一种应用于二代感染宏基因组检测的临床样本处理方法与流程

本发明涉及基因测序领域，特别是涉及一种应用于二代感染宏基因组检测的临床样本处理方法。
背景技术：
：过去20年里，全球每年约有1500万人死于传染病(福奇和莫伦斯)。世界卫生组织于2019年发布了全球卫生十大威胁，其中6个与传染病有关。新出现和再次出现的致命病原体包括经典病原体的传播以及耐多药病原体(如多药耐药肺炎克雷伯菌、淋病奈瑟菌、结核分枝杆菌等)，强调精确诊断和有效治疗传染病所面临的日益严峻的挑战。临床实验室中病原体的鉴定所依赖的传统培养诊断技术(如培养、核酸扩增试验、免疫测定、等)和相对较新的技术，如16srrna(16srrna)基因测序和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tofms),这些方法有明显的优点和局限性，在处理复杂感染时，它们往往暴露出一些弱点，如繁琐、耗时和诊断准确性有限，导致延误或漏诊。据报道，40％的肠道感染(thomas等，2015年)、约50％的血液感染(bsi)(fenollar和raoμlt,2007年)和50％以上的中枢神经系统(cns)感染(glaser等2006)的病原学仍然未知。这些未确诊的病例迫使医生开出经验性广谱抗生素治疗，这将大大增加出现耐多药细菌的风险，并有可能增加严重感染患者的死亡率。下一代测序(ngs)技术为诊断传染病打开了另一扇窗口。新一代宏基因组测序(mngs)已成为一种有前途的单一、通用病原体检测方法，用于传染病诊断。这种方法允许细菌、真菌、寄生虫和病毒的鉴定和基因组特征，而不需要事先从临床标本获得培养的结果。临床样本的ngs研究或临床实验室涉及许多步骤包括核酸提取、dna和/或rna浓缩、文库制备、pcr扩增、测序和生物信息分析。实验室使用的核酸提取方法类型是影响结果的主要因素之一，不同病原体核酸释放量可能不同。例如，分枝杆菌需要剧烈的细胞破碎以有效的溶解细胞壁以释放核酸，不同的标本类型需要不同的提取方法，有效的提取方法是实现一个样本真正无偏移测序的关键步骤。真菌的细胞壁由多种多糖、蛋白质和糖蛋白组成。多糖约占壁的80％，而蛋白质占20％，同时也有少量的脂质和蜡，这些物质的存在可以避免干燥。真菌细胞壁一般有三层：最外层由糖蛋白和葡聚糖或甘露聚糖组成，第二层是β-1,3葡聚糖，最内层由几丁质组成。细胞壁的结构在不同的类群之间是不同的：以上所列的组分比例会存在不同。他们的组成也因同一物种内的细胞状态而异(如孢子vs菌丝)。这种变异影响了不同物种中给定dna提取程序的提取效率。细菌采用革兰氏染色法可以区分为2大类，革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌。革兰氏阳性菌细胞壁厚，由肽聚糖网状分子形成一种透性障，因此细胞裂解步骤也尤为关键。细胞裂解可以通过化学处理(用洗涤剂，酸或碱性试剂)，酶降解细胞壁成分(用酶如蛋白酶k，裂解酶和几丁质酶)或使用机械/物理方法(如超声，珠打，高温等)来实现(alessandrafrauetal.2019)，任一种单个方法的使用都可能会存在一定的漏检风险。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明拟解决的核心技术问题是临床感染样本病原微生物核酸释放不足而导致的二代感染宏基因组检测漏检现象，为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：本发明首先提供一种应用于二代感染宏基因组检测的临床样本病原体的处理方法，包括如下步骤1)样品预处理步骤：取感染样本离心处理，保留部分上清及沉淀；2)样品溶菌破壁步骤：预处理后样本加入终浓度大于1mg/ml的溶菌酶温育；温育后样本加入lysingmatrie管，加gb裂解液裂解；mp破壁仪震荡破碎，低温离心。