检测新型冠状病毒变异株和亚型的方法
本发明涉及体外病毒检测技术领域，特别是涉及一种基于crispr-cas12a法检测新型冠状病毒sars-cov-2变异株的特异crrna、探针、检测体系及方法。
背景技术：
目前新型冠状病毒sars-cov-2已经演化出多种变异株和亚型，导致病毒致病力、传播效率改变，影响疫苗的保护率，成为疫情防控的新问题。虽然通过病毒基因组序列分析能够发现和诊断sars-cov-2的变异株和亚型，但无法满足现场检测的需求，也不能做到高通量检测大量样本，影响疫情防控。
新型冠状病毒sars-cov-2的两个型别l亚型和s亚型，两个亚型的区别在于sars-cov-2基因组的第28144位核苷酸，l亚型是t碱基(对应亮氨酸，leu)，s亚型是c碱基(对应丝氨酸，ser)。s亚型在sars-cov-2暴发的早期阶段更为普遍，而l亚型的发生频率在2020年1月初后逐渐增加并随后成为优势毒株。自大流行开始以来，越来越多的sars-cov-2变异序列被检测到，其中最重要的突变位于编码刺突蛋白(s蛋白)的基因中，这可能改变sars-cov-2的感染性和抗原性从而影响sars-cov-2的传播能力、致病能力、免疫逃逸能力等。一种含有刺突蛋白中第614位氨基酸突变(d614g)的变异株出现在大流行早期并迅速在欧洲和北美传播，诸多证据已经表明含有d614g突变的sars-cov-2更容易传播。随后，在丹麦发现了一种与养殖水貂感染有关的sars-cov-2变异株(b.1.1.298)且能传播给人类。2020年12月14日，英国当局宣布已通过病毒基因组测序鉴定出新的sars-cov-2变异株(b.1.1.7)。相关研究发现，b.1.1.7变异株具有更强的传播能力并且感染b.1.1.7变异株的患者病情更重，康复期患者或者疫苗接种者的血清对变异株b.1.1.7的中和效果略微降低。紧接着，南非当局于2020年12月18日宣布发现了一种sars-cov-2的变异株(b.1.351)，到2021年1月，另一个sars-cov-2变异株(p.1)在巴西或来自巴西的旅行者中被发现。一些报告表明，变异株b.1.351和p.1均表现出更强的传播能力以及再感染能力，更重要的是，康复期患者或者疫苗接种者的血清对变异株b.1.351和p.1的中和效果均显著降低。sars-cov-2不同变异株的结构蛋白(尤其是刺突蛋白)能发生快速变异，使病毒能够逃避自然感染或者疫苗接种诱导的机体免疫，因此实现sars-cov-2检测的同时对其进行分型以及变异株的鉴别显得尤为重要。新型冠状病毒变异株的相关特性如表一所示。
表一
sars-cov-2变异株的检测主要是通过传统的测序进行的，不论是一代测序技术，还是基于二代基因测序的宏基因组测序和第三代高通量测序，都需要利用pcr扩增技术构建cdna文库，然后利用昂贵、专业的仪器，由专业操作人员进行测序。利用专业的生物信息学软件，对测序数据进行清洗和分析，以获得病毒基因序列和相关的变异情况。虽然通过对病毒基因序列的分析，能找出不同毒株的同源性，鉴别其来源，分析其演化过程，跟踪其突变情况。但是，由于病毒基因测序对实验室配置要求高，耗时长，成本高，操作人员技术和专业知识要求极高，使其在sars-cov-2病毒变异株的快速鉴别应用上受到限制。
因此，针对现有技术不足，提供一种耗时短、易于操作的基于crispr-cas12a法检测新型冠状病毒sars-cov-2变异株的特异crrna、探针、试剂盒及方法以克服现有技术不足甚为必要。
技术实现要素：
本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种基于crispr-cas12a法检测新型冠状病毒sars-cov-2变异株的特异crrna、探针、检测体系及方法，具有检测时间短、操作简便的特点。
本发明的目的通过以下技术措施实现。
提供一种用于鉴别新型冠状病毒sars-cov-2不同变异株核酸的特异crrna，基于crispr-cas12a技术检测，
用于鉴别l亚型和s亚型的特异crrna为orf8-crrna，核苷酸序列为5’-uaauuucuacuaaguguagaccuuuuacaauuaauugcca-3’(seqidno1)；
用于鉴别sars-cov-2的s蛋白基因的变异位点l5f、d80a、d215g、r246i、y453f、n501y、a570d、d614g、a701v、t716i、s982a、p1263l、k417n、l452r、e484q的特异crrna分别为s-l5f-crrna、s-d80a-crrna、s-d215g-crrna、s-r246i-crrna、s-y453f-crrna、s-n501y-crrna、s-a570d-crrna、s-d614g-crrna、s-a701v-crrna、s-t716i-crrna、s-s982a-crrna、s-p1263l-crrna、s-k417n-crrna、s-l452r-crrna、s-e484q-crrna，核苷酸序列分别为:
s-l5f-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagauuuuauugccacuagucucu-3’(seqidno2)；
s-d80a-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagacuaacccuguccuaccauuu-3’(seqidno.3)；
s-d215g-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagagugcguggucucccucaggg-3’(seqidno.4)；
s-r246i-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagacauauaaguuauuugacucc-3’(seqidno.5)；
s-y453f-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagagauuguuuaggaagucuaau-3’(seqidno.6)；
s-n501y-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagacaacccacuaaugguguugg-3’(seqidno.7)；
s-a570d-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagagcagagacauugaugacacu-3’(seqidno.8)；
