一种提高5
‑
羟基色氨酸产量的方法
技术领域
1.本发明涉及发酵法生产氨基酸领域，尤其是一种提高5
‑
羟基色氨酸产量的方法。
背景技术：
2.抑郁症是一种常见的精神障碍，威胁世界上数百万的人。中枢神经系统(cns)中神经递质血清素不足被认为是抑郁症的重要生理因素。
[0003]5‑
羟基色氨酸(5
‑
htp)在人类和动物体内是血清素的直接生物合成前体。已经显示出它在治疗抑郁症中是临床有效的，伴随相对少的副作用。5
‑
羟基色氨酸(5
‑
htp)是一种不参与蛋白合成的天然氨基酸，由色氨酸苯环上的5’位氢原子被羟基取代而生成，化学名为5
‑
羟基
‑3‑
吲哚基
‑
α
‑
氨基丙酸。在哺乳动物体内，5
‑
htp是神经递质血清素(serotonin)与胺类激素褪黑素(melatonin)的前体，对睡眠、痛觉、体温、食欲与行为等生理功能具有调节作用，己被成功用于抑郁症、失眠和偏头痛等疾病的治疗。
[0004]
由于5
‑
htp具有很高的药用保健和市场价值，近年来对5
‑
htp的生产研究发展迅速。目前生产5
‑
htp的方法主要有天然产物提取法、化学合成法和微生物发酵法等工艺技术，其中从非洲植物加纳的种子中提取5
‑
htp法如陈义等(cn111978238a)通过榨油，提取，粗过滤，精过滤，真空浓缩，萃取除杂，固液分离，精制，水洗除溶剂，干燥，粉碎等工序得到5
‑
htp。然而该方法产量低、易受季节影响、原料不足、地域限制成为限制大规模生产的主要瓶颈。化学合成法如胡文辉等(cn102351775b)利用l
‑
色氨酸甲酯/乙酯化得到l
‑
色氨酸甲酯/乙酯盐酸盐，在碱性条件下脱盐酸得到l
‑
色氨酸甲酯/乙酯，经乙酰化成n
‑
乙酰
‑
l
‑
色氨酸甲酯/乙酯，在三乙基硅烷
‑
三氟乙酸还原体系下还原吲哚环，在钨酸钠
‑
30％双氧水体系下氧化吲哚环1位氮，最后在酸性条件下，脱乙酰保护基得到5
‑
羟基色氨酸。但是总体来说化学方法合成反应体系较为复杂，步骤繁琐，因此微生物法合成以其成本低，操作简单，绿色环保，反应温和，可大量生产成为潜力巨大的5
‑
htp生产方式。然而目前微生物法仍存在催化的酶，其酶活不稳定，需外源添加昂贵的辅因子，成本高，催化效率低等问题。
技术实现要素：
[0005]
本发明所要解决的技术问题在于提供一种提高5
‑
羟基色氨酸产量的方法。
[0006]
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
[0007]
一种提高5
‑
羟基色氨酸产量的方法，在发酵中期产酸阶段减少通风量，降低溶氧，流加柠檬酸，保证bh4合成过程还原力充足，在底糖消耗尽后降低补糖速率，减少色氨酸累积。
[0008]
优选的，上述提高5
‑
羟基色氨酸产量的方法，具体步骤如下：
[0009]
(1)活化培养：从
‑
80℃冰箱中取出5
‑
羟基色氨酸生产菌e.coli htp10保菌管，传两代斜面，活化培养，采用的斜面培养基包括：葡萄糖1
‑
3g/l，蛋白胨5
‑
10g/l，牛肉膏5
‑
10g/l，酵母浸出粉2
‑
5g/l，氯化钠2
‑
5g/l，琼脂粉15
‑
30g/l；
[0010]
(2)种子培养：将活化菌株全部接种到种子罐，得到种子液，采用的种子培养基为：
葡萄糖20
‑
40g/l，酵母浸出粉2
‑
5g/l，硫酸铵1
‑
5g/l，磷酸二氢钾1
‑
5g/l，无水硫酸镁0.5
‑
2g/l，七水硫酸亚铁10
‑
30mg/l，一水硫酸锰10
‑
30mg/l，v
h 0.1
‑
0.5mg/l，v
b1 0.5
‑
1mg/l，微量元素混合液1
‑
