一种快速检测sars-cov-2病毒中和抗体有效性的方法
技术领域
1.本发明涉及一种快速检测sars-cov-2病毒中和抗体有效性的方法，属于基因工程技术领域。
背景技术：
[0002][0003]
sars-cov-2是一类具有囊膜、线性单股正链的rna病毒，具有5个必需基因，分别编码翻译核蛋白(n)、病毒包膜(e)、基质蛋白(m)和刺突蛋白(s)4种结构蛋白以及 rna依赖性的rna聚合酶(rdrp)。由于具有高致病性呼吸道病毒，感染性极强的特性。针对sars-cov-2株的工作必须在具有至少bsl3级别的环境下进行。
[0004]
新型冠状病毒中和抗体和疫苗作为防治新冠的主要手段，今天正被广泛的研发与投产使用，但由于人群基数大，病毒株的变异多，新冠抗体及疫苗对人群的有效性有明显的个体差异，因此针对新冠中和抗体的有效性检测对防治新冠尤为重要。
[0005]
目前，基于sars-cov-2的安全性要求，两种主要技术被用于对新冠中和抗体有效性的大规模检测。第一种检测技术基于ace-2/s蛋白，即使用酶联免疫吸附法(elisa)或胶体金平台检测中和抗体对新冠抗原蛋白的结合效率；第二种检测技术基于假病毒，即使用在复制缺陷型病毒的表面上表达sars-cov-2s蛋白的嵌合性病毒颗粒代替sars-cov-2，通过检测相应信号，评估中和抗体抑制病毒复制的效率。
[0006]
基于ace-2/s蛋白的检测技术用时短(0.5-2小时)，但由于仅针对特定抗原蛋白的结合，因此评估准确性低；基于假病毒的检测技术准确率高，但用时长(2-3天)，同时由于所使用的假病毒颗粒只表达sars-cov-2的部分蛋白，因此存在潜在的评估结果差异性。
技术实现要素：
[0007]
针对现有基于ace-2/s蛋白的检测技术、基于假病毒的检测技术存在的准确性低与检测用时长的缺点，本发明构建了一种稳定表达sars-cov-2病毒蛋白(m、n、e)的细胞株，可快速有效产出大量具有全部sars-cov-2结构蛋白(m、n、e、s)的病毒样颗粒，该病毒样颗粒不仅与sars-cov-2更为相似，而且安全性可控，同时该病毒样颗粒具有荧光表达基因，可更准确快速的进行中和抗体有效性检测。
[0008]
本发明提供的稳定表达sars-cov-2病毒结构蛋白(m、n、e)的细胞株，通过使用携带有sars-cov-2病毒m、n、e蛋白基因的vsv-g假病毒转染细胞，利用抗性筛选标记获得单克隆细胞。
[0009]
在一种实施方式中，所述细胞为239t细胞。
[0010]
在一种实施方式中，所述vsv-g假病毒的包装方法如下：将phage2-ef1aint-m-n-e
‑ꢀ
ires-g418质粒,pcmvδr8.2质粒,pcmv-vsv-g质粒共转染293t细胞，获得vsv-g假病毒。
[0011]
在一种实施方式中，所述抗性筛选标记为g418。
[0012]
本发明还提供了一种生产sars-cov-2病毒样颗粒的方法，通过将sars-cov-2-s质
粒和ha-cov-2-luc质粒共转染稳定表达sars-cov-2病毒结构蛋白(m、n、e)的细胞株，培育后收集上清浓缩保存。
[0013]
在一种实施方式中，所述稳定表达sars-cov-2病毒结构蛋白的细胞株，通过携带有 sars-cov-2病毒m、n、e结构基因的vsv-g假病毒转染细胞，使用抗性筛选标记获得。
[0014]
在一种实施方式中，vsv-g假病毒的包装方法如下：将phage2-ef1aint-m-n-e-ires
‑ꢀ
g418质粒,pcmvδr8.2质粒,pcmv-vsv-g质粒共转染293t细胞，培养后离心获得。
[0015]
本发明还提供了一种检测sars-cov-2病毒中和抗体有效性的方法，通过将sars
‑ꢀ
cov-2病毒样颗粒与待测血清混合，预处理后加入hek293t(ace2/tmprss2)细胞进行培养，培养后收集细胞，通过检测荧光信号，分析有效性。
[0016]
具体检测方法如下：
[0017]
1)将收集的病毒样颗粒与待测血清混合，进行预处理；
[0018]
2)将预处理的混合物加入hek293t(ace2/tmprss2)细胞，进行培养；
[0019]
3)使用pbs清洗细胞两次，在正常培养基中继续培养细胞；
[0020]
4)收集细胞，通过检测荧光信号，分析有效性。
[0021]
在一种实施方式中，所述sars-cov-2病毒样颗粒的大规模生产方法，通过将sars
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cov-2-s质粒和ha-cov-2-luc质粒共转染稳定表达sars-cov-2病毒结构蛋白(m、n、e) 的细胞株，培育后收集上清浓缩保存。
[0022]
在一种实施方式中，所述稳定表达sars-cov-2病毒结构蛋白的细胞株，通过携带有 sars-cov-2病毒m、n、e结构基因的vsv-g假病毒转染细胞，使用抗性筛选标记获得。
[0023]
在一种实施方式中，vsv-g假病毒的包装方法如下：将phage2-ef1aint-m-n-e-ires
‑ꢀ
g418质粒,pcmvδ8.2质粒,pcmv-vsv-g质粒共转染293t细胞，培养后离心获得。
[0024]