s-d614g-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagaucaggacguuaacugcacag-3’(seqidno.9)；
s-a701v-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguaguacaccaagugacauagugu-3’(seqidno.10)；
s-t716i-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagauggguauggcaauagaguu-3’(seqidno.11)；
s-s982a-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagaacgucuugacaaaguugagg-3’(seqidno.12)；
s-p1263l-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagagcacuagcucagagucguc-3’(seqidno.13)；
s-k417n-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagaaacgauugcugauuauaauu-3’(seqidno.32)；
s-l452r-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagaccgauauagauuguuuagga-3’(seqidno.33)；
s-e484q-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagaaaugguguacaagguuuuaa-3’(seqidno.34)。
优选的，上述的用于鉴别不同冠状病毒sars-cov-2变异株核酸的特异crrna，探针的核苷酸序列为5’-ttatt-3’(seqidno.14)。
优选的，上述的用于鉴别不同冠状病毒sars-cov-2变异株核酸的特异crrna，所述探针5’端修饰荧光报告基团fam，3’端修饰荧光淬灭基团bhq1。
优选的，上述的用于鉴别不同冠状病毒sars-cov-2变异株核酸的特异crrna，特异性引物组的核苷酸序列为：
orf8上游引物:5’-aggaatcatcacaactgtagc-3’(seqidno.19)；
orf8下游引物:5’-aggaatcatcacaactgtagc-3’(seqidno.20)；
s基因-1上游引物：5’-ctagtgatgttcttgtt-3’(seqidno.21)；
s基因-1下游引物：5’-tgcacagtctacagcatc-3’(seqidno.22)；
s基因-2上游引物：5’-acttgtgcccttttggtgaag-3’(seqidno.23)；
s基因-2下游引物：5’-gctattccagttaaagcacggt-3’(seqidno.24)；
s基因-3上游引物：5’-agactcactttcttccacagcaa-3’(seqidno.25)；
s基因-3下游引物：5’-gtatcgttgcagtagcgcga-3’(seqidno.26)；
k417n-上游引物:5’-atcgctccagggcaaatttgaaa-3’(seqidno.27)；
k417n-下游引物:5’-gctattccagttaaagcacggt-3’(seqidno.28)；
l452r-上游引物：5’-aggttggtggtaattatatttac-3’(seqidno.29)；
l452r/e484q-下游引物：5’-agtactactactctgtatggttggt-3’(seqidno.30)；
e484q-上游引物：5’-agcacaccttttaatggtgtt-3’(seqidno.31)；
orf8-crrna所使用的特异性pcr扩增引物为orf8上游引物、orf8下游引物；
s-l5f-crrna、s-d80a-crrna、s-d215g-crrna、s-r246i-crrna所使用的特异性pcr扩增引物为s基因-1上游引物(seqidno.21)、s基因-1下游引物(seqidno.22)，s-y453f-crrna、s-a570d-crrna、s-d614g-crrna、s-a701v-crrna、s-t716i–crrna所使用的特异性pcr扩增引物为s基因-2上游引物(seqidno.23)、s基因-2下游引物(seqidno.24)，s-s982a-crrna、s-p1263l-crrna所使用的特异性pcr扩增引物为s基因-3上游引物(seqidno.25)、s基因-3下游引物(seqidno.26)；
cas12a蛋白的激活和切割活性需要目标序列的5’末端存在富含t的pam序列,但是在实际检测应用中，不是每个突变位点的5’末端均有pam序列的存在。k417n、l452r和e484q这三个突变出现于最近在印度流行的b.1.618变异株中。由于上述三个突变位点5’末端均缺少pam序列而无法常规使用cas12a蛋白介导的鉴别试验，为解决这一问题，本研究通过设计特定的pcr引物将pam序列引入到突变位点的5’末端。s-k417n-crrna所使用的带有pam位点的特异性pcr扩增引物为k417n-上游引物、k417n-下游引物；s-l452r-crrna所使用的带有pam位点的特异性pcr扩增引物为l452r-上游引物(seqidno.29)、l452r/e484q-下游引物(seqidno.30)；s-e484q-crrna所使用的带有pam位点的特异性pcr扩增引物为e484q-上游引物(seqidno.31)、l452r/e484q-下游引物(seqidno.30)。
本发明的第二个目的是提供一种探针，基于crispr-cas12a技术、使用上述特异crrna鉴别不同冠状病毒sars-cov-2变异株，核苷酸序列为：5’-ttatt-3’。
优选的，上述探针，5’端修饰荧光报告基团fam和3’端修饰荧光淬灭基团bhq1。
本发明的第三个目的是提供一种用于检测sars-cov-2变异株的crispr-cas12a检测体系，包括上述特异crrna、探针、无核酶水以及缓冲液buffer2.1。
优选的，上述的用于检测sars-cov-2变异株的crispr-cas12a检测体系，通过如下步骤检测：
(1)采用所述检测体系，置于37℃恒温荧光检测仪中孵育10min后，加入sars-cov-2基因组dna为模板进行crispr-cas12a检测，检测时间为30min，获得检测结果；
