一种降低体脂含量和体重的组合物及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物学领域，具体涉及通过调节肠道菌群降低体脂含量和体重的组合物及其应用。


背景技术：

2.随着人类文明发展和科技的进步，人们生活水平有了大幅度的提高，饥饿的困扰少了，但肥胖却逐步成为全世界范围内重要的公共卫生问题。2016年，英国著名医学杂志《柳叶刀》对全球1920万成年人历时40年的健康调查显示，在全球肥胖人口升至6.41亿的时候，另外还有2.13亿儿童和青少年和13亿成年人处于超重状态，虽然没有达到肥胖的状态，但是体重已经超标。中国已经超越美国成为全球肥胖人口最多的国家，中国肥胖的成年男性已达4320万，成年女性达4640万，中国中度肥胖的成年男性已达430万，成年女性达760万。《中国儿童肥胖报告》显示，1985-2014年，我国7岁以上学龄儿童超重率由2.1％增至12.2％，肥胖率则由0.5％增至7.3％，分别增长近5倍和14倍。
3.现代化的快节奏生活和高强度的工作方式，长时间的办公室工作，运动量减少，加上流行的高油脂，高蛋白，高热量，少膳食纤维的快餐饮食，导致越来越多的肥胖问题以及并发的代谢类疾病，如“四高”疾病(高血糖，高血脂，高血压，高尿酸)，以及心血管类(冠心病，心力衰竭，卒中/中风，静脉血栓)和心理类疾病(自卑，焦虑，抑郁等)，严重危害人类的健康。研究表明，肥胖或超重人群与正常或偏瘦人群相比，除体重和体脂含量不同外，其肠道菌群的组成是不同的，且动物实验研究证明肠道菌群的不同会造成小鼠胖瘦的差异。vanessa k ridaura等人将一瘦一胖的成年女性双胞胎的粪便菌群移植给无菌小鼠，结果显示移植了胖人的无菌小鼠的体重及脂肪质量增加，且表现出肥胖相关代谢表型(science.2013sep 6；341(6150)：1241214)。随着科学研究的深入，肠道菌的特性及功能得到了更深的认知，其对人体产生的健康效应证据也越来越充足，如促进肠道健康，降低体内炎症，降低血脂血糖等。通过恢复肠道菌群来达到防治肥胖的目的，成为一种新的治疗手段。
4.然而，当前市场上的减肥产品，多是从节食和减少能量吸收方面进行，具有明显的副作用。通过节食或者禁食来达成减肥目标的，一旦停止节食，会出现报复性的增重，甚至超过减肥前的体重。据临床数据统计，通过节食减肥成功的人群中，90％的人在3年内出现体重反弹。节食减肥还会带来微量元素摄入不足导致代谢紊乱，甚至出现减肌不减脂，引起更严重的疾病。通过减少能量吸收(如腹泻)来达成目标的，通常会导致肠道功能紊乱，严重影响身体健康，即使达到了减肥的目的，生病的身体也会带来更大的痛苦。节食减肥虽然强行减少了能量的摄入，但是其不能改善人的食欲，强烈的食欲是减肥后体重反弹的底层原因。人的胃肠道菌群是调节食欲的重要方面，肠道菌群通过“脑-肠轴”调节下丘脑控制的饥饿与饱腹感，从而产生食欲或减少食欲。肥胖并发代谢相关疾病的诱因是体内脂肪，尤其是内脏脂肪，理想的减肥目标应该是减少脂肪堆积和体脂率，而不是仅仅减少体重。
5.百奥尼公司的专利(cn 101541947)报道了一种加氏乳杆菌bnr17具有将食品中的
单糖合成不可消化的多糖并将合成的多糖释放出体外的作用机理起到减肥降脂的作用，大鼠研究结果虽然显示出抑制体重增加的效果，但是其效果较弱(实验组比对照组减少8％)。发明人分析原因，可能因为食物中的单糖在胃肠道中的吸收是很迅速的，补充的bnr17益生菌，可能并不能及时地将单糖转化为不可消化的多糖，因而效果有限。seung-pil jung等人的bnr17益生菌的临床研究文章(korean j fam med.2013；34:80-89)公开了，经过12周的测试，口服bnr17菌株的受试者体重与对照组相比，差异不显著(p》0.05)。akihiro ogawa等人报道了格氏乳杆菌sbt2055具有抑制脂肪酸吸收，促进脂肪经粪便排泄的作用，然而其未能在肥胖患者中观察到效果。
6.目前，市场上的多数益生菌的产品，仅为补充益生菌为目标的，没有深入研究益生菌株的功能与人体肠道健康状态的关系以及益生菌菌株间的协同作用，更少有明确的临床减肥效果报道。肠道菌群是一个复杂的生态系统，单纯的补充少量的益生菌，很难在已经失衡的肠道中定殖存活下来，导致效果不佳；即使补充益生菌的干预过程中有些效果，干预结束后很快又回到原先的失衡状态。此外，市场上还存在大量的假益生菌产品，仅把益生菌当做助消化或者增加风味的作用，如常温灭活酸奶，乳酸菌风味饮料等，这类产品中无活的益生菌，更不能调节肠道菌群。开发含有特定具有降低体脂含量的功能益生菌产品，帮助肥胖病人恢复健康状态，提升人民的生活质量，具有显著的社会意义，也具有巨大市场应用价值。