进一步的，所述步骤2)中预处理后样本加入终浓度大于1mg/ml的溶菌酶，35-37℃温育10-15min；更进一步的，所述步骤2)中温育后样本加入mplysingmatrie管中，gb裂解液裂解；mp破壁仪上fastprep-24tm5g上，5-6m/s震荡60-120s，1-2次；将mplysingmatrie管12,000-14,000g低温离心3-8min，储存备用；在一些具体实施方式中，所述步骤2)中温育后样本加入mplysingmatrie管中，加200μl的gb裂解液裂解；mp破壁仪上fastprep-24tm5g上6m/s震荡120s，1次；将mplysingmatrie管14,000g低温离心5min，储存备用；进一步的，所述步骤1)中的离心为12,000-14,000g离心3-5min；更进一步的，所述步骤1)中样品预处理步骤为：对于非粘稠类感染样本，取1-2ml样本，12,000-14,000g离心3-5min，吸去上清，并留部分上清及沉淀在离心管中备用；对于粘稠类感染样本，取100-200μl样本加入解稠剂或pbs，涡旋震荡，40-42℃、300-400rpm震荡孵育10-15min，然后12,000-14,000g离心3-5min，吸去上清，并留部分上清及沉淀在离心管中备用。在一些具体实施方式中，所述步骤1)中样品预处理步骤为：对于非粘稠类感染样本，取1-2ml样本，14,000g离心5min，吸去上清，并留部分上清及沉淀在离心管中备用；对于粘稠类感染样本，取200μl样本加入解稠剂或pbs，涡旋震荡，42℃、400rpm震荡孵育10min，然后14,000g离心5min，吸去上清，并留部分上清及沉淀在离心管中备用。进一步的，所述非粘稠类感染样本包括但不限于胸腹水、肺泡灌洗液、脑脊液、尿液、脓液、非粘稠类痰液样本等；所述粘稠类感染样本包括痰液样本。进一步的，上述lysingmatrie管为mpbiomedicalstmlysingmatrixe管。本发明还提供一种二代感染宏基因组建库方法，其特征在于，包括上述任一所述的临床样本病原体的处理方法，以及进一步包括核酸提取和文库构建步骤。本发明还提供一种应用于二代感染宏基因组检测的临床样本病原体处理的试剂盒，其特征在于，包括溶菌酶、lysingmatrixe管、gb裂解液和解稠剂。进一步的，所述试剂盒还包括核酸提取液等。本发明还提供lysingmatrixe管在二代感染宏基因组检测的临床样本病原体处理中的应用。优先的，上述所述lysingmatrixe为mpbiomedicalstmlysingmatrixe。本发明有益的技术效果：(1)本发明提供的临床样本细胞裂解方法，对样本的需求量低，对于脑脊液等不容易采集的样本利好。(2)本发明通过筛选优化确立的样本预处理方法流程少，大大压缩了处理时间，缩短了整个测序检测周期，不足传统方法周期的四分之一，加快报告出具，这在行业内具有显著意义，对临床重症感染患者而言尤为重要。(3)本发明提供的方法可处理多种临床样本类型，涵盖胸腹水、脑脊液、脓液、肺泡灌洗液、外周血，适用较为广泛。(4)本发明提供的临床样本细胞裂解方法，适用于二代测序宏基因组检测，可用于dna、rna病原微生物的检测使用。(5)本发明提供的方法对真菌、革兰氏阳性菌、胞内菌等临床关注度较高的病原体具有较高的检出率，更有利于辅助临床进行诊断。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图11087例样本中真菌检出前9图示；图2511例样本中真菌检出排名；图31087例样本中细菌检出前13图示；图4511例样本中细菌检出排名。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围，并且所述实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。部分术语定义除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。本发明中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。