2ml，消泡剂1g/l，并用氨水将培养基调节并维持ph到6.7～7.0；
[0011]
(3)发酵培养：接种12
‑
16％的种子液到发酵罐，连续培养，中间补料，得到发酵液，采用的发酵培养基为：葡萄糖20
‑
40g/l，酵母浸出粉2
‑
5g/l，硫酸铵1
‑
5g/l，磷酸二氢钾1
‑
5g/l，无水硫酸镁0.5
‑
2g/l，七水硫酸亚铁30
‑
60mg/l，一水硫酸锰20
‑
40mg/l，v
h 0.1
‑
0.5mg/l，v
b1 0.5
‑
1mg/l，微量元素混合液1
‑
2ml,用氨水将发酵罐培养调节并维持ph到6.7
‑
7.0之间；其中，在发酵6h后通过减少通风量，梯度降低溶氧0
‑
50％；在发酵8h后，流加0.4
‑
1％柠檬酸水溶液；在底糖耗尽后，将补糖速率降低1g/l
·
h。
[0012]
优选的，上述提高5
‑
羟基色氨酸产量的方法，所述微量元素混合液组分含量为钼酸铵0.28mg/l，硼酸5mg/l，cocl2·
6h2o 1.4mg/l，mnso4·
h2o 0.5mg/l，cuso4·
7h2o 0.5mg/l，znso4·
7h2o 0.6mg/l，上述成分称量固体后溶解于1l水中，在4℃保存。
[0013]
优选的，上述提高5
‑
羟基色氨酸产量的方法，所述降低溶氧策略进行梯度试验，在发酵时间为6h
‑
32h时，将溶氧区间分别调控为30
‑
50％，20
‑
30％，10
‑
20％，0
‑
10％；转速800rpm。
[0014]
优选的，上述提高5
‑
羟基色氨酸产量的方法，中间补料为0.4
‑
1％柠檬酸水溶液，流加策略为发酵罐配制培养基2.7l，从发酵8h开始流加300ml0.4
‑
1％柠檬酸水溶液，流加到发酵结束。
[0015]
优选的，上述提高5
‑
羟基色氨酸产量的方法，在上述溶氧梯度实验的基础上，从菌体对数生长期开始(6
‑
8h)，流加糖速率5
‑
6g/l
·
h；8
‑
10h，7
‑
8g/l
·
h；10
‑
12h，9
‑
10g/l
·
h；12
‑
18h，11
‑
12g/l
·
h；18
‑
24h，10
‑
11g/l
·
h；24
‑
32，9
‑
10g/l
·
h。
[0016]
优选的，上述提高5
‑
羟基色氨酸产量的方法，在上述流加糖策略基础上将补糖速率减1g/l
·
h。
[0017]
优选的，上述提高5
‑
羟基色氨酸产量的方法，所述发酵罐基础培养条件：接种量600ml，发酵体积3l,培养温度32℃，ph 6.8
‑
7.0，转速与溶氧联动，发酵时间32h。
[0018]
有益效果：
[0019]
上述提高5
‑
羟基色氨酸产量的方法，分为溶氧亚适量调控，柠檬酸流加，降低补糖速率三个部分，确定最佳溶氧亚适量后对柠檬酸最佳质量分数进行梯度试验，最后降低补糖速率以降低色氨酸积累量；通过对羟化酶辅酶四氢蝶呤(bh4)的氧化保护以及通过代谢平衡调节增强羟化酶催化过程还原力(流加柠檬酸策略)，降低补糖量来减少中间产物色氨酸累积。
[0020]
该方法通过控制溶氧到细胞亚适量，流加柠檬酸抑制emp途径，增强hmp途径，降低发酵过程葡萄糖流加速率来提高5
‑
htp产量，减少中间产物色氨酸，解决了四氢蝶呤(bh4)在生物发酵过程中被氧化消耗，合成过程还原力不足以及色氨酸过量累积影响5
‑
羟色氨酸(5
‑
htp)产量的问题。
具体实施方式
[0021]
实施例1
[0022]
一种提高5
‑
羟基色氨酸产量的方法，具体步骤如下：
[0023]
(1)活化培养：从
‑
80℃冰箱中取出5
‑