(2)对荧光信号进行分析，判断样品中是否含有sars-cov-2变异株病毒核酸。
优选的，上述用于检测sars-cov-2变异株的crispr-cas12a检测体系，采用crispr-cas12a检测方法结合pcr扩增检测sars-cov-2变异株，以待测样品基因组dna为模板，利用特异性引物组、特异crrna以及探针，进行sars-cov-2变异株检测，根据荧光信号判定结果。
本发明的第四个目的是提供上述crispr-cas12a检测体系在作为鉴别sars-cov-2变异株的试剂盒方面的用途。
本发明针对sars-cov-2的变异株和亚型，通过设计特异性crrna，用于检测sars-cov-2的变异株和亚型，可以实现sars-cov-2常见变异株和亚型的快速检测和诊断。本发明通过crispr-cas12a检测特定sars-cov-2基因组dna技术可以准确地检测出sars-cov-2变异株。相较于目前基于病毒基因测序鉴别sars-cov-2变异株和亚型，本发明在鉴别sars-cov-2变异株和亚型方面不需要依赖昂贵的仪器和专业的技术人员，能够大大缩短了检测时间，具有高特异性、高灵敏度、快速高效、操作简便、结果易读等优点。
说明书附图
利用附图对本发明作进一步的说明，但附图中的内容不构成对本发明的任何限制。
图1为采用orf8-crrna检测sars-cov-2-orf8-l/s型质粒、hiv-1全长质粒以及hcv全长质粒图。
图2、图3、图4为采用s-l5f-crrna、s-d80a-crrna、s-d215g-crrna、s-r246i-crrna、s-y453f-crrna、s-n501y-crrna、s-a570d-crrna、s-d614g-crrna、s-a701v-crrna、s-t716i-crrna、s-s982a-crrna、s-p1263l-crrna检测sars-cov-2-s蛋白野生型/突变型dna质粒图。
图5为crispr-cas12a直接检测与pcr扩增联合检测sars-cov-2-orf8-l型图(n.s.代表p>0.05；*代表p<0.05；**代表p<0.01；***代表p<0.001；****代表p<0.0001)。
图6、图7、图8为pcr扩增联合crispr-cas12a检测sars-cov-2-s蛋白野生型/突变型dna质粒(n.s.代表p>0.05；*代表p<0.05；**代表p<0.01；***代表p<0.001；****代表p<0.0001)。
图9为利用带有pam位点的特异性引物进行pcr扩增联合crispr-cas12a检测sars-cov-2-s蛋白s-k417n、s-l452r、s-e484q变异株的dna质粒图(n.s.代表p>0.05；*代表p<0.05；**代表p<0.01；***代表p<0.001；****代表p<0.0001)。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步说明。
实施例1。
一种用于鉴别不同冠状病毒sars-cov-2变异株核酸的特异crrna，基于crispr-cas12a技术检测，
用于鉴别l亚型和s亚型的特异crrna为orf8-crrna，核苷酸序列为5’-uaauuucuacuaaguguagaccuuuuacaauuaauugcca-3’(seqidno1)。
用于鉴别sars-cov-2的s蛋白基因的变异位点l5f、d80a、d215g、r246i、y453f、n501y、a570d、d614g、a701v、t716i、s982a、p1263l、k417n、l452r、e484q的特异crrna分别为s-l5f-crrna、s-d80a-crrna、s-d215g-crrna、s-r246i-crrna、s-y453f-crrna、s-n501y-crrna、s-a570d-crrna、s-d614g-crrna、s-a701v-crrna、s-t716i-crrna、s-s982a-crrna、s-p1263l-crrna、s-k417n-crrna、s-l452r-crrna、s-e484q-crrna，核苷酸序列分别为:
s-l5f-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagauuuuauugccacuagucucu-3’(seqidno2)；
s-d80a-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagacuaacccuguccuaccauuu-3’(seqidno.3)；
s-d215g-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagagugcguggucucccucaggg-3’(seqidno.4)；
s-r246i-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagacauauaaguuauuugacucc-3’(seqidno.5)；
s-y453f-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagagauuguuuaggaagucuaau-3’(seqidno.6)；
s-n501y-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagacaacccacuaaugguguugg-3’(seqidno.7)；
s-a570d-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagagcagagacauugaugacacu-3’(seqidno.8)；
s-d614g-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagaucaggacguuaacugcacag-3’(seqidno.9)；
s-a701v-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguaguacaccaagugacauagugu-3’(seqidno.10)；
s-t716i-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagauggguauggcaauagaguu-3’(seqidno.11)；
s-s982a-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagaacgucuugacaaaguugagg-3’(seqidno.12)；
