蟾皮甾烯总内酯提取物、甾烯内酯单体化合物及其在抗流感病毒中的用途的制作方法

本发明涉及甾烯总内酯提取物，尤其涉及蟾皮甾烯总内酯提取物以及分离的甾烯内酯单体化合物，本发明进一步涉及蟾皮甾烯总内酯提取物以及分离的甾烯内酯单体化合物在制备抗流感病毒药物中的用途，属于蟾皮甾烯总内酯提取物、单体化合物及其抗流感病毒用途领域。

背景技术：

蟾皮为蟾蜍科动物中华大蟾蜍bufobufogargarizanscantor或黑眶蟾蜍bufomelanostictusschneider的干燥皮。其性凉，味辛，有小毒，归肝、脾、肺经。具有清热解毒、利水消胀、止咳平喘、利水消胀的功效。用于痈疽，肿毒，瘰疬，肿瘤，疳积腹胀，久咳久喘，中国民间多用于治疗原发性肝癌、肺癌等，由单味蟾皮提取物，先后开发了华蟾素片、华蟾素胶囊、华蟾素颗粒、华蟾素口服液、华蟾素注射液等产品，用于中晚期肿瘤，慢性乙型肝炎等症，均有确切的临床疗效。

迄今为止，尚未见从蟾皮中提取的蟾皮甾烯总内酯提取物以及从中分离的单体化合物具有抗流感病毒活性的报道。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供从蟾皮中分离得到具有抗流感病毒活性的蟾皮甾烯总内酯提取物；

本发明的目的之二是提供从蟾皮中分离得到具有抗流感病毒活性的单体化合物；

本发明的目的之三将所述的蟾皮甾烯总内酯提取物以及所分离的单体化合物应用于制备抗流感病毒的药物。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种具有抗流感病毒活性的蟾蜍甾烯总内酯提取物，其主要的有效成分是华蟾酥毒基和蟾毒灵；作为一种优选的具体实施方案，按照质量百分比计，华蟾酥毒基的含量为33.3％，蟾毒灵的含量为24.6％。

作为参考，本发明提供了一种制备所述蟾蜍甾烯总内酯提取物，包括：(1)干蟾皮提取物浸膏硅胶拌样，硅胶柱干法装柱干法上样，环己烷-丙酮梯度洗脱，收集洗脱流份；(2)将洗脱流份再以硅胶拌样，硅胶柱干法装柱干法上样，环己烷-丙酮梯度洗脱，收集洗脱流份，回收溶剂并干燥，即得。

作为一种优选的具体实施方案，步骤(1)中采用环己烷-丙酮梯度洗脱时的梯度洗脱方式是10:1-8:1-5:1-2:1，收集5:1的洗脱流份；步骤(2)中采用环己烷-丙酮梯度洗脱时的梯度洗脱方式是10:1-8:1-5:1-2:1，收集5:1的洗脱流份。

本发明进一步提供了从蟾皮提取物中分离得到的具有抗流感病毒活性的单体化合物，这些单体化合物的结构式如下：

本发明中上述述化合物的酸加成的盐、溶剂化物或前药也包括在本发明之中。

本发明的蟾蜍甾烯总内酯提取物或从蟾皮中分离的单体化合物可以与酸生成其药学上可接受的盐。所述酸可以包括无机酸或有机酸，与下列酸形成的盐是特别优选的：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、磷酸、硝酸、甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、萘磺酸、三氟乙酸和天冬氨酸。

本发明的从蟾皮中分离的单体化合物还可以是溶剂化物，所述的溶剂可以是乙醇、水等，其中，可含有不同量的水，如一水合物、半水合物、一个半水合物、二水合物或者三水合物等。

本发明还包括上述从蟾皮中分离的单体化合物的前药。依据本发明，前药是上述化合物的衍生物，它们自身可能具有较弱的活性或没有活性，但是在给药后，在生理条件下(例如通过代谢、溶剂分解或另外的方式)被转化成相应的生物活性形式。

本发明的另外一个目的是提供一种抑制流感病毒的药物组合物，该药物组合物由预防或治疗上有效量的蟾蜍甾烯总内酯提取物或分离的单体化合物或其可药用的盐与药学上可接受的载体配合而成；将药学上可接受用量的蟾蜍甾烯总内酯提取物或分离的单体化合物与药学上可接受的载体或辅料配合后，按本领域常规的制剂方法将其制备成任意一种适宜的药物组合物。通常该组合物适合于口服给药和注射给药，也适合其他的给药方法。该组合物可以是片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、锭剂、栓剂或口服液等液体制剂形式。根据不同的给药方法，本发明药物组合物可以含有0.1％-99％重量，优选10-60％重量的蟾蜍甾烯总内酯提取物或分离的单体化合物。

其中，所述的辅料可以是抗氧络合剂、填充剂、骨架材料等；所述的药学上可接受的载体是木糖醇、甘露醇、乳糖、果糖、葡聚糖、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮、低分子右旋糖酐、氯化钠、葡萄糖酸钙或磷酸钙中的一种或几种，优选为甘露醇或乳糖。