羟基色氨酸生产菌e.coli htp10(由e.coli w3110(atcc 27325)经人工改造获得，购自天津科技大学)保菌管，传两代斜面，活化培养，采用的斜面培养基包括：蛋白胨10g/l，牛肉膏10g/l，酵母粉5g/l，nacl 2.5g/l，琼脂粉25g/l，ph＝6.8～7.0；
[0024]
(2)种子培养：将活化菌株全部接种到种子罐，得到种子液，采用的种子培养基为：葡萄糖20g/l，酵母浸出粉3g/l，硫酸铵3g/l，磷酸二氢钾4g/l，无水硫酸镁1.5g/l，七水硫酸亚铁20mg/l，一水硫酸锰20mg/l，v
h 0.4mg/l，v
b1 0.5mg/l，微量元素混合液2ml，消泡剂1g/l，并用氨水将培养基调节并维持ph到6.7～7.0；
[0025]
(3)发酵培养：接种15％的种子液到发酵罐，连续培养，溶氧40％，转速800rpm，不流加柠檬酸，3l体系。发酵培养基为：葡萄糖25g/l，酵母浸出粉3g/l，硫酸铵3g/l，磷酸二氢钾4g/l，无水硫酸镁2g/l，七水硫酸亚铁40mg/l，一水硫酸锰30mg/l，v
h 0.2mg/l，v
b1 0.5mg/l，微量元素混合液2ml。在菌体对数生长期(6
‑
8h)，流加糖速率5
‑
6g/l
·
h；8
‑
10h，7
‑
8g/l
·
h；10
‑
12h，9
‑
10g/l
·
h；12
‑
18h，11
‑
12g/l
·
h；18
‑
24h，10
‑
11g/l
·
h；24
‑
32，9
‑
10g/l
·
h。
[0026]
上述e.coli htp10由e.coli w3110(atcc 27325)经人工改造获得的具体方法为：由野生型大肠杆菌经下述方法改造得到的：敲除tnaa基因以阻止色氨酸及5
‑
羟基色氨酸的分解代谢；在其基因组的laciz位点上整合了由木糖启动子p
xylf
控制的t7rnap基因，在失活laci蛋白的同时使细胞可以利用木糖诱导产生rna聚合酶t7rnap；用解除反馈抑制的突变体trpe
fbr
基因替换大肠杆菌原有的trpe基因，并用p
trc
启动子引导色氨酸操纵子的表达，以强化分支酸途径；将解除反馈抑制的突变体arog
fbr
基因sera
fbr
基因串联整合至大肠杆菌基因组的yjiv位点，并用p
trc
启动子引导表达，以强化莽草酸途径和丝氨酸合成途径；敲除tyrr基因及trpr基因，以实现负转录调控蛋白tyrr和trpr的缺失；在其基因组mbha位点整合了由t7启动子引导表达的编码人源2型色氨酸羟基化酶短截突变体的tph150基因，以构建胞内色氨酸羟基化途径；将来源于枯草芽孢杆菌的mtra基因和来源于人类的ptps基因、spr基因、pcd基因和dhpr基因，串联整合至大肠杆菌基因组yghx位点处，以引入辅酶四氢蝶呤的合成途径与再生途径，其中mtra基因、ptps基因、spr基因由同一个p
trc
启动子引导表达，pcd基因、dhpr基因由同一个p
trc
启动子引导表达；其中，
[0027]
所述野生型大肠杆菌为e.coli w3110，保藏号atcc 27325；
[0028]
所述木糖启动子p
xylf
具有序列表seq id no.seq id no.1所示核苷酸序列；
[0029]
所述rna聚合酶t7rnap具有序列表seq id no.2所示核苷酸序列；
[0030]
所述trpe
fbr
基因具有序列表seq id no.3所示核苷酸序列；
[0031]
所述p
trc
启动子，具有序列表seq id no.4所示核苷酸序列；
[0032]
所述arog
fbr
基因具有序列表seq id no.5所示核苷酸序列；
[0033]
所述sera
fbr