s-p1263l-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagagcacuagcucagagucguc-3’(seqidno.13)；
s-k417n-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagaaacgauugcugauuauaauu-3’(seqidno.32)；
s-l452r-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagaccgauauagauuguuuagga-3’(seqidno.33)；
s-e484q-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagaaaugguguacaagguuuuaa-3’(seqidno.34)。
本实施例的用于鉴别不同冠状病毒sars-cov-2变异株核酸的特异crrna，对应的探针的核苷酸序列为5’-ttatt-3’(seqidno.14)。探针5’端修饰荧光报告基团fam，3’端修饰荧光淬灭基团bhq1。
特异性引物组的核苷酸序列为：
orf8上游引物:5’-aggaatcatcacaactgtagc-3’(seqidno.19)；
orf8下游引物:5’-aggaatcatcacaactgtagc-3’(seqidno.20)；
s基因-1上游引物：5’-ctagtgatgttcttgtt-3’(seqidno.21)；
s基因-1下游引物：5’-tgcacagtctacagcatc-3’(seqidno.22)；
s基因-2上游引物：5’-acttgtgcccttttggtgaag-3’(seqidno.23)；
s基因-2下游引物：5’-gctattccagttaaagcacggt-3’(seqidno.24)；
s基因-3上游引物：5’-agactcactttcttccacagcaa-3’(seqidno.25)；
s基因-3下游引物：5’-gtatcgttgcagtagcgcga-3’(seqidno.26)；
k417n-上游引物:5’-atcgctccagggcaaatttgaaa-3’(seqidno.27)；
k417n-下游引物:5’-gctattccagttaaagcacggt-3’(seqidno.28)；
l452r-上游引物：5’-aggttggtggtaattatatttac-3’(seqidno.29)；
l452r/e484q-下游引物：5’-agtactactactctgtatggttggt-3’(seqidno.30)；
e484q-上游引物：5’-agcacaccttttaatggtgtt-3’(seqidno.31)；
orf8-crrna所使用的特异性pcr扩增引物为orf8上游引物、orf8下游引物；
s-l5f-crrna、s-d80a-crrna、s-d215g-crrna、s-r246i-crrna所使用的特异性pcr扩增引物为s基因-1上游引物(seqidno.21)、s基因-1下游引物(seqidno.22)，s-y453f-crrna、s-a570d-crrna、s-d614g-crrna、s-a701v-crrna、s-t716i–crrna所使用的特异性pcr扩增引物为s基因-2上游引物(seqidno.23)、s基因-2下游引物(seqidno.24)，s-s982a-crrna、s-p1263l-crrna所使用的特异性pcr扩增引物为s基因-3上游引物(seqidno.25)、s基因-3下游引物(seqidno.26)；
cas12a蛋白的激活和切割活性需要目标序列的5’末端存在富含t的pam序列,但是在实际检测应用中，不是每个突变位点的5’末端均有pam序列的存在。k417n、l452r和e484q这三个突变出现于在印度流行的b.1.618变异株中。由于上述三个突变位点5’末端均缺少pam序列而无法常规使用cas12a蛋白介导的鉴别试验，为解决这一问题，本发明通过设计特定的pcr引物将pam序列引入到突变位点的5’末端。s-k417n-crrna所使用的带有pam位点的特异性pcr扩增引物为k417n-上游引物、k417n-下游引物；s-l452r-crrna所使用的带有pam位点的特异性pcr扩增引物为l452r-上游引物(seqidno.29)、l452r/e484q-下游引物(seqidno.30)；s-e484q-crrna所使用的带有pam位点的特异性pcr扩增引物为e484q-上游引物(seqidno.31)、l452r/e484q-下游引物(seqidno.30)。
本实施例设计并开发了基于crispr-cas12a技术的检测方法鉴别sars-cov-2变异株以及亚型，以实现更快、更经济地检测。
采用crispr-cas12a系统用于核酸检测，是体外核酸检测的新技术。该技术通过设计特异性crrna与待检测核酸结合，进而激活cas12酶，剪切带有荧光标记的探针，释放荧光信号，可以直接检测未经扩增的目标核酸，简化核酸检测过程；也可以结合传统核酸扩增后检测，提高检测结果的敏感性和特异性。该技术还能与免疫层析试纸技术结合，实现核酸现场快速检测。采用微流控等技术，可以整合样本处理、核酸扩增、检测一体化和自动化。
基于上述原理，提出针对sars-cov-2的变异株和亚型，通过设计特异性crrna，用于检测sars-cov-2的变异株和亚型，实现sars-cov-2常见变异株和亚型的快速检测和诊断。
本发明针对sars-cov-2的变异株和亚型，通过设计特异性crrna，用于检测sars-cov-2的变异株和亚型，可以实现sars-cov-2常见变异株和亚型的快速检测和诊断。本发明通过crispr-cas12a检测特定sars-cov-2基因组dna技术可以准确地检测出sars-cov-2变异株。相较于目前基于病毒基因测序鉴别sars-cov-2变异株和亚型，本发明在鉴别sars-cov-2变异株和亚型方面不需要依赖昂贵的仪器和专业的技术人员，能够大大缩短了检测时间，具有高特异性、高灵敏度、快速高效、操作简便、结果易读等优点。
实施例2。
一种用于检测sars-cov-2变异株的crispr-cas12a检测体系，包括实施例1中的特异crrna、探针、无核酶水以及缓冲液buffer2.1。
该检测体系，通过如下步骤检测：
