一种GH18几丁质酶ChiA及其应用

一种gh18几丁质酶chia及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物及基因工程技术领域，具体涉及一种gh18几丁质酶chia及其应用。


背景技术：

2.几丁质酶属于糖基水解酶家族，可专一性催化水解几丁质的β
‑
1，4糖苷键生成几丁寡糖、壳聚糖和n
‑
乙酰氨基葡萄糖。几丁质的降解产物几丁寡糖、壳低聚糖和n
‑
乙酰氨基葡萄糖可以广泛应用于生物医药、食品、化妆品、纺织、农业等领域，具有普遍的生物活性和广阔的市场开发前景。利用几丁质酶法生产几丁寡糖、壳聚糖等条件温和，对环境污染小，是制备几丁寡糖等的发展方向。
3.目前，已报道产几丁质酶的微生物约有46个属近70种，主要有细菌、放线菌和真菌。但是已报道的菌株产几丁质酶量不高、生产效率低、耐受性差，距离工业化生产还有一定的距离。因此，发现新的几丁质酶基因，选育耐受性强、几丁质酶活性能高的几丁质酶产生菌株对几丁质酶产业化工作具有重要的指导意义。随着分子生物学技术的不断进步，利用基因工程的手段获得工程菌与野生菌株相比，往往具有表达水平高、产物专一性强、生产的效率高、繁殖周期短、易分离等特点，但构建基因工程菌的难点在于克隆表达载体的构建和异源蛋白的表达。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种gh18几丁质酶chia及其应用，该几丁质酶活性高，可用于几丁寡糖的催化生产。
5.为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
6.一种gh18几丁质酶chia，编码所述gh18几丁质酶的基因prokka01070的核苷酸序列如seq id no：1所示。
7.上述gh18几丁质酶chia来源于淀粉酶链霉菌(streptomyces diastaticus)cs1801，该菌株已在本技术人的在先申请cn109337843a中公开。
8.本发明还提供了一种重组载体，其包含编码gh18几丁质酶基因prokka01070和表达载体。所述表达载体为pet
‑
32a(+)。上述基因在表达载体pet
‑
32a(+)的多克隆位点间插入。
9.本发明还提供了一种包含上述的重组载体的基因工程菌。
10.进一步地，所述工程菌宿主细胞为e.coli bl21(de3)。
11.本发明还提供了上述的工程菌在酶法生产几丁寡糖中的应用。
12.优选的，所述gh18几丁质酶chia以胶体几丁质为底物生产几丁寡糖。
13.进一步的，本发明提供了一种具体的应用方式，包括：
14.(1)将包含gh18几丁质酶的基因工程菌接入lb培养基中进行种子培养；
15.(2)种子液转入发酵培养基中进行发酵培养，之后加入诱导剂诱导酶类的表达；
16.(3)对发酵液进行离心，获得沉淀，超声破碎获得酶液；
17.(4)将酶上清与中性胶体几丁质反应生产几丁寡糖。
18.进一步的，所述(4)中，在酶液中添加na
+
、li
+
、mg
2+
、ca
2+
中的一种或几种。
19.进一步的，所述胶体几丁质的配制方法为：将片状几丁质粉碎过筛，称取粉末几丁质缓缓加入浓盐酸，迅速搅拌，待其全部溶解后用玻璃棉过滤去杂质，溶液加入蒸馏水，离心得到沉淀，用蒸馏水洗至中性。
20.具体地，所述方法包括：将在37℃，200r条件下于lb培养基中培养8～12h的工程菌以2％的接种量接入发酵培养基。发酵od600至0.6
‑
0.8后添加iptg至终浓度0.4～1mmol/l，16℃，200r条件下培养24h，10000r,离心5min，按1g菌体湿重加入10mlpbs，200ul溶菌酶溶液，400ulpmsf，冰浴30min，40％，超6s，间隔4s，超声25min，离心获得酶液，10000r/min离心20min，取chia/pet
‑
32a(+)/bl21(de3)诱导后破壁酶上清200ul与800ul1％胶体几丁质于50℃，200r摇床下反应1小时后，加入2ml dns煮沸5min，在冰水中冷却至室温，加入2ml去离子水，10000r/min离心2min，在540nm处测定吸光度。
21.进一步的，所述的发酵培养基成分为：
22.胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl 10g/l，ph7.2
‑
7.4。
23.本发明用生物信息学分析的方法，从基因组测序的淀粉酶链霉菌cs1801(streptomyces diastaticus cs1801)中得到几丁质酶基因prokka01070，全长为1065bp，其编码的几丁质酶chia，包含354个氨基酸；该基因是一个新的几丁质酶基因，与其他几丁质酶基因相似度很低。通过克隆几丁质酶基因prokka01070并将其连接表达载体pet32a(+)后转化大肠杆菌bl21(de3)，培养并诱导表达后，得到了重组表达的几丁质酶chia。通过测定酶活，酶学性质分析，底物特异性分析，证明几丁质酶活性为132u/l。几丁质酶最适反应温度和ph为50℃和7.0，在25℃和ph5.0下稳定性最高，对胶体几丁质具有特异性，zn