基因具有序列表seq id no.6所示核苷酸序列；
[0034]
所述强启动子pt7启动子具有序列表seq id no.7所示核苷酸序列；
[0035]
所述编码人源2型色氨酸羟基化酶短截突变体的tph150基因具有序列表seq id no.8所示核苷酸序列；
[0036]
所述mtra基因来源于枯草芽孢杆菌，负责编码gtp环化水解酶ⅰ，具有序列表seq id no.9所示核苷酸序列；
[0037]
所述人源ptps基因，负责编码6
‑
丙酮酰四氢生物蝶呤合成酶，具有序列表seq id no.10所示核苷酸序列；
[0038]
所述人源spr基因，负责编码鸟蝶呤还原酶，具有序列表seq id no.11所示核苷酸序列；
[0039]
所述人源pcd基因，负责编码蝶呤
‑
4α
‑
甲醇氨脱水酶，具有序列表seq id no.12所示核苷酸序列；
[0040]
所述人源dhpr基因，负责编码双氢蝶呤还原酶，具有序列表seq id no.13所示核苷酸序列。
[0041]
实施例2
[0042]
一种提高5
‑
羟基色氨酸产量的方法，参照实施例1，在其基础上将实施例1中发酵培养过程溶氧40％降至25％。
[0043]
实施例3
[0044]
一种提高5
‑
羟基色氨酸产量的方法，参照实施例2，在其基础上将实施例2中发酵培养过程溶氧25％降至16％。
[0045]
实施例4
[0046]
一种提高5
‑
羟基色氨酸产量的方法，参照实施例3，在其基础上将实施例3中发酵培养过程溶氧16％降至5％。
[0047]
表1溶氧与实施例产量对比
[0048][0049][0050]
由表1可知，实施例4产酸最好，溶氧为5％，因此后续实施例溶氧全部调控在5％左右。
[0051]
实施例5
[0052]
一种提高5
‑
羟基色氨酸产量的方法，具体步骤如下：
[0053]
(1)活化培养：从
‑
80℃冰箱中取出5
‑
羟基色氨酸生产菌e.coli htp10保菌管，传两代斜面，活化培养，采用的斜面培养基包括：蛋白胨10g/l，牛肉膏10g/l，酵母粉5g/l，nacl 2.5g/l，琼脂粉25g/l，ph＝6.8～7.0；
[0054]
(2)种子培养：将活化菌株全部接种到种子罐，得到种子液，采用的种子培养基为：种子培养：将活化菌株全部接种到种子罐，得到种子液，采用的种子培养基为：葡萄糖20g/l，酵母浸出粉3g/l，硫酸铵3g/l，磷酸二氢钾4g/l，无水硫酸镁1.5g/l，七水硫酸亚铁20mg/l，一水硫酸锰20mg/l，v
h 0.4mg/l，v
b1 0.5mg/l，微量元素混合液2ml，消泡剂1g/l，并用氨水将培养基调节并维持ph到6.7～7.0；
[0055]
(3)发酵培养：接种15％的种子液到发酵罐，连续培养，溶氧5％，转速800rpm，从发酵时间8h开始流加300ml柠檬酸，质量分数为0.4％，全程流加，底料与流加料体积固定为3l。发酵培养基为：葡萄糖25g/l，酵母浸出粉3g/l，硫酸铵3g/l，磷酸二氢钾4g/l，无水硫酸镁2g/l，七水硫酸亚铁40mg/l，一水硫酸锰30mg/l，v
h 0.2mg/l，v
b1 0.5mg/l，微量元素混合液2ml。发酵6
‑
8h，流加糖速率5
‑
6g/l
·
h；8
‑
10h，7
‑
8g/l
·
h；10
‑
12h，9
‑
10g/l
·
h；12
‑
18h，
11
‑
12g/l
·
h；18
‑
24h，10
‑
11g/l
·
h；24
‑
32h，9
‑
10g/l
·
h。
[0056]
实施例6
[0057]
一种提高5
‑