本发明所述的应用于二代感染宏基因组检测的临床样本病原体的处理方法，包括如下步骤1)样品预处理步骤：取感染样本离心，保留部分上清及沉淀在离心管中备用；在一些实施方式中，所述离心为12,000-14,000g离心3-5min；在一些实施方式中，所述样品预处理步骤为：对于非粘稠类感染样本，取1-2ml样本，12,000-14,000g离心3-5min，吸去上清，并留部分上清及沉淀在离心管中备用；对于粘稠类感染样本，取100-200μl样本加入解稠剂或pbs，涡旋震荡，40-42℃、300-400rpm震荡孵育10-15min，然后12,000-14,000g离心3-5min，吸去上清，并留部分上清及沉淀在离心管中备用。在一些实施方式中，所述样品预处理步骤为：对于非粘稠类感染样本，取1-2ml样本，14,000g离心5min，吸去上清，并留部分上清及沉淀在离心管中备用；对于粘稠类感染样本，取200μl样本加入解稠剂或pbs，涡旋震荡，42℃、400rpm震荡孵育10min，然后14,000g离心5min，吸去上清，并留部分上清及沉淀在离心管中备用。2)样品溶菌破壁步骤：预处理后的样本加入终浓度大于1mg/ml的溶菌酶温育；温育好的样本加入mplysingmatrie管中，gb裂解液裂解；mp破壁仪震荡破碎；低温离心后备用；在一些实施方式中，所述样本破壁步骤具体如下：预处理后的样本加入终浓度大于1mg/ml的溶菌酶，35-37℃温育；温育好的样本加入mplysingmatrie管中，gb裂解液裂解；mp破壁仪上fastprep-24tm5g上6m/s震荡60-120s，1-2次；将mplysingmatrie管12,000-14,000g低温离心3-8min，储存备用；在一些优选的实施方式中，所述样本破壁步骤具体如下：预处理后的样本加入终浓度大于1mg/ml的溶菌酶，37℃温育15min；温育好的样本加入mplysingmatrie管中，加200μl的gb裂解液；mp破壁仪上fastprep-24tm5g上6m/s震荡120s，1次；将mplysingmatrie管14,000g低温离心5min，储存备用；在一些实施方式中，所述非粘稠类感染样本包括但不显著胸腹水、肺泡灌洗液、脑脊液、尿液、脓液、非粘稠类痰液样本等。所述粘稠类感染样本包括痰液样本。本发明实施例中用到的主要试剂信息如下：本发明实施例中用到的主要仪器信息如下：实施例1lysingmatrixe裂解管裂解时间优化本发明通过对裂解方式的前期优化，确立mpbiomedicalstmlysingmatrixe为最适于二代测序宏基因组样本的裂解手段。进一步的，对lysingmatrixe裂解管的破壁条件进行测试优化，选择3种条件进行测试，条件1：6m/s震荡40s2次；条件2：6m/s震荡60s2次；条件3：6m/s震荡120s1次。对比三个条件优劣，每个条件重复3次，所用样本为spikein样本，该样本购买商业化的细菌及病毒原液，使用模拟样本机质进行混合后进行处理，具体操作步骤如下：1样本预处理1.1取9管配制好的spikein样本，每管spikein样本1ml，14,000g离心5min。小心吸去上清，并留500μl上清及沉淀在离心管中备用。1.2加入5μl配制好的20mg/ml的溶菌酶(现配现用)，37℃温育15min。1.3上述温育好的样本加入mplysingmatrie管中，加200μl的天根的gb裂解液。1.4mp破壁仪上fastprep-24tm5g上分别使用条件1、条件2、条件3处理样本，每个实验组3个样本。1.5将mplysingmatrie管14,000g低温离心5min，离心结束后取全部上清加入一新的2mlep管中备用，进入核酸提取、文库构建、上机测序、生信分析步骤；经过测试，从核酸提取总量上可看出，条件2≈条件3显著性高于条件1，而这一点与微生物检出的reads数也较为一致，从表2可看出，条件2及条件3检出的微生物listeriamonocytogenesreads数为条件1的2-3倍，因此条件2及条件3的核酸释放更为显著，即：6m/s震荡60s，2次或6m/s震荡120s，1次；不过综合考虑到操作的便携性，最终选定确定条件3进行后续的测试优化。