本发明整体技术方案的详述

蟾蜍甾烯总内酯的提取和甾烯内酯单体化合物的分离

干蟾皮提取物浸膏硅胶拌样，硅胶柱干法装柱干法上样，环己烷-丙酮梯度洗脱，收集洗脱流份，再以硅胶拌样，硅胶柱干法装柱干法上样，环己烷-丙酮梯度洗脱，

收集洗脱流份，回收溶剂并干燥得到产品，hplc法检测总内脂含量；其余流份合并，硅胶拌样，硅胶柱干法装柱干法上样，正己烷-乙酸乙酯梯度洗脱，将流份粗划段，分为a～d、f5份。经¹h-nmr、¹³c-nmr、¹h-¹hcosy、hmbc等手段鉴定活性单体化合物结构，分别为非蟾毒甾烯内脂类化合物、蟾毒色胺类化合物、脂肪酸或甾醇类化合物、蟾毒甾烯内脂类化合物，鉴定出其中15个化合物。

蟾蜍甾烯总内酯提取物和甾烯总内酯单体化合物抗病毒试验的体外和体内药效筛选试验

1.蟾蜍甾烯总内酯提取物和甾烯总内酯单体化合物抗病毒试验的体外药效筛选试验

蟾蜍甾烯总内酯提取物和甾烯总内酯单体化合物在mdck细胞感染模型中对高致病性流感病毒h7n9的复制都有一定的抑制作用，其抑制上述病毒100tcid50感染的ec50在0.01-1.48μm之间，si指数在2.03-60.77μm之间，其中化合物2，化合物3，化合物5，化合物7，化合物12，化合物13，化合物16，化合物18，化合物19的抑制效果最佳，si指数均大于7。在上述浓度条件下，除化合物8未检测到有抑制病毒复制作用外，其余蟾蜍内酯对h7n9流感病毒引起的细胞病变均有一定的保护作用。对照药利巴韦林在50μg/ml、10μg/ml、5μg/ml三个浓度条件下均能完全抑制上述流感病毒的复制，保护细胞病变。阳性对照药奥司他韦在8μm、4μm、2μm三个浓度条件下均能完全抑制上述流感病毒的复制，保护细胞病变。

2.代表性蟾蜍甾烯内酯单体化合物对h7n9流感病毒致死小鼠的保护效力

本发明考察了代表性甾烯内酯单体化合物3、5和7对对h7n9流感病毒致死小鼠的保护效力，在整个观察期内除正常对照动物组无小鼠死亡外，其余各组均有动物死亡。h7n9感染组从攻毒后第7天开始出现死亡，在第10天出现死亡高峰，在整个观察期内死亡动物7只，死亡率100％。蟾蜍内酯化合物3和化合物7对h7n9禽流感病毒的致死性保护率均为14.3％，而化合物5对h7n9感染引起的死亡无明显保护作用，阳性药利巴韦林治疗给药对h7n9感染引起的死亡保护率为16.7％。此外，蟾蜍内酯化合物3和化合物7可延长小鼠的生存期，其平均生存期分别为11.1±1.9天和10.6±2.9天，其生命延长率分别为37.2％和27.9％，与模型组之间存在统计学差异(p<0.01或p<0.05)，而化合物5无明显延长小鼠生存期的作用；阳性药利巴韦林也可有效延长小鼠的生存期，其平均生存期和生命延长率分别为11.2±2.7天和37.6％。综合上述观察指标，蟾蜍内酯可显著延长小鼠的平均生存期，与模型组比存在统计学差异(p<0.01或p<0.05)，提示其可能在一定剂量条件下对h7n9感染小鼠的致死性有一定的保护作用。

综上，蟾蜍甾烯总内酯提取物和甾烯内酯单体化合物在体外mdck细胞模型中在上述安全剂量条件下大部分均具有一定的抗h7n9流感病毒复制的活性，且代表性内酯化合物3和化合物7在体内具有显著延长感染致死性流感病毒小鼠的生存期。

三种浓度的蟾蜍甾烯内酯提取物的急性毒性及心脏、神经毒性试验

使用斑马鱼模型对3蟾5浓度的蜍甾烯内酯提取物的急性毒性以及神经、心脏毒性进行评价，试验模型选用myl系斑马鱼受精后24小时(24hpf)胚胎。根据预试验分别对25.86％、36.45％、54.67％蟾蜍甾烯总内酯致畸浓度的探索。

1.急性毒性试验方法和结果

分别观察并记录给药斑马鱼胚胎48hpf、72hpf、96hpf的死亡情况，将3个样品存活率按照48hpf、72hpf、96hpf展示。由试验结果可以观察到，随着浓度升高，3个样品给药斑马鱼胚胎的存活率有明显的下降趋势。

2.心脏毒性试验方法和结果

通过分析心率数据可得，对比25.86％蟾蜍甾烯内酯提取物的心率数据得到在浓度为1.5μg/ml下，与空白对照组有显著性差异。对比36.45％蟾蜍甾烯内酯的心率数据得到在浓度为1.5μg/ml与1μg/ml下，与空白对照组有显著性差异。对比54.67％蟾蜍甾烯内酯的心率数据得到在浓度为1.5μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml下，均与空白对照组有显著性差异。

