板(1～100ng)2μl、depc处理水补足体积至25μl。

具体如表2所示，其中，dntpmixture购自takara公司，bstdna聚合酶和amv逆转录酶购自newenglandbiolabs公司，荧光目视检测试剂(钙黄绿素)购自荣研生物科技(中国)有限公司。

表2恒温可视化扩增反应体系

3.2进行恒温可视化扩增反应参数(可根据不同的仪器设置相应的反应条件)

水浴锅或者普通的金属浴的反应参数：63℃，30分钟；95℃2min终止反应或者冰浴终止反应。

荧光pcr仪或者lamp实时浊度仪的反应参数：63℃30秒；63℃15秒，63℃45秒，45个循环，在每一循环的63℃45秒结束时收集fam荧光信号。

3.3对照扩增反应

3.3.1在试样恒温可视化扩增反应的同时，设置阳性对照、空白对照。

各对照反应体系中，除模板外其余组分及反应条件与3.1相同，且阳性对照、空白对照体积也应达到试样rna模板体积要求。

3.3.2以如seqidno.33所示序列的阳性质粒作为恒温可视化扩增反应体系的阳性对照模板。

3.3.3以去核酸的超纯水作为恒温可视化扩增反应体系的空白对照模板。

4.结果判定(可根据不同的仪器进行相应的结果判定)

水浴锅或者普通的金属浴的结果判定：

在紫外下肉眼可视化观察扩增产物的颜色变化，若为绿色荧光，则判断为阳性；若为“黄色”无荧光，则判断为阴性；若荧光在绿色、黄色之间，重复实验。

荧光pcr仪或者lamp实时浊度仪的结果判定：

若有“s”型荧光信号扩增曲线，ct值<35，则判断为阳性；

若无“s”型荧光信号扩增曲线，无ct值或ct值>45则判断为阴性；

若ct值在35-45之间，重复实验，若ct值<45，荧光信号扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。

5.引物组的特异性扩增验证结果

利用本发明方法对黄瓜绿斑驳花叶病毒感染阳性叶片样本、西葫芦黄色花叶病毒感染阳性叶片样本、黄瓜花叶病毒感染阳性叶片样本进行特异性验证。荧光扩增曲线结果如图12所示，图12中只有黄瓜绿斑驳花叶病毒样本出现特异性荧光扩增曲线，而其他病毒样本未检测到荧光扩增曲线，说明所设计的引物组特异性强。紫外下可视化观察扩增产物颜色变化的结果如图13所示，图13中只有黄瓜绿斑驳花叶病毒样本可视化观察到绿色荧光，而其他病毒样本未观察绿色荧光，说明所设计的引物组特异性强。

实施例3恒温可视化检测灵敏度试验

1.灵敏度试验方法

1.1引物组、2×rna恒温扩增反应缓冲液及钙黄绿素染料浓度的优化

将筛选好的内引物从1.5μm至1.7μm以0.1μm为间距递增；外引物从0.1μm至0.3μm以0.1μm为间距递增；环引物从0.7μm至0.9μm以0.1μm为间距递增；2×rna恒温扩增反应缓冲液从0.75×至1.25×以0.25×为间距递增；1×钙黄绿素染料浓度从0.03×至0.05×以0.01×为间距递增。利用taguchi法探究摸索最佳引物浓度组合。

1.2bstdna聚合酶的筛选及优化

为确定bstdna聚合酶的最佳用量和比例，分别对不同用量的bstdna聚合酶(0.28u/μl、0.32u/μl、0.36u/μl)摸索最佳用量。

1.3amv酶的的筛选及优化

为确定amv聚合酶的最佳用量和比列，分别对不同用量的amv酶(0.03u/μl、0.04u/μl、0.05u/μl)，摸索最佳用量。

1.4梯度稀释灵敏度试验

将黄瓜绿斑驳花叶病毒体外转录rna质粒阳性对照样本以10倍差进行稀释，梯度浓度分别为1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl、0.1fg/μl，经实施例1的恒温可视化扩增反应体系进行检测，验证本发明实施例所设计的黄瓜绿斑驳花叶病毒扩增引物组所建立的恒温可视化检测方法的灵敏度。

2.灵敏度试验结果

2.1反应体系各物质浓度的优化的结果

通过taguchi方法进行试验设计，根据所获得的最佳浓度范围进一步进行优化，从多次重复试验中发现：内引物浓度为1.6μm，外引物浓度为0.2μm，环引物浓度为0.8μm，2×rna恒温扩增反应缓冲液为1×，钙黄绿素染料浓度为0.04×时荧光增幅相对较高，且引物用量最少，所以选择内引物最佳浓度为1.6μm、外引物最佳浓度为0.2μm、环引物引物最佳浓度为0.8μm、2×rna恒温扩增反应缓冲液最佳浓度为1×、钙黄绿素染料最佳浓度为0.04×。

2.2bstdna聚合酶的优化结果

分别对不同用量的bstdna聚合酶检测结果进行比较，确定bstdna聚合酶用量为0.32u/μl，即25μl反应体系用量为1μl。

2.3amv酶的优化结果

分别对不同用量的amv酶检测结果进行比较，确定amv酶的量为0.04u/μl，即25μl反应体系用量为0.2μl；

2.4反应体积优化试验结果和最终反应体系的确定

为确定恒温可视化扩增反应体积的差异，采用25μl体系与50μl体系进行恒温可视化扩增检测比较，显示两种体系检测结果一致，因此选定25μl恒温可视化扩增反应体系作为实际应用的反应体系。结合上面的优化结果，确定黄瓜绿斑驳花叶病毒恒温可视化检测方法的反应体系，见表4。