表1不同mp破壁条件提取总量差异表2不同mp破壁条件提取总量差异实施例2：与传统破壁机质比较选择玻璃研磨珠(珠子直径0.8-1mm规格)及mp厂家的lysingmatrixe裂解管两种介质作为临床样本细胞机械破壁的机质，将机质作为单一变量，按照本发明的流程进行破壁、核酸提取、文库构建、上机测序及生信分析，对比两者检出的优劣，每种破壁基质进行2个样本重复的处理，所用样本为spikein样本，购买商业化的细菌及病毒原液，使用模拟样本机质进行混合后进行处理，lysingmatrixe裂解管的处理流程参见实施例1中的条件3，研磨珠的处理流程如下：1.取spikein样本1ml，14,000g离心5min。小心吸去上清，并留500μl上清及沉淀在离心管中备用。2.加入5μl配制好的20mg/ml的溶菌酶(现配现用)，37℃温育15min。3.在上述温育好的样本加入准备好的研磨珠【研磨珠需进行湿热灭菌(121℃，20min)，烘箱中65℃干燥后再使用】0.5ml，再加200μl的gb裂解液。4.mp破壁仪上fastprep-24tm5g上6m/s震荡120s，1次。5.将破壁后的混合物14,000g低温离心5min，离心结束后取全部上清加入一新的2mlep管中备用，进入核酸提取、文库构建、上机测序、生信分析步骤；从表3可看到，使用研磨珠破壁的两个样本，其检出的微生物listeriamonocytogenes的reads数仅为mp破壁管的1/2-1/3，且其他方法a的检出reads也明显低于本发明的mp破壁管。综上，采用本发明的mp破壁管的破壁效果更佳，mp破碎管最终检测到的目标病原体的绝对拷贝数为玻璃珠的2.8-3.1倍。表3两种不同机质细胞破碎效果对比实施例3：不同溶菌酶体积对检出影响测试本发明将溶菌酶稀释至20mg/ml，随后测试了投入5μl、10μl、15μl、20μl溶菌酶对微生物检出的影响，将溶菌酶体积作为单一变量，使用lysingmatrixe作为破壁介质进行对比分析。所使用样本为已有nanopore宏基因组检测结果的痰液临床样本一例，每个处理组做两个生物学重复检测。本发明所述溶菌酶稀释如下：本发明的溶菌酶酶活≥5,000u/mgdw，固体粉末，使用溶菌酶缓冲液lysozymebuffer:20mmtris·cl,ph8.0；2mmsodiumedta；1.2％tritonx-100进行稀释，具体：取20mg溶菌酶，溶解于1mllysozymebuffer中，配制成20mg/ml的溶菌酶溶液。具体处理操作步骤如下：1样本预处理1.1分别取200μl痰液于4个不同的2ml圆底离心管，分别加入1ml解稠剂，涡旋震荡，42℃、400rpm震荡孵育10min，然后14,000g离心5min，小心吸去上清，并留500μl上清及沉淀在离心管中备用。1.2其中两管解稠后的样本加入5μl配制好的20mg/ml的溶菌酶(现配现用)，另外两管解稠后的样本加入10μl配制好的20mg/ml的溶菌酶(现配现用)，37℃温育15min。1.3上述温育好的样本加入mplysingmatrie管中，加200μl的gb裂解液。1.4mp破壁仪上fastprep-24tm5g上6m/s震荡120s，1次。1.5将mplysingmatrie管14,000g低温离心5min，离心结束后取全部上清加入一新的2mlep管中备用，进入核酸提取、文库构建、上机测序、生信分析步骤；从下述表4可以看到，当溶菌酶的体积为5μl时，存在病原微生物漏检的情况，而当溶菌酶所使用体积≥10μl时(对应的终浓度大于1mg/ml)，所有病原微生物均可正常检出，最适于感染样本病原微生物的检出。表4不同溶菌酶体系检出对比实施例4：不同方法学检出一致性验证选取已有nanopore宏基因组检测结果的临床样本20例，含11例肺泡灌洗液、脓液样本4例、痰液4例、口腔粘膜1例，样本储存时间为1个月以内，储存条件为-15～-25℃。