分析其他心脏功能指标分析(心脏收缩分数、心脏射血分数、相对心输出量)可得到3个样品与空白对照组相比未发现显著性差异，但随着浓度下降，均发现心脏收缩分数，心脏射血分数以及相对心输出量呈现升高的趋势。综上所述，25.86％样品的心脏毒性低于36.45％、54.67％两个样品。

3.神经毒性试验方法和结果

通过分析拍摄的痉挛反应视频，整理计算得出每个样品30s内不同浓度的胚胎痉挛次数如下表，空白对照组每30s的胚胎痉挛次数为(33.67±4.50)次/10颗/30s。将数据统计作做柱形图，分析柱形图数据，由图可看出每个样品除8μg/ml外，其余每个样品随着浓度下降，胚胎在30s内的痉挛次数呈现下降的趋势。分析认为8μg/ml这一浓度下，对胚胎的刺激性过高，在给药15min拍摄视频时，胚胎已处于接近死亡状态，因此胚胎的痉挛次数较少。

蟾皮中有效成分为蟾毒内酯类成分，本发明对蟾皮的乙醇提取物的化学成分进行了研究，利用反复硅胶柱色谱、半制备高效液相色谱、重结晶等手段从中华大蟾蜍皮的乙醇提取物中分离得到多个单体化合物并鉴定定了它们的结构。以磷酸奥司他韦、利巴韦林为阳性药，按照《中华人民共和国药品管理法》、《药品注册管理办法》的要求，参照按照现行有效的国家《中药、天然药物注册申报资料要求(试行)》对中药新药申报过程中药效学研究的相关要求以及《新药临床前研究指导原则汇编》指导原则与方法，使用斑马鱼模型对3个蟾蜍甾烯内酯的急性毒性以及神经、心脏毒性进行评价，采用h7n9亚型禽流感毒株体外感染mdck细胞为模型和icr小鼠为体内模型对蟾蜍内酯体内外抗流感病毒的药效作用进行评价研究，为该药的后续临床推广应用提供理论依据。

附图说明

图1华蟾酥毒基的核磁数据。

图2华蟾酥毒基的核磁数据。

图3蟾毒灵的核磁数据。

图4蟾毒灵的核磁数据。

图5蟾蜍内酯对小鼠感染流感病毒后体重增长的影响实验结果。

图6蟾蜍内酯对h7n9流感病毒的致死保护效应。

图748hpf25.86％、36.79％、54.67％3个样品不同浓度的存活率。

图872hpf25.86％、36.79％、54.67％3个样品不同浓度的存活率。

图996hpf25.86％、36.79％、54.67％3个样品不同浓度的存活率。

图10三个蟾蜍甾体内酯样品不同浓度心脏荧光成像图片；a.25.86％蟾蜍甾体内酯b.36.45％蟾蜍甾体内酯c.54.67％蟾蜍甾体内酯。

图1125.86％、36.45％、54.67％三个蟾蜍甾体内酯样品不同浓度心率；(与ctrl组相比****p<0.0001，**p<0.01，*p<0.05，^nsp>0.05无显著性差异)。

图1225.86％、36.45％、54.67％三个蟾蜍甾体内酯样品不同浓度10颗胚胎30s内的胚胎痉挛次数。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1蟾蜍甾烯总内酯的提取和单体化合物的分离

干蟾皮提取物浸膏约1200g，800g硅胶拌样，硅胶柱干法装柱干法上样，环己烷-丙酮梯度洗脱(10:1-8:1-5:1-2:1)，收集5:1的洗脱流份，再以12g硅胶拌样，硅胶柱干法装柱干法上样，环己烷-丙酮梯度洗脱(10:1-8:1-5:1-2:1)，收集5:1的洗脱流份，回收溶剂并干燥得到产品3.4g，hplc法检测总内脂含量57.9％(脂蟾毒配基：0，华蟾酥毒基：33.3％，蟾毒灵：24.6％)；华蟾酥毒基和蟾毒灵的核磁数据见图1-图4。

单体化合物分离纯化：将其余流份合并，硅胶拌样，硅胶柱干法装柱干法上样，正己烷-乙酸乙酯(10:1-0:1)梯度洗脱，将流份粗划段，分为a～d、f5份。

a段12.0g，经硅胶柱色谱分离，以正己烷-乙酸乙酯系统梯度洗脱(20：1-5:1)，得到6个流份a-1～6，a-1～5经反复硅胶柱色谱分离纯化，并经醋酐-浓硫酸鉴别反应，呈阴性反应，说明该样品为非内酯类成分，放弃继续纯化。a-6经反复硅胶柱色谱分离纯化，甲醇结晶得到单体cp-1。

b段3.6g，经硅胶柱色谱分离，以正己烷-乙酸乙酯系统梯度洗脱(20：1-5:1)，得到1个有效流份(醋酐-浓硫酸鉴别反应呈阳性)b-3，b-3经反复硅胶柱色谱分离纯化，正己烷-乙酸乙酯、二氯甲烷-甲醇等系统洗脱，甲醇结晶得到单体cp-2。

c段4.3g，经硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱(50：1-10:1)，得到4个流份c-1～4，其中c-3经反复硅胶柱色谱分离纯化，正己烷-丙酮、二氯甲烷-甲醇等系统洗脱，甲醇结晶得到单体cp-3和乙酸乙酯结晶得到单体cp-4；c-4经反复硅胶柱色谱分离纯化，正己烷-丙酮、二氯甲烷-甲醇等系统洗脱，乙酸乙酯结晶得到单体cp-5