(1)采用所述检测体系，检测体系包含浓度为15μm的crrna0.4μl、浓度为10μm的cas12a1μl、浓度为10μm的报告探针1μl、1×缓冲液buffer2.127.6μl，置于37℃恒温荧光检测仪中孵育10min后，加入sars-cov-2基因组dna为模板进行crispr-cas12a检测，检测时间为30min，获得检测结果；
(2)对荧光信号进行分析，判断样品中是否含有sars-cov-2变异株病毒核酸。检测到荧光信号，判定为阳性，说明存在该对应变异株新型冠状病毒的核酸。
本发明提供的sars-cov-2病毒的crrna、探针与hiv-1病毒、丙型肝炎病毒以及乙型肝炎病毒无交叉反应，特异性强。
本发明检测体系鉴别不同sars-cov-2变异株基因，无需通过病毒基因组测序，只需在37℃条件下利用不同流行株特异crrna进行crispr-cas12a检测，30分钟内可以实现不同sars-cov-2变异株的鉴别。
此外，该用于检测sars-cov-2变异株的crispr-cas12a检测体系，还可采用crispr-cas12a检测方法结合pcr扩增检测sars-cov-2变异株，以待测样品基因组dna为模板，利用特异性引物组、特异crrna以及探针，进行sars-cov-2变异株检测，根据荧光信号判定结果。
本实施例的crispr-cas12a检测体系可作为鉴别sars-cov-2变异株的试剂盒方面的用途。
本发明针对sars-cov-2的变异株和亚型，通过设计特异性crrna，用于检测sars-cov-2的变异株和亚型，可以实现sars-cov-2常见变异株和亚型的快速检测和诊断。通过crispr-cas12a检测特定sars-cov-2基因组dna技术可以准确地检测出sars-cov-2变异株。相较于目前基于病毒基因测序鉴别sars-cov-2变异株和亚型，本发明在鉴别sars-cov-2变异株和亚型方面不需要依赖昂贵的仪器和专业的技术人员，能够大大缩短了检测时间，具有高特异性、高灵敏度、快速高效、操作简便、结果易读等优点。
实施例3。
利用本发明的crispr-cas12a检测方法对sars-cov-2-orf8-l型/s型进行鉴别。
本实施例用于检测sars-cov-2变异株的crispr-cas12a检测体系，含有sars-cov-2特异性crrna、通用探针、无核酶水、buffer2.1。缓冲液buffer2.1(newenglandbiolabs,ipswich，m0653t)、无核酶水(艾科瑞生物，ag11012)。crrna(擎科生物技术有限公司合成)使用浓度为15μm、cas12a(newenglandbiolabs,ipswich，m0653t)使用浓度为10μm、探针(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)使用浓度为10μm、1×缓冲液buffer2.1。
crrna以及探针序列如下：
orf8-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagaccuuuuacaauuaauugcca-3’(seqidno.1)
探针序列：5’-ttatt-3’(seqidno.14)
委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成sars-cov-2-orf8-s型dna质粒(seqidno.17)、sars-cov-2-orf8-l型(seqidno.18)，质粒大小均为366bp；将合成的质粒用紫外分光光度计进行浓度测定，计算拷贝数后，稀释为1.0×1010拷贝/μl待用。
实施方法：(1)按crisper检测体系：1μl的cas12a，0.4μl的orf8-crrna(seqidno.1)，1μl的通用探针(seqidno.14)与27.6μl的缓冲液buffer2.1配制5个反应单元。
(2)检测仪器采用无锡奇天仪器生产的恒温荧光检测仪raa-f1620，将以上两仪器接通电源进行预热。
(3)配制crispr-cas12a检测体系，取138μl的1×buffer2.1加入预先准备好的1.5mlep管，再加入5μl的cas12a、2μl的orf8-crrna(seqidno.1)和5μl的报告探针(seqidno.14)，充分混匀，分装为5个30ul的反应单元，置于37℃恒温荧光检测仪中孵育10min。
(5)加样反应:在以上5个配制好的反应单元分别加入浓度为1.0×1010拷贝/μl的sars-cov-2-orf8-l型质粒dna1μl、浓度为1.0×1010拷贝/ul的sars-cov-2-orf8-s型质粒dna1μl、阴性质控品(无核酶水)1μl、浓度为1010拷贝/μl的人类免疫缺陷病毒1型全长dna质粒1μl、浓度为1010拷贝μl的丙型肝炎病毒全长dna质粒1μl，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为31μl。将反应管置于raa-f1620荧光检测仪中，设定反应温度为37℃，反应时间20分钟。根据raa-f1620检测仪器中的阳性判定方法，有荧光信号增长的判定为阳性；无荧光信号增长判定为阴性。
(6)上述实验重复三次。
(7)检测结果如图1所示。结果显示本发明的crispr-cas12a方法可以实现sars-cov-2-orf8-l型/s型的鉴别。
实施例4。
利用本发明的crispr-cas12a检测方法对sars-cov-2进行s蛋白变异株的鉴别。
本实施例提供的crispr-cas12a检测sars-cov-2的组合物中，含有sars-cov-2特异性crrna、通用探针、buffer2.1。
探针与实施例1相同，crrna序列如下：
s-l5f-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagauuuuauugccacuagucucu-3’(seqidno2)；
s-d80a-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagacuaacccuguccuaccauuu-3’(seqidno.3)；
s-d215g-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagagugcguggucucccucaggg-3’(seqidno.4)；
s-r246i-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagacauauaaguuauuugacucc-3’(seqidno.5)；