羟基色氨酸产量的方法，参照实施例5，在其基础上将实施例5中柠檬酸水溶液质量分数0.4％增至0.6％。
[0058]
实施例7
[0059]
一种提高5
‑
羟基色氨酸产量的方法，参照实施例6，在其基础上将实施例6中柠檬酸水溶液质量分数0.6％增至0.8％。
[0060]
实施例8
[0061]
一种提高5
‑
羟基色氨酸产量的方法，参照实施例7，在其基础上将实施例7中柠檬酸水溶液质量分数0.8％增至1.0％。
[0062]
表2柠檬酸质量分数与产量对比
[0063]
实施例号5678产量(g/l)1.391.511.431.37
[0064]
由表2可知在柠檬酸质量分数为0.6％时产量最高，其他梯度差别不大。
[0065]
实施例9
[0066]
一种提高5
‑
羟基色氨酸产量的方法，具体步骤如下：
[0067]
(1)活化培养：从
‑
80℃冰箱中取出5
‑
羟基色氨酸生产菌e.coli htp10保菌管，传两代斜面，活化培养，采用的斜面培养基包括：蛋白胨10g/l，牛肉膏10g/l，酵母粉5g/l，nacl 2.5g/l，琼脂粉25g/l，ph＝6.8～7.0；
[0068]
(2)种子培养：将活化菌株全部接种到种子罐，得到种子液，采用的种子培养基为：葡萄糖20g/l，酵母浸出粉3g/l，硫酸铵3g/l，磷酸二氢钾4g/l，无水硫酸镁1.5g/l，七水硫酸亚铁20mg/l，一水硫酸锰20mg/l，v
h 0.4mg/l，v
b1 0.5mg/l，微量元素混合液2ml，消泡剂1g/l，并用氨水将培养基调节并维持ph到6.7～7.0；
[0069]
(3)发酵培养：接种15％的种子液到发酵罐，连续培养，溶氧5％，转速800rpm，从发酵时间8h开始流加300ml柠檬酸，质量分数为0.6％，全程流加，底料与流加料体积固定为3l。发酵培养基为：葡萄糖25g/l，酵母浸出粉3g/l，硫酸铵3g/l，磷酸二氢钾4g/l，无水硫酸镁2g/l，七水硫酸亚铁40mg/l，一水硫酸锰30mg/l，v
h 0.2mg/l，v
b1 0.5mg/l，微量元素混合液2ml。发酵6
‑
8h后，流加糖速率5
‑
6g/l
·
h；8
‑
10h，7
‑
8g/l
·
h；10
‑
12h，9
‑
10g/l
·
h；12
‑
18h，11
‑
12g/l
·
h；18
‑
24h，10
‑
11g/l
·
h；24
‑
32，9
‑
10g/l
·
h。
[0070]
实施例10
[0071]
一种提高5
‑
羟基色氨酸产量的方法，参照实施例9，其区别仅在于流加糖速率不同，实施例10流加糖速率为：6
‑
8h，4
‑
5g/l
·
h；8
‑
10h，6
‑
7g/l
·
h；10
‑
12h，8
‑
9g/l
·
h；12
‑
18h，10
‑
11g/l
·
h；18
‑
24h，9
‑
10g/l
·
h；24
‑
32h，8
‑
9g/l
·
h。
[0072]
表3流加糖速率与色氨酸积累量和5
‑
羟色氨酸产量对比
[0073]
实施例号910色氨酸积累量(g/l)2.811.72产量(g/l)1.751.93
[0074]
由表3可知通过调控葡萄糖流加量可以减少色氨酸积累量，提高转化效率，节省物料。
[0075]
综上，通过调控溶氧，使细胞达到溶氧亚适量，能有效避免bh4氧化，能使bh4更高效地参与羟化酶合成，同时，利用代谢调控技术，流加适量柠檬酸，能保证色氨酸羟化酶催化过程中还原力充足，而且适当降低葡萄糖流加速率，能促进代谢通路平衡，提高糖酸转化率，进而提高产量。
[0076]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。