d段29.3g，经硅胶柱色谱分离，以正己烷-乙酸乙酯系统梯度洗脱(20：1-0:1)，得到5个流份d-1～2、4～6；d-2经反复硅胶柱色谱分离纯化(二氯甲烷-甲醇)，中高压制备液相色谱分离纯化得到单体cp-6，d-4经反复硅胶柱色谱分离纯化(二氯甲烷-甲醇)，中高压制备液相色谱分离纯化，结晶与重结晶等手段得到cp-7、cp-8、cp-9、cp-10、cp-13、cp-16、cp-18、cp-19；d-5经反复硅胶柱色谱分离纯化(二氯甲烷-甲醇)，乙酸乙酯结晶和重结晶得到cp-23；d-6经反复硅胶柱色谱分离纯化(二氯甲烷-甲醇)，中高压制备液相色谱分离纯化得到cp-17、cp-21。

f段9.5g，经硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱(50：1-5:1)，得到4个流份f-1～4，f-1经反复硅胶柱色谱分离纯化，二氯甲烷-甲醇等系统洗脱，中高压制备液相色谱分离纯化得到cp-20；f-2经反复硅胶柱色谱分离纯化，二氯甲烷-甲醇等系统洗脱，中高压制备液相色谱分离纯化，乙酸乙酯结晶等手段得到cp-14、cp-15、cp-22；f-3经反复硅胶柱色谱分离纯化，二氯甲烷-甲醇(50:1～10～1)系统洗脱，乙酸乙酯结晶和重结晶得到cp-11；f-4经反复硅胶柱色谱分离纯化，二氯甲烷-甲醇(50:1～10～1)系统洗脱，乙酸乙酯结晶和重结晶得到cp-12。

经1h-nmr、13c-nmr、1h-1hcosy、hmbc等手段鉴定化合物结构，cp-1～5为非蟾毒甾烯内脂类化合物，cp-1为蟾毒色胺类化合物，cp-2～5均为脂肪酸或甾醇类化合物，cp-6～23为蟾毒甾烯内脂类化合物，鉴定出其中15个化合物，其中4个化合物为已知化合物的异构体。

以下是上述部分单体化合物的表征数据：

cp-6,白色粉末(氯仿-甲醇)，mp212～214℃，易溶于氯仿、甲醇，liebermann-burchard反应呈阳性。与脂蟾毒配基对照品共薄层，三种不同溶剂系统展开，显色均为单一的绿色斑点，rf值一致。hplc法化合物1供试品溶液主峰保留时间与对照品溶液主峰保留时间一致，故鉴定cp-6(化合物1)为脂蟾毒配基(resibufogenin)。

cp-7,白色粉末(氯仿-甲醇)，mp260～261℃，易溶于氯仿、甲醇，liebermann-burchard反应呈阳性。与华蟾毒精对照品共薄层，三种不同溶剂系统展开，显色均为单一的红棕色斑点，rf值一致。¹h-nmr(400mhz,cdcl3)谱中，存在δ7.91(1h,brs,h-22)7.16(1h,s,h-21)、6.21(1h,dd,j＝9.8,1.0hz,h-23)、5.46(1h,dd,j＝9.3,1.4hz,h-16)、4.15(1h,brs,h-3)、3.65(1h,d,j＝1.2hz,h-15)、2.79(1h,d,j＝9.3hz,h-17)、1.89(3h,s,h-26)、0.99(3h,s,h-19)、0.82(3h,s,h-18)质子信号。故鉴定cp-7(化合物2)为华蟾酥毒基(cinobufagin)。

cp-8,白色粉末(乙酸乙酯)，mp.239～240℃，易溶于氯仿、甲醇，liebermann-burchard反应呈阳性。与蟾毒灵对照品共薄层，三种不同溶剂系统展开，显色均为单一的蓝紫色斑点，rf值一致。¹h-nmr(400mhz,cdcl3)谱中，存在δ7.84(1h,dd,j＝9.8,2.6hz,h-22)、7.23(1h,dd,j＝2.6,1.1hz,h-21)、6.26(1h,dd,j＝9.8,1.0hz,h-23)、4.14(1h,t,j＝2.9hz,h-3)、0.95(3h,s,h-19)、0.71(3h,s,h-18)质子信号。鉴定cp-8(化合物3)为蟾毒灵(bufalin)。

cp-9,白色针晶(甲醇),mp233～236℃，易溶于氯仿、甲醇，liebermann-burchard反应呈阳性。¹h-nmr(400mhz,cdcl3)谱中，存在δ7.90(1h,brs,h-22)7.16(1h,s,h-21)、6.22(1h,dd,j＝9.8,1.0hz,h-23)、5.45(1h,dd,j＝9.3,1.5hz,h-16)、4.21(1h,t,j＝3.0hz,h-3)、3.63(1h,d,j＝0.8hz,h-15)、2.80(1h,d,j＝9.3hz,h-17)、1.89(3h,s,h-26)、0.99(3h,s,h-19)、0.82(3h,s,h-18)质子信号。13c-nmr谱中的信号归属见表1。鉴定cp-9(化合物4)为华蟾毒它灵(bufotalin)。