所有样本以nanopore检出结果为标准，对比本发明流程及其他方法a的处理。本发明流程如下：1.1样本预处理a肺泡灌洗液、脓液样本预处理取1ml肺泡灌洗液、脓液1ml样本于2ml离心管，14,000g离心5min。小心吸去上清，并留500μl上清及沉淀在离心管中b痰液样本预处理取200μl痰液于2ml圆底离心管，加入1ml解稠剂，涡旋震荡，42℃、400rpm震荡孵育10min，然后14,000g离心5min，小心吸去上清，并留500μl上清及沉淀在离心管中备用。1.2加入10μl配制好的20mg/ml的溶菌酶(终浓度为1mg/ml)，37℃温育15min。1.3上述温育好的样本加入mplysingmatrie管中，加200μl的gb裂解液。1.4mp破壁仪上fastprep-24tm5g上6m/s震荡120s，1次。1.5将mplysingmatrie管14,000g低温离心5min，离心结束后取全部上清加入一新的2mlep管中备用，进入核酸提取、文库构建、上机测序、生信分析步骤；其他方法a检测流程如下：1样本预处理1.1肺泡灌洗液、脓液和痰液样本预处理，流程同上述本发明流程1.1；1.2在上述温育好的样本加入准备好的研磨珠【研磨珠需进行湿热灭菌(121℃，20min)，烘箱中65℃干燥后再使用】0.5ml，再加200μl的gb裂解液。1.3在涡旋混合仪上涡旋混合20min。1.4将上述混合物离心，全部上清加入一新的2mlep管中备用，进入核酸提取、文库构建、上机测序、生信分析步骤；表5展示本实施例的检出对比，可以看到共有5例样本的检出在本发明流程中优于其他方法a，提高了25％的检出率，共计5例样本有念珠菌、绿脓杆菌、洋葱伯克霍尔德、粪产碱菌等深部感染真菌及条件致病菌的检出。表5本发明流程与企业流程a对标nanopore检出结果综上，本发明流程的检出优于其他方法a。本发明的宏基因组临床样本处理流程，不仅能够保证有效的二代测序检出率，还能够简化流程、缩短处理时间，这对于重症临床感染患者的检测尤为重要。因此本发明具有显著的临床价值。检测方法实验时间检出率操作便捷性ngs-本发明0.6h较高较高ngs-其他方法a2.5h一般一般实施例5临床多样本检测使用本发明方法进行1087例临床疑似感染患者的肺泡灌洗液、痰液、脑脊液、血液等临床样本检测。结果显示，真菌检出排名前四的为假丝酵母属、曲霉属、孢子丝菌属、隐球菌属，与文献中描述的真菌检出顺序一致(qingmiaoetal.2018)，文献中对来自临床511例患者疑似急性或慢性感染的痰液、肺泡灌洗液、血液等共计16种样本类型进行了宏基因组的检测，检出的真菌种排名前三的为曲霉属、假丝酵母属、隐球菌属，与本发明的检出一致。使用本发明检测的1087例样本中，细菌检出排名前11的分别为肺炎链球菌、副流感嗜血杆菌、假肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、纹带棒杆菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、屎肠球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、粪肠球菌、恶臭假单胞菌与该文献中报道的检出前13的细菌中，有7个完全一致，分别为铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、肠球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌。1087例样本中真菌检出情况如图1所示，与文献中描述的一致，文献中511例样本检出的真菌排名见图2；1087例样本中细菌检出情况如图3所示，与文献中描述的检出一致性较高，文献中511例样本检出的细菌排名见图4。可见本发明方法能够应用于临床各类样本，包括但不限于肺泡灌洗液、痰液、脑脊液、血液等，检测结果真实可靠，适于推广产业应用。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。当前第1页12