技术实现要素：

7.为克服现有技术中的问题，针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种格氏乳杆菌mhs-lga-12及包含该菌的组合物。本发明提供的组合物可以显著改善肠道不适，增强饱腹感，降低高脂食欲，从而达到降低体脂水平与体重的效果。本发明的组合物中，益生菌混合物与优选益生元的搭配，具有显著的协同增效作用，促进益生菌的生长，且经改善的肠道菌群，在停止干预后，仍然有较好的效果，防止体重和体脂反弹，亦有助于养成健康的生活方式。
8.本发明的另一目的在于提供格氏乳杆菌mhs-lga-12及包含该菌的组合物在制备降低体脂水平和/或控制体重的产品中的应用。
9.为实现上述目的，本发明的技术方案为：
10.第一方面，提供一株格氏乳杆菌株(lactobacillus plantarum)mhs-lga-12，其特征在于，所述格氏乳杆菌已于2020年11月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2020765。
11.第二方面，提供一种组合物，所述组合物包含益生菌组分和益生元组分，其中益生菌组分包含上述格氏乳杆菌株mhs-lga-12。
12.优选地，所述组合物含有格氏乳杆菌株mhs-lga-12的活菌数≥2.0*107cfu/g组合物。
13.优选地，所述益生菌组分还包括干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、动物双歧杆菌、长双歧杆菌中的至少一种。
14.优选地，所述组合物中的总活菌数≥1.0*108cfu/g组合物，其中，干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、动物双歧杆菌、长双歧杆菌中的单一益生菌的活菌数≥0.5*
107cfu/g组合物。
15.优选地，所述益生元组分包括但不限于低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、棉子糖、水苏糖中的至少一种。
16.第三方面，提供上述格氏乳杆菌mhs-lga-12或上述组合物在制备降低个体内脏脂肪、体脂比、腰围和/或体重的产品中的应用。
17.优选地，所述产品为食品、饲料或药品。
18.优选地，所述药品进一步包含药学上可接受的载体。
19.优选地，所述药品可以是口服剂型。
20.进一步优选地，所述口服剂型选自：溶液、悬浮液、乳剂、粉剂、颗粒剂、锭剂、丸剂、糖浆、口含锭、片剂、口嚼胶、浓浆以及胶囊剂。
21.优选地，所述食品包括普通食品，保健食品，或特殊医学用途配方食品。
22.优选地，所述食品进一步包含可食性材料，所述可食性材料选自水、流体乳品、牛奶、酸奶、酸乳、乳杆菌发酵饮料、奶粉、冰淇淋、奶酪、豆奶、果汁、运动饮料、甜点、果冻、糖果、中草药材、或膳食补充品。
23.优选地，所述食品为液体饮料、固体饮料、口服液、奶制品、片剂或胶囊。
24.第四方面，提供上述格氏乳杆菌mhs-lga-12或上述组合物在制备预防和/或治疗肥胖及其并发症的药物中的用途。
25.优选地，所述并发症是选自由高胆固醇血脂症、动脉粥样硬化、冠心病及脂肪肝所组成的群组。
26.本发明的有益效果：
27.本发明经过多轮的益生菌株功能的筛选和菌株组合优化，筛选出了可以显著提升肠道有益菌群数量的益生菌和益生菌组合物。经高脂饮食诱导的肥胖动物试验验证，本发明的益生菌组合物可减少摄食量，且干预结束后，小鼠的摄食量仍然比较低，表明该益生菌组合物具有调节食欲的作用；降低内脏脂肪量和体重的效果上，益生菌与益生元组合的干预效果优于单株益生菌或益生元的干预效果，表明本发明的益生菌与益生元之间具有协同增效的效果。受试人群服用后，较大比例的志愿者有明显的饱腹感，肠道紊乱及便秘状况明显改善，高油脂的食欲得到缓解，饮食量下降，体脂含量，腰围和体重下降。本专利发明的益生菌组合物，可以缓解当下社会中快节奏，高压力生活节奏，以及高热量，高蛋白，高油脂，少膳食纤维的快餐饮食下带来的肥胖问题，具有巨大的社会意义和经济价值。
28.生物保藏说明
29.格氏乳杆菌(lactobacillus gasseri)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏机构简称：cctcc，保藏日期为2020年11月20日，生物保藏编号为cctcc no：m 2020765，菌株命名：格氏乳杆菌mhs-lga-12。
具体实施方式
30.下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