cp-10,白色粉末(甲醇)，mp233～236℃，易溶于氯仿、甲醇，liebermann-burchard反应呈阳性。¹h-nmr(400mhz,cdcl3)谱中，存在δ7.72(1h,dd,j＝9.7,2.4hz,h-22)、7.40(2h,d,j＝2.1hz,h-21)、6.28(1h,d,j＝9.7hz,h-23)、4.33(1h,dd,j＝11.1,2.3hz,h-11)、3.81(1h,d,j＝3.5hz,h-9)、1.19(3h,s,h-19)、0.92(3h,s,h-18)质子信号。13c-nmr谱中的信号归属见表1。鉴定cp-10(化合物5)为沙蟾毒精(arenobufagin)。

cp-11,白色粉末(乙酸乙酯)，mp210～212℃，易溶于氯仿、甲醇，liebermann-burchard反应呈阳性。¹h-nmr(400mhz,cdcl3)谱中，存在δ7.82(1h,dd,j＝9.7,2.6hz,h-22)、7.23(1h,dd,j＝2.6,1.1hz,h-21)、6.27(1h,dd,j＝9.8,1.1hz,h-23)、4.19(1h,m,h-3)、2.48(1h,dd,j＝9.7,6.4hz,h-17)、0.94(3h,s,h-19)、0.71(3h,s,h-18)。质子信号。鉴定cp-11(化合物6)为远华蟾毒精(telocinobufagin)。

cp-12,白色粉末(甲醇)，mp250～253℃，易溶于氯仿、甲醇，liebermann-burchard反应呈阳性。¹hnmr(400mhz,cdcl3)谱中，存在δ9.98(1h,s,h-19)、7.78(1h,dd,j＝9.7,2.6hz,h-22)、7.23(1h,d,j＝2.6,h-21)、6.27(1h,d,j＝9.8,h-23)、4.25(1h,s,h-16)、4.20(1h,s,h-3)、3.02(1h,s,h-15)、2.48(1h,dd,j＝9.8,6.5hz,h-17)、0.70(3h,s,h-18)。质子信号。13c-nmr谱中的信号归属见表1。鉴定cp-12(化合物7)为嚏根草苷元(hellebrigenin)。

cp-13,白色粉末(甲醇)，mp214～215℃，易溶于氯仿、甲醇，liebermann-burchard反应呈阳性。¹hnmr(400mhz,cdcl3)谱中，存在δ7.93(1h,dd,j＝9.8,2.6hz,h-22)、7.25(1h，d,j＝2.6hz,h-21)、6.25(1h,d,j＝9.8,h-23)、4.72(1h,m,h-16)、4.20(1h,s,h-3)、3.56(1h,s,h-15)、2.62(1h,d,j＝9.2hz,h-17)、0.98(3h,s,h-19)、0.82(3h,s,h-18)质子信号。¹³c-nmr谱中的信号归属见表1。鉴定cp-13(化合物8)为去乙酰华蟾毒它灵(desacetylbufotalin)。

cp-14,白色粉末(甲醇)，mp210～213℃，易溶于氯仿、甲醇，liebermann-burchard反应呈阳性。¹hnmr(400mhz,cdcl3)谱中，存在δ7.48(1h,dd,j＝9.7,2.7hz,h-22)、7.32(1h,d,j＝2.6hz,h-21)、6.24(1h,d,j＝9.7hz,h-23)、4.18(1h,t,j＝2.9hz,h-12)、4.11(1h,brs,h-3)、3.63(1h,d,j＝3.4hz,h-17)、2.47(1h,d,j＝12.2hz,h-9)、1.05(3h,s,h-19)、1.00(3h,s,h-18)质子信号。¹³c-nmr谱中的信号归属见表1。鉴定cp-14(化合物9)为假沙蟾毒精(ψ-bufarenogin)。

cp-15,白色粉末(甲醇)，mp212～215℃，易溶于氯仿、甲醇，liebermann-burchard反应呈阳性。¹hnmr(400mhz,cdcl3)谱中，存在δ7.90(1h,d,j＝9.9hz,h-22)、7.16(1h,brs,h-21)、6.13(1h,d,j＝9.8hz,h-23)、4.67(1h,d,j＝9.2hz,h-16)、4.06(1h,brs,h-3)、3.51(1h,s,h-15)、2.53(1h,d,j＝9.2hz,h-17)、0.91(3h,s,h-19)、0.73(3h,s,h-18)质子信号。鉴定cp-15(化合物10)为去乙酰华蟾毒精(desacetylcinobufagin)。

表1蟾皮中蟾蜍甾烯总内酯的活性单体化合物分离结果

试验例1蟾蜍甾烯总内酯提取物以及单体化合物的体外和体内抗流感病毒药效筛选试验

1试验方法

1.1病毒细胞毒力测定(tcid50)