s-y453f-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagagauuguuuaggaagucuaau-3’(seqidno.6)；
s-n501y-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagacaacccacuaaugguguugg-3’(seqidno.7)；
s-a570d-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagagcagagacauugaugacacu-3’(seqidno.8)；
s-d614g-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagaucaggacguuaacugcacag-3’(seqidno.9)；
s-a701v-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagauacaccaagugacauagugu-3’(seqidno.10)；
s-t716i-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagaauggguauggcaauagaguu-3’(seqidno.11)；
s-s982a-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagaacgucuugacaaaguugagg-3’(seqidno.12)；
s-p1263l-crrna:5’-uaauuucuacuaaguguagaagcacuagcucagagucguc-3’(seqidno.13)。
以sars-cov-2s蛋白变异株s-n501y为例具体说明。
委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成sars-cov-2-s蛋白野生型dna质粒(seqidno.15)、sars-cov-2-s蛋白突变型dna质粒(seqidno.16)，质粒大小均为3822bp；将合成的质粒用紫外分光光度计进行浓度测定，计算拷贝数后，稀释为1.0×1010拷贝/μl待用。
实施方法：
(1)按crispr-cas12a检测体系：1μl的cas12a，0.4μl的crrna(seqidno.7)，1μl的通用探针(seqidno.14)与27.6ul的缓冲液buffer2.1配制3个反应单元。
(2)检测仪器采用无锡奇天仪器生产的恒温荧光检测仪raa-f1620，将以上两仪器接通电源进行预热。
(3)配制crispr-cas12a检测体系，取82.8μl的1×buffer2.1加入预先准备好的1.5mlep管，再加入3μl的cas12a、3μl的报告探针(seqidno.14)以及1.2ul的s-n501y-crrna(seqidno.7)，充分混匀，分装为3个30ul的反应单元，置于37℃恒温荧光检测仪中孵育10min。
(4)加样反应:在以上3个配制好的反应单元分别加入1.0×1010拷贝/ul的sars-cov-2-s蛋白野生型dna1μl、1.0×1010拷贝/μlsars-cov-2-s蛋白突变型dna1μl、阴性质控品(无核酶水)1μl，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为31μl。将反应管置于raa-f1620荧光检测仪中，设定反应温度为37℃，反应时间30分钟。根据raa-f1620检测仪器中的阳性判定方法，有荧光信号增长的判定为阳性；无荧光信号增长判定为阴性。
(5)上述实验重复三次。
(6)其余针对s-l5f-crrna、s-d80a-crrna、s-d215g-crrna、s-r246i-crrna、s-y453f-crrna、s-a570d-crrna、s-d614g-crrna、s-a701v-crrna、s-t716i–crrna、s-s982a-crrna、s-p1263l-crrna等变异位点的鉴别体系和步骤均和上述实施例一致。
(7)检测结果如图2、图3、图4所示。结果显示本发明的crispr-cas12a方法可以实现sars-cov-2s蛋白变异株的鉴别。
实施例5。
利用本发明的crispr-cas12a检测方法结合pcr扩增检测sars-cov-2-orf8-l型变异株
本实施例提供的crispr-cas12a结合pcr扩增检测sars-cov-2的组合物中，含有sars-cov-2特异性引物、crrna、通用探针、buffer2.1。
探针和crrna均与实施例1相同，引物序列如下：
orf8上游引物:5’-aggaatcatcacaactgtagc-3’(seqidno.19)；
orf8下游引物:5’-aggaatcatcacaactgtagc-3’(seqidno.20)。
委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成sars-cov-2-orf8-l型(seqidno.18)，质粒大小为366bp；将合成的质粒用紫外分光光度计进行浓度测定，计算拷贝数后，稀释为工作标准品，标准品1-10分别含有1.0×101-1.0×1010拷贝/μl的sars-cov-2-orf8-l型dna质粒。
实施方法：
按pcr扩增体系：
(1)25μl的2xapexhffspcrmastermix(艾科瑞生物，ag12202)，1μl的orf8上游引物，1μl的orf8下游引物与21ul的无核酶水配制pcr反应单元11个，第1-10个pcr反应单元分别加入2ul的工作标准品1-10，第11个pcr反应单元加入样品为2ul的无核酶水。
(2)pcr扩增反应采用普通的pcr仪均可，反应参数设置为预变性94℃30秒、变性98℃10秒、退火55℃15秒、延伸72℃30秒，变性-延伸-退火30个循环。
(3)按crispr-cas12a检测体系：1μl的cas12a，0.4μl的orf8-crrna(seqidno.1)，1μl的通用探针(seqidno.14)与27.6ul的缓冲液buffer2.1配制22个反应单元。
(4)检测仪器采用无锡奇天仪器生产的恒温荧光检测仪raa-f1620，将以上两仪器接通电源进行预热。
(5)配制crispr-cas12a检测体系，取607.2μl的1×buffer2.1加入预先准备好的1.5mlep管，再加入22μl的cas12a、22μl的报告探针(seqidno.14)以及8.8ul的orf8-crrna(seqidno.1)，充分混匀，分装为22个30ul的检测反应单元，置于37℃恒温荧光检测仪中孵育10min。