2+
、sds对该酶均有强烈的抑制作用，而na
+
和li
+
在任何浓度下对该酶均有促进作用。该酶优点在于可以不受温度限制，在较低温条件下保持较高活性持久进行反应。几丁质酶chia可降解几丁质制备几丁寡糖，其转化所得的几丁寡糖含量为201.4μg/ml，该几丁质酶chia为酶法生产几丁寡糖提供新途径，具有重要应用前景。
附图说明
24.图1为几丁质酶pcr扩增的目的条带。
25.图2为ta克隆鉴定pcr扩增的目的条带。
26.图3为pet32a(+)
‑
chia表达载体菌液pcr鉴定。
27.图4为pet32a(+)
‑
chia表达载体双酶切鉴定。
28.图5为大肠杆菌sds
‑
page电泳图。
29.图6为几丁质酶活测定标准曲线。
30.图7为几丁质酶的最适反应ph和ph稳定性；a ph对重组几丁质酶活性的影响；b重组几丁质酶的ph稳定性。
31.图8为几丁质酶的最适反应温度和温度稳定性；a温度对重组几丁质酶活性的影响；b重组几丁质酶的温度稳定性。
具体实施方式
32.实施例1
33.本实施例说明淀粉酶链霉菌来源的gh18几丁质酶chia基因的pcr扩增方法。
34.取试管斜面保存的淀粉酶链霉菌cs1801进行平板活化，将单菌落接种到lb液体培养基中，30℃，培养2～3天。取培养液，于8000r离心2min，收集菌体，用细菌基因组提取试剂盒进行总的基因组提取，提取步骤参照上海生工的细菌基因组提取试剂盒的说明书。
35.几丁质酶基因扩增引物设计为：
36.f:5
’‑
gtgtacgaccggaactaccacg
‑3’
37.r:5
’‑
tcagtcgatcgcgtggatcag
‑3’
38.以提取的淀粉酶链霉菌基因组为模板，采用上述引物及上海生工的高gc含量pcr扩增试剂盒进行扩增，但不加taq酶。
39.具体的扩增程序如下，预变性95℃3min，加taq酶。95℃变性30s，退火温度55℃，退火时间为30s，延伸温度为72℃，延伸时间为1min，此过程进行29个循环，最后72℃延伸30min。取产物进行琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切胶回收后保存。凝胶回收试剂盒购自生工。
40.实施例2
41.本实施例说明带有酶切位点的几丁质酶chia基因的pcr扩增方法。
42.带有酶切位点的几丁质酶基因扩增引物设计为：
43.f:5
’‑
ccggaattcgtgtacgaccggaactaccacg
‑3’
44.r:5
’‑
ccgctcgagtcagtcgatcgcgtggatcag
‑3’
45.以实施例1中的胶回收产物为模板，采用上述引物及上海生工的高gc含量pcr扩增试剂盒进行扩增。
46.具体的扩增程序如下，预变性95℃3min。95℃变性30s，退火温度55℃，退火时间为30s，延伸温度为72℃，延伸时间为1min，此过程共进行30个循环，最后72℃延伸30min。取产物进行琼脂糖凝胶电泳，目的条带如图1，将目的条带切胶回收后送生工测序得到序列seq id no：1，其编码的几丁质酶chia氨基酸序列如seq id no：2所示，共包含354个氨基酸。
47.实施例3
48.本实施例说明几丁质酶chia的重组克隆载体的构建方法。
49.将实施例2中的胶回收产物与t4载体连接，转化至top10后，挑阳性克隆子验证，提取质粒后送生工测序验证。
50.实施例4
51.本实施例说明几丁质酶chia的重组表达载体的构建方法。
52.将实施例3中的质粒用xhoi和ecori进行双酶切并回收目的条带，同时用xhoi和ecori对pet32a(+)载体双酶切，回收载体中较大的片段，将回收的目的基因片段与载体片段进行连接，导入宿主细胞大肠杆菌top10，抗性筛选后，挑取阳性克隆子测序验证。
53.实施例5
54.本实施例说明几丁质酶chia基因工程菌的构建方法。
55.提取实施例4中的测序正确的阳性克隆子的质粒，直接转化导入宿主细胞大肠杆菌bl21(de3)中，几丁质酶基因工程菌构建成功，在其发酵过程需加入iptg等诱导剂诱导其
高效表达几丁质酶蛋白。通过sds
‑
page验证融合蛋白表达成功。sds
‑
page电泳图如图5所示，泳道1为未经诱导的e.coli pet32a
‑
chia，泳道2为经过iptg诱导12h的重组大肠杆菌e.coli pet32a
‑
chia全菌体，泳道3、4为经过iptg诱导24h的重组大肠杆菌e.coli pet32a
‑
chia试剂盒提取蛋白，泳道5、6为经过iptg诱导24h的重组大肠杆菌e.coli pet32a
‑