将不同亚型流感病毒种毒尿囊液连续作10倍梯度浓度稀释，将不同稀释度的病毒接种于mdck细胞中，于37℃吸附1h后，后换用维持液继续培养，设正常细胞对照，每稀释度4个复孔。每天在倒置显微镜下观察细胞病变，记录病变程度和孔数，将细胞病变率达50％及以上的培养孔计为病变孔，然后通过血凝试验测试细胞上清中各稀释度子代病毒的释放情况，72小时后取上清，采用甲醛固定细胞板，采用结晶紫染色再次确定各孔的细胞病变情况，最后根据reed-muench法计算病毒的tcid50(mediantissuecultureinfectivedosage)。

1.2病毒小鼠半数致死量(ld50)的测定

80只小鼠随机分为8组，每组10只，将毒种按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释后，每只小鼠经麻醉后滴鼻感染不同稀释浓度的病毒，每个稀释度1组，设pbs代替病毒正常对照组。于感染后第2天开始统计死亡数，连续观察15天记录小鼠的发病死亡情况，按reed-muench法计算病毒对小鼠的半数致死量ld50。

1.3药物对细胞毒性的测定

供试药物临用时采用含2％血清的mem维持液稀释成终浓度再给药。将生长良好的mdck细胞经胰酶消化成单个细胞后，用生长液调整至2×105/ml，按0.1ml/孔加入96孔微量细胞培养板中，过夜后，加入不同稀释度的各种药物，每稀释度4个复孔，每孔0.2ml，同时设置正常细胞对照孔。37℃5％co2温箱培养，每日观察细胞病变，72小时后采用甲醛固定细胞，利用结晶紫染色法测定细胞病变，以不出现细胞病变(cpe)的药物最小稀释度为药物的最大无毒浓度(tc0)，按reed-muench法计算50％细胞毒性浓度(tc50)。

1.4体外抗流感病毒药效试验方法

将处于对数生长期状态良好的mdck细胞，加0.25％的胰蛋白酶消化液，消化脱落后吹匀，计数，接种于96孔细胞培养板中，置恒温co2培养箱中培养12h。分别设正常细胞对照组，病毒感染组，阳性药物对照组和受试药物组。弃去培养液，用pbs冲洗二次，除正常对照组外，其余每孔加入100tcid50感染量的流感病毒，然后加入含不同浓度的含药维持液。受试药物组从最低无毒性浓度开始设置，依次做2倍稀释，做8个浓度，每浓度4个复孔。然后将上述方案加药的细胞培养板35℃下继续培养72h，观察细胞病变，待病毒对照孔细胞病变达75％以上时，利用存留细胞结晶紫法染色分析，同时设细胞对照孔和病毒对照孔。用reed-muench法分别计算样品对细胞的半数有毒浓度(tc50)和对病毒的半数抑制浓度(ic50)和治疗指数(si)，si＝tc50/ic50。

1.5体内抗流感病毒药效试验方法

将体重14-15g雌性icr小鼠随机分为7组，每组10只，适应性喂养5d，按下列方法进行动物分组：正常动物对照组；病毒感染对照组；阳性药利巴韦林对照组；化合物3治疗给药组；化合物5治疗给药组；化合物7治疗给药组(总共6组)。小鼠适应性饲养5天后，攻毒当日除正常对照组用pbs滴鼻外，其余各组经麻醉后滴鼻感染10ld50的h7n9禽流感病毒。阳性药利巴韦林组于感染后2小时开始腹腔注射给药(75mg/kg)，每天给药一次，连续给药7d。试验期间每天观察动物发病情况，称重，记录死亡数，共观察15d，并计算死亡保护率和生命延长率，死亡保护率＝(病毒对照组死亡数-给药组死亡数)/病毒对照组死亡数×100，生命延长率＝(给药组平均存活天数-病毒对照组平均存活天数)/病毒对照组平均存活×100。

2、试验结果

2.1蟾蜍甾烯总内酯提取物以及单体化合物对mdck细胞的细胞毒性试验结果

蟾蜍甾烯总内酯提取物在较高剂量条件下对mdck细胞具有明显的细胞毒性，其tc50在0.02-24.1μm；阳性对照药奥司他韦对mdck细胞的tc50>40μg/ml；阳性对照药利巴韦林对mdck细胞的tc50为50μg/ml；各单体化合物样品的实验结果详见表2。

表2蟾蜍内酯体外抗h7n9流感病毒作用结果

注:(1)表中“–”表示样品在最大无毒剂量无抗病毒活性。

(2)tc50：药物半数有毒浓度；ic50：药物对病毒半数抑制浓度；si：选择指数，si＝tc50/ic50。

2.2蟾蜍甾烯总内酯提取物以及单体化合物对抑制h7n9流感毒株复制及细胞病变的保护效应

蟾蜍甾烯总内酯提取物以及单体化合物在mdck细胞感染模型中对高致病性流感病毒h7n9的复制都有一定的抑制作用，其抑制上述病毒100tcid50感染的ec50在0.01-1.48μm之间，si指数在2.03-60.77μm之间，其中化合物2，化合物3，化合物5，化合物7，化合物12，化合物13，化合物16，化合物18，化合物19的抑制效果最佳，si指数均大于7。在上述浓度条件下，除化合物8未检测到有抑制病毒复制作用外，其余蟾蜍内酯对h7n9流感病毒引起的细胞病变均有一定的保护作用。对照药利巴韦林在50μg/ml、10μg/ml、5μg/ml三个浓度条件下均能完全抑制上述流感病毒的复制，保护细胞病变。阳性对照药奥司他韦在8μm、4μm、2μm三个浓度条件下均能完全抑制上述流感病毒的复制，保护细胞病变。具体结果详见表3。