(6)加样反应:在以上1-11个配制好的检测反应单元加入样品分别为1ul的1-11pcr反应单元产物，在以上12-22个配制好的检测反应单元加入样品分别为1ul的工作标准品1-10以及1ul的无核酶水，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个检测反应管总体积为31μl。将反应管置于raa-f1620荧光检测仪中，设定反应温度为37℃，反应时间30分钟。根据raa-f1620检测仪器中的阳性判定方法，有荧光信号增长的判定为阳性；无荧光信号增长判定为阴性。
(7)上述实验重复三次。
(8)检测结果如图5所示。结果显示本发明的crispr-cas12a方法可以实现sars-cov-2-orf8-l型dna质粒的检测，检测限为1010拷贝/μl，而crispr-cas12a结合pcr扩增可以实现sars-cov-2-orf8-l型dna质粒的检测，检测限为101拷贝/μl。
本发明通过crispr-cas12a检测特定sars-cov-2基因组dna技术可以准确地检测出sars-cov-2变异株。相较于目前基于病毒基因测序鉴别sars-cov-2变异株和亚型，本发明在鉴别sars-cov-2变异株和亚型方面不需要依赖昂贵的仪器和专业的技术人员，能够大大缩短了检测时间，具有高特异性、高灵敏度、快速高效、操作简便、结果易读等优点。
实施例6。
利用本发明的crispr-cas12a检测方法结合pcr扩增对sars-cov-2进行s蛋白变异株的鉴别报告探针与实施例1相同，crrna与实施例2相同。
本实施例提供的crispr-cas12a结合pcr扩增检测sars-cov-2的组合物中，含有sars-cov-2特异性引物、crrna、通用探针、buffer2.1。
引物序列如下：
orf8上游引物:5’-aggaatcatcacaactgtagc-3’(seqidno.19)；
orf8下游引物:5’-aggaatcatcacaactgtagc-3’(seqidno.20)；
s基因-1上游引物5’-ctagtgatgttcttgtt-3’(seqidno.21)；
s基因-1下游引物5’-tgcacagtctacagcatc-3’(seqidno.22)；
s基因-2上游引物5’-acttgtgcccttttggtgaag-3’(seqidno.23)；
s基因-2下游引物5’-gctattccagttaaagcacggt-3’(seqidno.24)；
s基因-3上游引物5’-agactcactttcttccacagcaa-3’(seqidno.25)；
s基因-3下游引物5’-gtatcgttgcagtagcgcga-3’(seqidno.26)。
以sars-cov-2s蛋白变异株s-y453f为例具体说明。
委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成sars-cov-2-s蛋白野生型dna质粒(seqidno.15)、sars-cov-2-s蛋白突变型dna质粒(seqidno.16)，质粒大小均为3822bp；将合成的质粒用紫外分光光度计进行浓度测定，计算拷贝数后，稀释为工作标准品，标准品1-9分别含有1.0×101-1.0×109拷贝/μl的蛋白野生型dna质粒、标准品10-18分别含有1.0×101-1.0×109拷贝/μl的sars-cov-2-s蛋白突变型dna质粒。
实施方法：
按pcr扩增体系：
(1)25μl的2xapexhffspcrmastermix，1μl的s基因-2上游引物(seqidno.23)，1μl的s基因-2下游引物(seqidno.24)与21ul的无核酶水配制pcr反应单元20个，第10、20个pcr反应单元加入样品为2ul的无核酶水，第1-9个pcr反应单元加入样品分别为2ul的工作标准品1-9，第11-19个pcr单元加入样品分别为2ul的工作标准品10-18。
(2)pcr扩增反应采用普通的pcr仪均可，反应参数设置为预变性94℃30秒、变性98℃10秒、退火55℃15秒、延伸72℃30秒，变性-延伸-退火30个循环。
(3)按crispr-cas12a检测体系：1μl的cas12a，0.4μl的s-y453f-crrna(seqidno.6)，1μl的通用探针(seqidno.14)与27.6ul的缓冲液buffer2.1配制20个反应单元。
(4)检测仪器采用无锡奇天仪器生产的恒温荧光检测仪raa-f1620，将以上两仪器接通电源进行预热。
(5)配制crispr-cas12a检测体系，取552μl的1×buffer2.1加入预先准备好的1.5mlep管，再加入20μl的cas12a、20μl的报告探针(seqidno.14)以及8ul的s-y453f-crrna(seqidno.6)，充分混匀，分装为20个30ul的检测反应单元，置于37℃恒温荧光检测仪中孵育10min。
(6)加样反应:在以上20个配制好的检测反应单元加入样品分别为1ul的1-20pcr反应单元的产物，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个检测反应管总体积为31μl。将反应管置于raa-f1620荧光检测仪中，设定反应温度为37℃，反应时间30分钟。根据raa-f1620检测仪器中的阳性判定方法，有荧光信号增长的判定为阳性；无荧光信号增长判定为阴性。
(7)上述实验重复三次。
(8)检测结果如图6、图7、图8所示。结果显示本发明的crispr-cas12a方法结合pcr扩增可以实现sars-cov-2s蛋白变异株s-y453f的检测，检测限为102拷贝/μl。
(9)其余针对s-l5f-crrna、s-d80a-crrna、s-d215g-crrna、s-r246i-crrna、s-a570d-crrna、s-d614g-crrna、s-a701v-crrna、s-t716i–crrna、s-s982a-crrna、s-p1263l-crrna等变异位点的鉴别体系和步骤均和上述实施例一致，其中s-l5f-crrna、s-d80a-crrna、s-d215g-crrna、s-r246i-crrna所使用的特异性pcr扩增引物为s基因-1上游引物(seqidno.21)、s基因-1下游引物(seqidno.22)，s-a570d-crrna、s-d614g-crrna、s-a701v-crrna、s-t716i–crrna所使用的特异性pcr扩增引物为s基因-2上游引物(seqidno.23)、s基因-2下游引物(seqidno.24)，s-s982a-crrna、s-p1263l-crrna所使用的特异性pcr扩增引物为s基因-3上游引物(seqidno.25)、s基因-3下游引物(seqidno.26)。
