一种密码子优化的斑马鱼g型溶菌酶-1基因及其重组表达蛋白

一种密码子优化的斑马鱼g型溶菌酶
‑
1基因及其重组表达蛋白
技术领域
1.本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体涉及一种密码子优化的斑马鱼g型溶菌酶
‑
1基因及其重组表达蛋白。


背景技术：

2.溶菌酶（lysozyme）又称n
‑
乙酰胞壁酸水解酶，可通过破坏细胞壁中肽聚糖的1,4
‑
糖苷键来消灭病原微生物。它最早于1907年在枯草芽孢杆菌中被发现，1937年溶菌酶晶体首次被分离制备出来。根据来源、结构和理化性质不同，可将溶菌酶分成鸡蛋清溶菌酶（chicken
‑
type lysozyme，c型），鹅溶菌酶（goose
‑
type lysozyme，g型），无脊椎动物溶菌酶（invertebrate
‑
type lysozyme，i型）、细菌溶菌酶，植物溶菌酶和噬菌体溶菌酶（p型）6种类型，其中，c型、g 型和i 型溶菌酶属于动物性溶菌酶，广泛存在于动物的免疫器官、免疫细胞中。
3.溶菌酶作为鱼类重要的非特异性免疫因子，与鱼类抵御细菌感染的免疫功能密切相关。它可诱导硬骨鱼类的特异性和非特异性免疫应答，提高机体免疫力，具有抗菌、抗病毒和抗炎症的特性，是一种天然的内源性抗生素。鱼类溶菌酶主要有c型和g型两种类型，在多数鱼类体内同时存在，如牙鲆、草鱼和大菱鲆等。
[0004] 斑马鱼（danio rerio）因其清晰的遗传背景和完整的全基因组序列，成为脊椎动物研究中应用最广泛的模式动物之一；不同种类病原菌均能感染成年斑马鱼及其胚胎，使其成为研究鱼类病原菌感染后免疫应答的模式生物。研究表明，斑马鱼存在c型和g型溶菌酶，在抵御创伤弧菌过程中可能发挥重要作用，但两种溶菌酶对细菌的应激响应能力以及作用未知。