31.除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已
知的常规方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
32.定义与说明：
33.本文所用的术语“治疗”及其类术语是指延缓、改善、减少或逆转目前正折磨着患者的该病症或该病症相关的任何病状的方法以及预防该病症或其任何正出现的症状的方法。
34.本文所用的术语“药学上可接受”是指物质或组合物必须与调配物的其他成分兼容，且对患者无害。
35.本文所用的术语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的组分或方法步骤。
36.本文所用的“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
37.本文所用的“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
38.如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在remington's pharmaceutical sciences(mack pub.co.，n.j.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇，等。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、ph缓冲物质等。
39.除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
40.实施例1：格氏乳杆菌mhs-lga-12冻干粉的制备
41.格氏乳杆菌mhs-lga-12为从健康志愿者(bmi＝20.1)的粪便样品中分离所得，经16srrna基因测序鉴定为乳杆菌属格氏乳杆菌种，16s rrna序列如seq id no.1所示。mhs-lga-12菌株已在2020年11月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2020765，微生物分类命名为格氏乳杆菌lactobacillus gasseri。
42.格氏乳杆菌mhs-lga-12冻干菌粉的制备方法如下：取一环活化后的格氏乳杆菌mhs-lga-12的斜面菌种，接种至mrs培养基中，在温度35～37℃，静置培养18～24h，得到一级种子液；将培养好的一级种子液按接种量3％～10％(v/v)再次转接入mrs培养基进行二次活化，活化时间18～24h后得二级种子液；将二级种子液分别按照接种量3％～5％(v/v)接入到发酵罐培养基(发酵罐培养基(g/l)：蔗糖50～80，酵母粉20～40，大豆蛋白胨8～20，mgso4.7h2o 1.5～2.0，mnso4.5h2o 0.08～0.12，吐温80 0.8～1.0，余量为水，ph7.0)中，培养温度均为35～37℃，搅拌转速均为50～75rpm，通入高纯度氮气维持适当罐压，发酵全程调节发酵液，相同ph值为5.5～6.0条件下培养8～12小时，得到最终发酵液，经13000rpm管式离心机低温(《15℃)离心收集菌体；按照菌体与保护剂溶液质量比1：(5～10)的比例添加保护剂溶液(表1)，混匀获得菌悬液，将所述菌悬液经冷冻干燥(表2)，分别得到格氏乳杆菌mhs-lga-12冻干菌粉。
43.表1：冻干保护剂溶液配方
44.成分比例(％)脱脂奶粉(g)13海藻糖(g)6.2谷氨酸钠(g)1.0甘油(g)0.6vc(g)0.6无菌水(g)78.6
45.表2：冻干程序
[0046][0047][0048]
实施例2.减少体脂的固体饮料
[0049]
本实施例提供了一种能够降低体脂水平与体重的益生菌固体饮料，各辅料的组成如表3所示，精确称量原料后，进行梯度混匀，最终分装为10g/袋。经检测(参考gb4789.35-2016方法描述)，该固体饮料的益生菌活菌数为1.8-8.5
×
108cfu/g。
[0050]
表3降低体脂水平与体重的固体饮料
[0051][0052]
实施例3.减少体脂含量的益生菌饮料
[0053]
本实施例提供了一种能够维持肠道健康和降低体脂水平与体重的功能性益生菌饮料，是由下列重量的组分组成：每100g的益生菌饮料中含有脱脂乳粉6g，木糖醇8g和含mhs-lga-12格氏乳杆菌的复合菌粉0.82g(格氏乳杆菌mhs-lga-12冻干粉40％、干酪乳杆菌冻干粉30％、长双歧杆菌冻干粉10％、动物双歧杆菌冻干粉20％)。混合均匀后无菌分装，于4-8℃储存。经检测(参考gb4789.35-2016方法描述)，该固体饮料的益生菌活菌数为2.8