本发明通过crispr-cas12a检测特定sars-cov-2基因组dna技术可以准确地检测出sars-cov-2变异株。相较于目前基于病毒基因测序鉴别sars-cov-2变异株和亚型，本发明在鉴别sars-cov-2变异株和亚型方面不需要依赖昂贵的仪器和专业的技术人员，能够大大缩短了检测时间，具有高特异性、高灵敏度、快速高效、操作简便、结果易读等优点。
实施例7。
利用本发明的crispr-cas12a检测方法，设计带有pam序列的pcr引物，结合pcr扩增对sars-cov-2进行k417n、l452r、e484q变异株的鉴别。报告探针与实施例1相同。
本实施例提供的crispr-cas12a结合pcr扩增检测sars-cov-2的组合物中，含有sars-cov-2特异性引物、crrna、通用探针、buffer2.1。
引物序列如下：
k417n-上游引物:5’-atcgctccagggcaaatttgaaa-3’(seqidno.27)；
k417n-下游引物:5’-gctattccagttaaagcacggt-3’(seqidno.28)；
l452r-上游引物5’-aggttggtggtaattatatttac-3’(seqidno.29)；
l452r/e484q-下游引物5’-agtactactactctgtatggttggt-3’(seqidno.30)；
e484q-上游引物5’-agcacaccttttaatggtgtt-3’(seqidno.31)；
s-k417n-crrna5’-uaauuucuacuaaguguagaaacgauugcugauuauaauu-3’(seqidno.32)；
s-l452r-crrna5’-uaauuucuacuaaguguagaccgauauagauuguuuagga-3’(seqidno.33)；
s-e484q-crrna5’-uaauuucuacuaaguguagaaaugguguacaagguuuuaa-3’(seqidno.34)。
以sars-cov-2s-蛋白变异株k417n为例具体说明。
委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成sars-cov-2-s蛋白野生型dna质粒(seqidno.15)、sars-cov-2-s蛋白突变型dna质粒(seqidno.16)，质粒大小均为3822bp；将合成的质粒用紫外分光光度计进行浓度测定，计算拷贝数后，稀释为工作标准品，标准品1-9分别含有1.0×101-1.0×109拷贝/μl的蛋白野生型dna质粒(seqidno.15).、标准品10-18分别含有1.0×101-1.0×109拷贝/μl的sars-cov-2-s蛋白突变型dna质粒(seqidno.16))。设计的带有pam位点的引物分别为k417n-上游引物(第17位碱基由c突变为t,第19位碱基由g突变为t)、l452r-上游引物(第19位碱基a突变为t)、e484q-上游引物(第11位碱基由g突变为t)。
实施方法：
按pcr扩增体系：
(1)25μl的2xapexhffspcrmastermix，1μl的k417n-上游引物(seqidno.27)，1μl的k417n-下游引物(seqidno.28)与21ul的无核酶水配制pcr反应单元20个，第10、20个pcr反应单元加入样品为2ul的无核酶水，第1-9个pcr反应单元加入样品分别为2ul的工作标准品1-9，第11-19个pcr单元加入样品分别为2ul的工作标准品10-18。
(2)pcr扩增反应采用普通的pcr仪均可，反应参数设置为预变性94℃30秒、变性98℃10秒、退火55℃15秒、延伸72℃30秒，变性-延伸-退火30个循环。
(3)按crispr-cas12a检测体系：1μl的cas12a，0.4μl的s-k417n-crrna(seqidno.32)，1μl的通用探针(seqidno.14)与27.6ul的缓冲液buffer2.1配制20个反应单元。
(4)检测仪器采用无锡奇天仪器生产的恒温荧光检测仪raa-f1620，将以上两仪器接通电源进行预热。
(5)配制crispr-cas12a检测体系，取552μl的1×buffer2.1加入预先准备好的1.5mlep管，再加入20μl的cas12a、20μl的报告探针(seqidno.14)以及8ul的s-k417n-crrna(seqidno.32)，充分混匀，分装为20个30ul的检测反应单元，置于37℃恒温荧光检测仪中孵育10min。
(6)加样反应:在以上20个配制好的检测反应单元加入样品分别为1ul的1-20pcr反应单元的产物，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个检测反应管总体积为31μl。将反应管置于raa-f1620荧光检测仪中，设定反应温度为37℃，反应时间30分钟。根据raa-f1620检测仪器中的阳性判定方法，有荧光信号增长的判定为阳性；无荧光信号增长判定为阴性。
(7)上述实验重复三次。
(8)检测结果如图9所示。结果显示本发明的crispr-cas12a方法结合pcr扩增可以实现sars-cov-2s蛋白变异株s-k417n的检测，检测限为102拷贝/μl。
(9)其余针对s-l452r、s-e484q变异位点的鉴别体系和步骤均和上述实施例一致，所使用的带有pam位点的特异性pcr扩增引物分别为l452r-上游引物(seqidno.29)、l452r/e484q-下游引物(seqidno.30)、e484q-上游引物(seqidno.31)、l452r/e484q-下游引物(seqidno.30)。
本发明通过crispr-cas12a检测特定sars-cov-2基因组dna技术可以准确地检测出sars-cov-2变异株。相较于目前基于病毒基因测序鉴别sars-cov-2变异株和亚型，本发明在鉴别sars-cov-2变异株和亚型方面不需要依赖昂贵的仪器和专业的技术人员，能够大大缩短了检测时间，具有高特异性、高灵敏度、快速高效、操作简便、结果易读等优点。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110>南方医科大学
<120>检测新型冠状病毒变异株和亚型的方法
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