技术实现要素：

[0005]
本发明目的在于针对动物养殖过程中抗生素的滥用易导致抗药性，亟待开发环境友好型抗生素替代物的现状，根据现有技术的不足，提供一种通过密码子优化，获得大量高溶菌活性斑马鱼g型溶菌酶的方法。
[0006]
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种密码子优化的斑马鱼g型溶菌酶
‑
1基因，所述斑马鱼g型溶菌酶
‑
1基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0007]
一种密码子优化的斑马鱼g型溶菌酶
‑
1重组表达蛋白，所述重组表达蛋白由上述一种密码子优化的斑马鱼g型溶菌酶
‑
1基因编码，其氨基酸序列如seq id no.3所示。
[0008]
一种携带上述密码子优化的斑马鱼g型溶菌酶
‑
1基因的重组质粒。
[0009]
优选的，一种携带上述密码子优化的斑马鱼g型溶菌酶
‑
1基因的重组质粒，将密码子优化的斑马鱼g型溶菌酶
‑
1基因连接至表达载体pet
‑
28a(+)，获得重组质粒28a
‑
lys
‑
g1。
[0010]
进一步的，一种密码子优化的斑马鱼g型溶菌酶
‑
1重组表达蛋白的制备方法，包括
以下具体步骤：斑马鱼g型溶菌酶
‑
1基因，通过优化密码子获得密码子优化的斑马鱼g型溶菌酶
‑
1基因，全基因合成密码子优化的斑马鱼g型溶菌酶
‑
1基因，克隆至表达载体pet
‑
28a(+)，获得重组质粒28a
‑
lys
‑
g1，热激法转入bl21（de3）感受态细胞，挑取单菌落到含有50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中培养，当od
600
值达到0.6时，在iptg终浓度为0.5mm，20
°
c条件下诱导培养16 h；离心收集菌体，加入咪唑缓冲液重悬，用超声破碎仪破碎，收集上清；取5 ml ni
‑
nta，用5倍柱床体积的binding buffer清洗平衡柱子，流速为5 ml/min；将上清与平衡后的柱填料孵育1 h，然后上柱；先用尿素缓冲液清洗平衡柱子，再用含尿素的咪唑缓冲液洗柱子并洗脱，收集流出液；对纯化的蛋白进行透析、浓缩，经0.45μm滤膜过滤后分装，
‑
80 ℃保存备用；对纯化后的蛋白进行sds
‑
page验证和溶菌活性测定验证，获得高溶菌活性的重组蛋白zeb
‑
lys
‑
g1。
[0011]
经蛋白复性，上述重组蛋白zeb
‑
lys
‑
g1的酶活为689.68 u/mg。
[0012]
本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明所述的斑马鱼g型溶菌酶
‑
1基因根据大肠杆菌密码子的偏好性，对斑马鱼g型溶菌酶
‑
1基因序列进行密码子优化及信号肽的去除，采用全基因合成的方式合成基因，克隆到表达载体pet
‑
28a(+)，转化大肠杆菌感受态细胞，通过优选获得的蛋白诱导表达的条件为：iptg终浓度0.5mm，20
°
c条件下诱导培养16 h，通过蛋白纯化、复性，经sds
‑
page验证和溶菌活性测定，获得高纯度、高溶菌活性的斑马鱼g型溶菌酶
‑
1重组蛋白，为斑马鱼g型溶菌酶基因的抑菌功能研究及其开发应用奠定基础。
附图说明
[0013]
图1为本发明优化的斑马鱼g型溶菌酶
‑
1基因和原始斑马鱼g型溶菌酶
‑
1基因的序列比对图。
[0014]
图2为重组质粒的酶切鉴定。其中，m为dna marker，1为表达质粒28a
‑
zeb
‑
lys
‑
g1。
[0015]
图3为sds
‑
page分析回收的纯化蛋白。其中，m为protein marker，1为目的蛋白zeb
‑
lys
‑
g1。
具体实施方式
[0016]
以下结合具体实施例并配合附图对本发明作进一步详细描述。
[0017]
实施例1
ꢀꢀ
斑马鱼g型溶菌酶
‑
1基因的密码子优化和表达载体构建从genbank数据库中获得斑马鱼g型溶菌酶
‑
1基因的开放阅读框序列(登录号：nm_001002706.1)，如seq id no.1所示。首先对该序列进行信号肽分析，去除seq id no.1序列中的信号肽序列atgggcattccggtgatacttaccatgtattttctagcatgcatttatgga。依据大肠杆菌的密码子偏好性和避免重复序列的原则，在不改变氨基酸序列的前提下，利用密码子优化软件对该基因序列进行密码子优化（图1），并在序列的5'端加入了bam hi酶切位点，在3'端加入了xhoi酶切位点。密码子优化的斑马鱼g型溶菌酶
‑
1基因核苷酸序列如seq id no.2所示，其编码的氨基酸序列如seq id no.3所示。
[0018]
seq id no.2：gatatcatgaagatcgacaccacgggtgcaagcgaagtaacggcaaagcaagacaagctg
ꢀꢀ
60accgtaaagggtgtcgaagcaagcaaaaaactggctgagcacgacctggcacgtatggaa
ꢀꢀ
120
caatacaaatccaaaatcctgaaagtcgcccgtgccaaacagatggacccagctgttatc
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180gctgcaatcatctcccgtgaatcccgtgctggtgctgctctgaaagatggttggggtgat