本发明通过构建稳定表达sars-cov-2蛋白(m、n、e)的细胞株及大规模质粒转染技术，可快速有效产出大量具有全部sars-cov-2结构蛋白(m、n、e、s)的病毒样颗粒。该病毒样颗粒不仅与sars-cov-2更为相似，而且安全性可控，具有荧光表达基因，可在5-12个小时内实现准确快速的sars-cov-2中和抗体有效性检测。
[0025]
此外，本发明所提供的方法，还可检测sars-cov-2中和抗体对于sars-cov-2变异株的有效性，分析sars-cov-2变异株的感染性。
具体实施方式
[0026]
实验载体：
[0027]
ha-cov-2-luc、sars-cov-2-s质粒，参考文献如下：
[0028]
development of a novel hybrid alphavirus-sars-cov-2particle for rapid in vitro screening and quantification of neutralization antibodies,antiviral drugs,and viral mutations, biorxiv 2020.12.22.423965；doi:https://doi.org/10.1101/2020.12.22.423965。
[0029]
phage2-ef1aint-m-n-e-ires-g418质粒、pcmvδr8.2质粒、pcmv-vsv-g可进行商业化购买或合成。
[0030]
phage2-ef1aint-m-n-e-ires-g418构建方法如下：将m蛋白，n蛋白与e蛋白的orf序列以t2a和p2a序列串联，构成m-n-e的序列；使用phage2-ef1a-int慢病毒载体，将m
‑ꢀ
n-e
序列克隆入ef1a-int启动子后；使用phage2-ef1a-int-m-n-e质粒，将g418序列通过 ires序列克隆于m-n-e序列后；最终获得phage2-ef1aint-m-n-e-ires-g418质粒。
[0031]
实施例1稳定表达sars-cov-2蛋白的细胞株
[0032]
1.将phage2-ef1aint-m-n-e-ires-g418质粒,pcmvδr8.2质粒,pcmv-vsv-g质粒共转染293t细胞，生产携带sars-cov-2病毒m、n、e蛋白基因的vsv-g假病毒。
[0033]
2.将包装的vsv-g假病毒转染293t细胞，利用g418抗性筛选单克隆细胞获得稳转细胞株。
[0034]
3.提取稳转细胞株的总蛋白，wb确认其有sars-cov-2结构蛋白m、n、e的表达。
[0035]
通过wb分析，可检测到sars-cov-2结构蛋白m、n、e，稳定表达sars-cov-2蛋白的 293t细胞株构建成功。
[0036]
实施例2基于稳转sars-cov-2蛋白细胞株的病毒样颗粒生产及收集
[0037]
1. 5x10e6细胞与10ml培养基混合，铺于10cm培养皿；
[0038]
2.将2.5μg sars-cov-2-s质粒和10μg of ha-cov-2-luc质粒共转染稳定表达sars
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cov-2病毒结构蛋白(m、n、e)的稳转细胞株；
[0039]
3.转染后48小时收集上清，使用0.45μm滤网过滤，随后梯度离心浓缩，获得sars-cov
‑ꢀ
2病毒样颗粒。
[0040]
实施例3检测sars-cov-2病毒样颗粒感染细胞固定时间后产生的荧光信号
[0041]
将sars-cov-2病毒样颗粒分别转染hek293(ace2/tmprss2)细胞、calu3细胞、 monkey kidney细胞，48小时后，用酶标仪检测luciferase信号，可获得有效信号，sars
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cov-2病毒样颗粒生产成功。
[0042]
实施例4检测sars-cov-2病毒样颗粒感染细胞不同时间后产生的感染信号
[0043]
将sars-cov-2病毒样颗粒转染hek293(ace2/tmprss2)细胞，不同时间后，用酶标仪检测luciferase信号，2-6个小时后，能够检测到荧光信号。
[0044]
实施例5中和抗体梯度浓度处理病毒样颗粒测试
[0045]
将不同浓度的中和抗体与sars-cov-2病毒样颗粒混合预处理，而后将预处理的混合物与hek293(ace2/tmprss2)混合固定时间，而后用酶标仪检测luciferase信号。结果表明， ic50大于400倍稀释。
[0046]
实施例6 sars-cov-2中和抗体有效性检测
[0047]
1.将收集的病毒样颗粒与待测血清混合，于37度培养箱预处理1小时；
[0048]
2.将预处理的混合物加入hek293t(ace2/tmprss2)细胞2小时；
[0049]
3.使用pbs清洗细胞两次，在正常培养基中继续培养细胞3小时；
[0050]
4.收集细胞，使用luciferase assay lysis buffer进行信号检测，分析有效性。
[0051]
通过本方法可对中和抗体进行有效检测，检测时间可缩短至5-12个小时，显著节约检测时间。