2.5梯度稀释灵敏度试验结果

按照1.4的方法进行梯度稀释灵敏度试验，浓度分别为1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl、0.1fg/μl的不同浓度质粒阳性对照样本和阴性对照样本。荧光扩增曲线结果如图14所示，经多次试验显示，黄瓜绿斑驳花叶病毒的1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl浓度阳性质粒三个平行样本均检出荧光扩增曲线，0.1fg/μl浓度和阴性对照无扩增曲线。紫外下可视化肉眼观察扩增产物的颜色变化结果如图15所示，经多次试验显示，黄瓜绿斑驳花叶病毒的1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl浓度阳性质粒样本均检出绿色荧光，0.1fg/μl浓度和阴性对照无绿色荧光。表明确定本发明所设计的黄瓜绿斑驳花叶病毒恒温可视化检测的引物组和反应体系的检测灵敏度为1fg/μl。

实施例4、一种现场恒温可视化检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的试剂盒及使用方法

1.该试剂盒的组成包括：

(1)恒温可视化反应液

表3恒温可视化反应液配方

(2)阳性对照：seqidno.33所示序列的质粒；

(3)阴性对照：去核酸的超纯水。

本试剂盒-20℃储存12个月不影响使用效果。

2.检测时所需要的器材

设备：恒温水浴锅或者普通的金属浴(也可以使用荧光pcr仪或者lamp实时浊度仪)；恒温可视化紫外检测仪或紫外灯；移液器(量程0.1-200μl)；乳胶或一次性手套若干。

3.试剂盒的应用方法

3.1样本要求

适用样本类型：植物叶片、种子、植株、苗木、土壤、田间废弃物以及植物产品(如瓜果)等样品中黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测。样本rna提取可以按照提取试剂盒操作进行，把样本rna用于检测实验或保存于-80℃。

3.2操作步骤

3.2.1恒温可视化扩增体系配制

将试剂盒置室温使恒温可视化反应液、阴性对照和阳性对照完全溶化，并混匀。取23μl恒温可视化反应液至每个反应管内，然后加2μl所提取的样品核酸，每个反应总体积为25μl。每次检测应设立阳性对照和阴性对照。在63℃恒温水浴锅上进行扩增检测。

3.2.2反应程序

63℃恒温水浴保持30分钟；95℃2分钟终止反应或者冰浴终止反应。

3.3依据实施例2的结果判定规则进行结果的判定。

每个反应需设置空白对照和阳性对照，反应体系及扩增条件同受测样品。

4.注意事项

上述试剂以及阳性对照品在-20℃条件下保存。

试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒，并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。

反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。

实施例6、现场可视化检测植物样品中黄瓜绿斑驳花叶病毒试剂盒的应用

1.病毒的收集

1.1样品采集及处理

1.1.1田间存活植物，采集植物叶片及种子等。

1.1.2病死植物样品，采集病死植物的叶片、植株等组织样品。

1.1.3采集与患病植物相关场所的土壤样品、田间废弃物、植物产品。

1.2样品处理

1.2.1植物组织样品及植物产品直接用，种子、叶片、植株、苗木等样品处理方法，取适当大小的组织块放入研钵中，倒入液氮研磨至粉末状放入离心管中-20℃保存，根据不同试剂盒说明书加入裂解液进行核酸提取。

1.2.2土壤样品处理方法，取适量的土壤加入裂解液充分混匀12000rpm离心2分钟取上清液为核酸提取液。

1.2.3田间废弃物样品处理方法，取适量田间废弃物加入裂解液充分混匀12000rpm离心2分钟取上清液为核酸提取液。

注：上述病毒收集方法都是报道的常用方法。

2.rna提取

采用rna提取试剂盒或自动核酸提取仪提取各类样本中的核酸。低温保存备用。

注：或采用其他商品化的提取试剂盒提取样品rna。这些方法都是报道的常用方法。

3.将该检测方法应用于叶片、种子、植株等46份样本的检测，按照上述方法进行样品处理和提取rna，进行恒温可视化扩增反应，检测其中是否含有黄瓜绿斑驳花叶病毒。46份样本均由本实验室采集或收集，同时采用《黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法》gb/t28071-2011国家标准进行验证。

4.用本发明的试剂盒对于获取的46份样本进行了检测。结果显示，从1份黄瓜绿斑驳花叶病毒能力验证阳性样本、2份黄瓜绿斑驳花叶病毒感染阳性叶片样本中检出阳性，从40份黄瓜植株叶片样本、3份黄瓜种子样本中检测结果均为阴性。

本发明对46份样本的检测中未发现假阳性和假阴性结果，结果见表4，进一步证实了方法的实用性。

如图16所示为2份阳性样本中检出黄瓜绿斑驳花叶病毒阳性的荧光扩增曲线结果；如图17所示为2份阳性样本中检出黄瓜绿斑驳花叶病毒阳性的紫外下可视化观察扩增产物颜色变化结果。

表4采集或收集的46份样本检验结果

综上所述，本发明的方法应用于田间现场植物中黄瓜绿斑驳花叶病毒检测将具有广阔的前景，广泛适用于对植物叶片、种子、植株等的检测。

需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。