chia超声破碎上清。与1泳道相比，2、3、4、5、6泳道在分子量为38k da处有明显条带，除去质粒上融合表达的蛋白，与预测目标蛋白大小相一致，表明几丁质酶在重组菌中成功表达。
56.实施例6
57.重组几丁质酶的表征
58.1、重组酶的最适反应ph和ph稳定性
59.重组酶的最适反应ph测定：将重组酶在50℃条件下，于不同ph(ph 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)的底物中测酶活，以确定其最适ph。
60.重组酶ph稳定性测定：将重组酶在不同ph值(ph 3.0、5.0、7.0、9.0、11.0)的缓冲液中分别保温0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h后，取酶液于最适温度和ph下分别测定其酶活力。
61.结果显示重组几丁质酶最适反应ph为7.0，在ph5.0最稳定，实验结果如图7所示。
62.重组酶最适反应温度和热稳定性的测定
63.重组酶最适反应温度的测定：将纯化后的重组酶在最适ph底物中，于不同温度(20℃、25℃、30℃、37℃、42℃、50℃、60℃、70℃)条件下反应测定酶活力，以确定其最适反应温度。
64.重组酶热稳定性测定：将重组酶在不同温度(25℃、37℃、42℃、50℃、60℃、70℃)下保温0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h后，在最适ph和温度条件下分别测定其酶活力。
65.结果显示重组几丁质酶最适反应温度为50℃，在25℃仍可以保持80％以上的酶活。实验结果如图8所示。
66.配制浓度为1.0％(w/v)胶体几丁质、细粉几丁质、虾壳粉、蟹壳粉、壳聚糖、羧甲基纤维素钠(cmc
‑
na)，在最适反应条件下测定重组酶活力。以底物为胶体几丁质的酶活设为100％，计算其他底物的相对酶活力。结果显示，几丁质酶对胶体几丁质具有底物特异性。
67.实验结果如表1所示。
68.表1 chia的底物特异性测定
[0069][0070]
2、将1m m，5m m和10m m的含有如下金属离子的盐溶液和金属离子螯合剂：mgcl2，fecl3，zncl2，cacl2，kcl，nacl、c2h3o2li、edta、巯基乙醇、sds分别加入重组酶中，以终浓度为1％的中性胶体几丁质为底物，在最适反应条件下测定重组酶活力。
[0071]
结果显示，zn
2+
、sds在三种浓度下，对该酶均有强烈的抑制作用，而na
+
和li
+
在任何浓度下对该酶均有促进作用，mg
2+
和ca
2+
在1mmol/l浓度下，对该重组酶有促进作用。实验结果如表2所示。
[0072]
表2不同离子和化学试剂对重组酶chia酶活力的影响
[0073][0074]
实施例7
[0075]
本实施例说明几丁质酶基因工程菌在几丁寡糖生产中的应用。
[0076]
(1)将37℃，200r，lb培养基中培养8～12h的基因工程菌以2％的接种量接入发酵培养基。
[0077]
(2)发酵4h后添加iptg至终浓度0.4～1mmol/l，在16℃、200r条件下发酵培养24h。
[0078]
(3)10000r，5min，离心收集菌体，按1g菌体湿重加入10ml pbs，200ul溶菌酶溶液，400ul pmsf，冰浴30min，40％，超6s，间隔s，超声25min，离心获得酶液，10000r/min离心20min。
[0079]
(4)取chia/pet
‑
32a(+)/bl21(de3)诱导后破壁上清200ul与800ul1％中性几丁质胶体在50℃摇床，200r条件下反应30min。反应结束后加入2ml dns溶液，煮沸5min后于冰水混合物中冷却至室温。再加入2m去离子水，1000r/min离心2min，在540nm处测定吸光度。空白对照为煮沸30min的诱导破壁后chia/pet
‑
32a(+)/bl21(de3)上清。标准品为含量0.06、0.08、0.1、0.12、0.14、0.16、0.18mg的n
‑
乙酰氨基葡萄糖，标准曲线为:y＝3.3106x
‑
0.0774,r2＝0.9959(y为吸光度，x为n
‑
乙酰氨基葡萄糖含量)。几丁质酶酶活单位定义：50℃水浴保温条件下，每升溶液每分钟释放1μg乙酰氨基葡萄糖所需要的酶量定为一个酶活力单位。经测定酶活可达132u/l，与原始菌酶活(50.3u/l)相比活性大大提高，生产几丁寡糖的含量为201.4μg/ml。
[0080]
所述的发酵培养基成分为：
[0081]
胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl 10g/l，调ph为7.2
‑
7.4，蒸馏水定容至1l。
[0082]
胶体几丁质的制备方法：将片状几丁质粉碎过筛，称取10g粉末几丁质缓缓加入浓盐酸200ml，迅速搅拌，待其全部溶解后用玻璃棉过滤去杂质，溶液加入1000ml蒸馏水，离心得到沉淀，用蒸馏水洗至中性。