表3单体化合物体外抗h7n9流感病毒作用结果

注:(1)表中“–”表示样品在最大无毒剂量无抗病毒活性。

(2)tc50：药物半数有毒浓度；ic50：药物对病毒半数抑制浓度；si：选择指数，si＝tc50/ic50。

2.3代表性蟾蜍内酯对h7n9流感病毒感染后体重增长的影响

在感染流感病毒后各组小鼠体重增长受到影响，开始逐渐降低，但蟾蜍内酯化合物3给药组体重下降幅度明显轻于模型组，提示对流感病毒感染引起的体重下降有改善作用，而蟾蜍内酯化合物5和蟾蜍内酯化合物7给药后体重相对于模型组反而降得更快，这可能与药物在该剂量条件下的副作用有关(图5)。

2.4代表性蟾蜍内酯对h7n9流感病毒致死小鼠的保护效力

结果如表4和图6所示，在整个观察期内除正常对照动物组无小鼠死亡外，其余各组均有动物死亡。h7n9感染组从攻毒后第7天开始出现死亡，在第10天出现死亡高峰，在整个观察期内死亡动物7只，死亡率100％。蟾蜍内酯化合物3和化合物7对h7n9禽流感病毒的致死性保护率均为14.3％，而化合物5对h7n9感染引起的死亡无明显保护作用，阳性药利巴韦林治疗给药对h7n9感染引起的死亡保护率为16.7％。此外，蟾蜍内酯化合物3和化合物7可延长小鼠的生存期，其平均生存期分别为11.1±1.9天和10.6±2.9天，其生命延长率分别为37.2％和27.9％，与模型组之间存在统计学差异(p<0.01或p<0.05)，而化合物5无明显延长小鼠生存期的作用；阳性药利巴韦林也可有效延长小鼠的生存期，其平均生存期和生命延长率分别为11.2±2.7天和37.6％。综合上述观察指标，蟾蜍内酯可显著延长小鼠的平均生存期，与模型组比存在统计学差异(p<0.01或p<0.05)，提示其可能在一定剂量条件下对h7n9感染小鼠的致死性有一定的保护作用。

表4.蟾蜍内酯对h7n9流感病毒致死小鼠的保护效果

注：*p<0.05,**p<0.01vs病毒对照组.

综上所述，蟾蜍甾烯内酯提取物以及分离的单体化合物在体外mdck细胞模型中在上述安全剂量条件下大部分均具有一定的抗h7n9流感病毒复制的活性，且代表性内酯化合物3和化合物7在体内具有显著延长感染致死性流感病毒小鼠的生存期，提示此类样品可能具有潜在的抗流感病毒作用，值得进一步开发。

试验例2蟾蜍甾烯内酯提取物的急性毒性及心脏、神经毒性试验

使用斑马鱼模型对3种浓度的蟾蜍甾烯内酯提取物(25.86％、36.45％、54.67％)的急性毒性以及神经、心脏毒性进行评价，试验模型选用myl系斑马鱼受精后24小时(24hpf)胚胎。根据预试验分别对25.86％、36.45％、54.67％蟾蜍甾烯总内酯提取物的致畸浓度的探索。

一、试验分组及设计

1急性毒性试验分组设计

每个浓度设3次重复，每重复12个副孔，每孔1尾胚胎。根据预试验分别对25.86％、36.45％、54.67％蟾蜍甾烯总内酯提取物致畸浓度的探索，本试验共设20组即正常对照组，阳性药物对照组、25.86％组*6，36.45％组*6，36.45％组*6(表5)。

表5急性毒性试验剂量设计表

2.心脏毒性试验分组设计

每个浓度设3次重复，每重复3个副孔，每孔15尾胚胎。

根据预试验分别对25.86％、36.45％、54.67％蟾蜍甾烯总内酯致畸浓度的探索，本试验共设11组即正常对照组，阳性药物对照组、25.86％组*3，36.45％组*3，36.45％组*3(表6)。

表6心脏毒性试验剂量设计表

3.神经毒性试验分组设计

每个浓度设3次重复，每重复3个副孔，每孔10尾胚胎。

根据预试验分别对25.86％、36.45％、54.67％蟾蜍甾烯总内酯致畸浓度的探索，本试验共设19组即正常对照组，25.86％组*6，36.45％组*6，36.45％组*6(表7)。

表7神经毒性试验剂量设计表

二、试验方法及结果

1.急性毒性试验方法和结果

1)day0，称取25.86％蟾蜍甾体内酯2mg溶于1mldmso中，再将配制成的受试品溶液利用holtbuffer稀释浓度梯度，使成最终浓度8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1.5μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml。称取36.45％蟾蜍甾体内酯2mg溶于1mldmso中，再将配制成的受试品溶液利用holtbuffer稀释浓度梯度，使成最终浓度8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1.5μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml。称取54.67％蟾蜍甾体内酯2mg溶于1mldmso中，再将配制成的受试品溶液利用holtbuffer稀释浓度梯度，使成最终浓度8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1.5μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml。