×
108cfu/g。
[0054]
实施例4.减少体脂含量的酸奶
[0055]
本实施例提供了一种能够降低体脂水平与体重的酸奶，具体操作流程如下：将鲜牛乳1000g，白砂糖40g，木糖醇50g混合均匀，加热至80-90℃维持10分钟，降温至40℃以下，加入含mhs-lga-12的复合益生菌发酵剂1g(格氏乳杆菌mhs-lga-12冻干粉60％，嗜热链球菌冻干粉40％)并搅拌均匀，密封后置于酸奶机在40℃发酵7-12h使酸奶凝固，然后置于4℃冰箱中储存，保质期5天。经检测(参考gb4789.35-2016方法描述)，酸奶块的活菌数为5.5
×
109cfu/g。
[0056]
实施例5：小鼠模型降低体脂含量的效果测试
[0057]
96只sd大鼠，5-6周龄，雌雄各半，购自湖北省疾控中心的试验动物中心。在正常饲料喂食一周适应后，随机分为8组，每组12只，对照组继续喂食普通饲料，其余组饲喂高脂饲
料(在常规鼠粮饲料中添加15％蔗糖、15％猪油、10％酪蛋白制备而成)2周建立肥胖模型。干预组(高脂饮食组+实施例2中不同配方)，将1-6产品组合物分别制成500mg/ml的混悬溶液，然后对小鼠进行灌胃，灌胃量为3.4ml/kg体重，实验干预四周，每天灌胃一次，持续4周。喂养试验期间，严格控制环境温度18-24℃，保证12h光照/黑夜，自由采食、饮水。每周记录一次体重，观察体重变化。分别在干预期结束后，称量体重后处死6只/组的大鼠并解剖，分离后收集腹腔中的脂肪组织，并在分析天平称重，分析体脂比。剩余的大鼠继续高脂饮食2周，称量体重，观察干预停止后的减肥效果，并采用方差分析对实验数据进行统计处理。结果如表4所示，其中1组为正常饮食组，2组为建模对照组，3组为产品1干预组，4组为产品2干预组，5组为产品3干预组，6组为产品4干预组，7组为产品5干预组，8组为产品6干预组。结果显示，mhs-lga-12益生菌(4组，产品2)具有较好的控制体重和脂肪的效果，显著优于建模对照组；且益生菌-益生元的组合物(6组，产品4)优于益生菌组合物(8组，产品5)和益生元组合物(3组，产品1)；说明组合物中的菌株间以及益生元具有较好的协同作用。此外，结果也显示，该益生菌组合物通过调整肠道菌群达到的控制体重的效果，在干预结束后，仍然具有调节食欲和控制体重的效果。
[0058]
表4.益生菌组合物对肥胖小鼠的减脂效果测试
[0059][0060]
注：*与建模组相比，p《0.05。
[0061]
实施例6：益生菌改善体脂的人体效果测试
[0062]
招募60名喜欢吃高脂食物且bmi》28的志愿者，年龄25-60岁，男女各半，进行实施例2中益生菌组合物产品1、4和6的人体效果测试。入组前，采用医用人体成分仪(accuniq品牌的ioi353)检测体脂率，男性体脂率为25-30％，女性体脂率35-40％，男性腰围85-95cm，女性腰围80-90cm。将志愿者按照体脂率、年龄随机分为3组，其中每组男女各半。将组合物1，4和6产品，分别分给3个测试组，并同时给3个组相同的生活建议指导资料。干预组早餐后和晚餐后服用，服用剂量10g/次，2次/天。干预期3个月，比较干预前后体脂率和空腹体重变化，评估益生菌组合物的干预效果。并在干预结束后3个月后进行电话随访，询问体重维持效果。经过3个月的干预测试，结果如表5所示，其中1组为健康指导+产品6干预组，2组为健康指导+产品4干预组，3组为健康指导+产品1干预组。结果显示，安慰剂组(1组，产品6)，没有表现出减低体脂和体重的效果，说明仅靠健康指导减肥的效果是不明显的；产品1干预组(3组)的体脂率和空腹体重都有一定降低，说明健康指导和益生元对体重管理是有一定的效果的，但是效果比较有限。相较之下，产品4组(2组)的效果最为显著，男性志愿者体脂率降低2.8％，空腹体重降低3.5kg，腰围减少了2.7cm；女性志愿者体脂率下降3.8％，空腹体重降低5.7kg，腰围减少了3.4cm。干预结束后的体重反弹随访结果显示，产品1干预组(3组)的体重反弹率显著高于产品4干预组(2组)，说明益生菌组合物通过改善肠道菌群进行减脂的效果具有持续性，也提示出肠道菌群改善后，有利于改变食欲和更健康的生活方式养成。
[0063]
表5.mhs-lga-12益生菌组合物的降低体脂效果测试
[0064][0065]
注：*与组合物6干预组相比，p《0.05。
[0066]
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡
在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。