2)day1，收集myl系斑马鱼24hpf胚胎，按每组36尾胚胎分组，分组给药。

3)day2-day4，分别观察48hpf、72hpf、96hpf胚胎死亡以及毒性表型情况

4)day4-day6，数据分析处理，计算lc50。

将25.86％、36.45％、54.67％3个样品按照浓度梯度稀释至8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1.5μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml。

分别观察并记录给药斑马鱼胚胎48hpf、72hpf、96hpf的死亡情况，将3个样品存活率按照48hpf、72hpf、96hpf展示如图7-图9。由图7-9可以观察到，随着浓度升高，3个样品给药斑马鱼胚胎的存活率有明显的下降趋势。

通过对25.86％、36.45％、54.67％蟾蜍甾体内酯给药小组的连续观察记录，计算出胚胎发育不同时间下的lc50。计算数据发现54.67％蟾蜍甾体内酯的样品在胚胎发育72hpf时的lc50无法计算(表8-10)。

表825.86％、36.45％54.67％蟾蜍甾体内酯48hpf斑马鱼胚胎lc50

表925.86％、36.45％54.67％蟾蜍甾体内酯72hpf斑马鱼胚胎lc50

表1025.86％、36.45％54.67％蟾蜍甾体内酯96hpf斑马鱼胚胎lc50

2.心脏毒性试验方法和结果

1)day0，称取25.86％蟾蜍甾体内酯2mg溶于1mldmso中，再将配制成的受试品溶液利用holtbuffer稀释浓度梯度，使成最终浓度1.5μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml。称取36.45％蟾蜍甾体内酯2mg溶于1mldmso中，再将配制成的受试品溶液利用holtbuffer稀释浓度梯度，使成最终浓度1.5μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml。称取54.67％蟾蜍甾体内酯2mg溶于1mldmso中，再将配制成的受试品溶液利用holtbuffer稀释浓度梯度，使成最终浓度1.5μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml。

2)day1，收集myl系斑马鱼24hpf胚胎，按每组45尾胚胎分组，分组给药。

3)day2，观察48hpf心肌功能情况，在正置荧光显微镜下成像拍照。

4)day3-day5，数据分析处理，整理成像图片，分析心肌细胞功能。

依据预试验浓度探索，将25.86％、36.45％、54.67％3个样品按照浓度梯度稀释至1.5μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml，按照步骤7.2进行操作。拍摄心脏荧光成像图片，3个样品不同浓度下的心脏荧光图片呈现如图10。

通过分析心率数据可得，对比25.86％蟾蜍甾体内酯的心率数据得到在浓度为1.5μg/ml下，与空白对照组有显著性差异。对比36.45％蟾蜍甾体内酯的心率数据得到在浓度为1.5μg/ml与1μg/ml下，与空白对照组有显著性差异。对比54.67％蟾蜍甾体内酯的心率数据得到在浓度为1.5μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml下，均与空白对照组有显著性差异(表11和图11)。

表1125.86％、36.45％、54.67％三个样品不同浓度下心率

分析其他心脏功能指标分析(心脏收缩分数、心脏射血分数、相对心输出量)可得到3个样品与空白对照组相比未发现显著性差异，但随着浓度下降，均发现心脏收缩分数，心脏射血分数以及相对心输出量呈现升高的趋势。综上所述，25.86％样品的心脏毒性低于36.45％、54.67％两个样品。

3.神经毒性试验方法和结果

1)day0，称取25.86％蟾蜍甾体内酯2mg溶于1mldmso中，再将配制成的受试品溶液利用holtbuffer稀释浓度梯度，使成最终浓度8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1.5μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml。称取36.45％蟾蜍甾体内酯2mg溶于1mldmso中，再将配制成的受试品溶液利用holtbuffer稀释浓度梯度，使成最终浓度8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1.5μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml。称取54.67％蟾蜍甾体内酯2mg溶于1mldmso中，再将配制成的受试品溶液利用holtbuffer稀释浓度梯度，使成最终浓度8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1.5μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml。

2)day1，收集ab系斑马鱼24hpf胚胎，按每组30尾胚胎分组，分组给药。

3)day1，给药后15min，观察胚胎情况，并录制显微成像下的应激反应，选取具有代表性的视频。

4)day2-day3，数据分析处理，统计胚胎应激反应情况。

通过分析拍摄的痉挛反应视频，整理计算得出每个样品30s内不同浓度的胚胎痉挛次数如下表，空白对照组每30s的胚胎痉挛次数为(33.67±4.50)次/10颗/30s。将数据统计作做柱形图(图12)，分析柱形图数据，由图12可看出每个样品除8μg/ml外，其余每个样品随着浓度下降，胚胎在30s内的痉挛次数呈现下降的趋势。分析认为8μg/ml这一浓度下，对胚胎的刺激性过高，在给药15min拍摄视频时，胚胎已处于接近死亡状态，因此胚胎的痉挛次数较少(表12-14)。

表1225.86％蟾蜍甾体内酯刺激性胚胎痉挛次数

表1336.45％蟾蜍甾体内酯刺激性胚胎痉挛次数

表1454.67％蟾蜍甾体内酯刺激性胚胎痉挛次数