ꢀꢀ
240catggtaatggtttcggtctgatgcaggttgataaacgctaccacaaactggtgggtgcg
ꢀꢀ
300tgggattctgaagaacacctgactcagggtactgaaatcctgattggctacattaaagac
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360attaaagcgaaattcccgacctggaccaaagagcagtgcttcaaaggcggcatttctgcg
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420tacaacgcgggcgtgaaaaacgtgcagacctacgaacgcatggacgttggcactaccggc
ꢀꢀ
480ggcgattatgcgaacgacgttgttgcgcgtgcccagtggtttaaatctaaaggctattaa
ꢀꢀ
540其中，斜体加粗部分表示斑马鱼g型溶菌酶
‑
1基因按照大肠杆菌偏好密码子进行设计优化后的密码子。
[0019]
密码子优化的斑马鱼g型溶菌酶
‑
1基因和用于该基因扩增的引物对（见表1）由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0020]
表1用于扩增密码子优化的斑马鱼g型溶菌酶
‑
1基因的引物对以合成的基因序列为模板，用上述合成的引物进行pcr扩增，纯化回收扩增产物，利用bam hi/xhoi将扩增产物和表达载体pet
‑
28a(+)进行双酶切，酶切后的片段采用琼脂糖凝胶电泳分离，分别割胶回收目的条带，利用t4连接酶连接后，转化大肠杆菌top10感受态细胞，筛选出阳性克隆提取质粒，出现与预期大小一致的特异性条带，表明成功构建表达质粒（图2），将酶切验证的质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司进一步测序验证，并命名为重组质粒28a
‑
lys
‑
g1。
[0021]
实施例2
ꢀꢀ
斑马鱼g型溶菌酶
‑
1基因的表达和纯化 通过热激法将重组质粒28a
‑
lys
‑
g1转入bl21（de3）感受态细胞，挑取单菌落到含有50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中培养，当od
600
值达到0.6时，加iptg至终浓度为0.5mm，于20
°
c条件下诱导培养16 h。离心收集菌体，加入咪唑缓冲液重悬，用超声破碎仪破碎，收集上清。取5 ml ni
‑
nta，用5倍柱床体积的binding buffer清洗平衡柱子，流速为5 ml/min。将上清与平衡后的柱填料孵育1 h，然后上柱。先用尿素缓冲液清洗平衡柱子，再用含尿素的咪唑缓冲液洗柱子并洗脱，收集流出液。对纯化的蛋白进行透析、浓缩，经0.45μm滤膜过滤后分装，
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80 ℃保存备用。对纯化后的蛋白进行sds
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page验证，在24.2kda处出现单一的条带，表明获得了较纯的zeb
‑
lys
‑
g1蛋白，结果如图3所示。
[0022]
实施例3
ꢀꢀ
斑马鱼g型溶菌酶
‑
1重组表达蛋白浓度的测定及活性检测采用非干扰型蛋白质浓度测定试剂盒（生工生物工程(上海)股份有限公司）测定纯化的斑马鱼g型溶菌酶
‑
1重组蛋白浓度。首先取12支1.5 ml的离心管，每两管为相同编号，分别在不同编号的离心管中加入0、4、8、12、20、25 μl的bsa标准蛋白溶液（2 mg/ml），相同编号的离心管加入相同体积的蛋白质标准溶液。接着另取两支1.5 ml的离心管，分别加入10 μl的重组蛋白溶液。在以上14支试管中分别加入0.5 ml的沉淀试剂一，涡旋振荡30 sec，在室温下放置2
‑
3 min。再分别加入0.5 ml的沉淀试剂二，涡旋振荡30 sec。转置冷冻
离心机中于4
°
c，13000 rpm离心15 min。将试管从离心机上取出，用枪头尽可能去除上清，保留沉淀，再将试管倒置在滤纸上，以便让试管中的残液流干。分别加入100 μl的铜试剂和400 μl的双蒸水，涡旋振荡30 sec，直到蛋白质沉淀团块完全溶解。再加入1 ml的生色试剂混合液，颠倒试管混匀几次。转移1.5 ml离心管中250 μl混合液到相应的96孔酶标板的各孔中，利用酶标仪测定a
480
波长处的吸收值。以相同编号的离心管吸收值的平均值为纵坐标，对应的bsa蛋白量为横坐标，绘制bsa标准曲线。再根据标准曲线和所测重组蛋白溶液的a
480
吸收值的平均值，计算斑马鱼g型溶菌酶
‑
1重组蛋白的浓度。通过绘制标准曲线，得到的线性关系为：y=
‑
217.91x+193.24，相关系数r2为0.9913，表明它们之间有较好的线性关系。据此，我们计算出了重组蛋白zeb
‑
lys
‑
g1的浓度为1.01mg/ml。结果如表2所示：表2测定的a
480
吸收值 采用溶菌酶（lzm）测定试剂盒（购自南京建成科技有限公司）中的比浊法测定经蛋白复性的重组蛋白zeb
‑
lys
‑
g1的溶菌活性。取4个离心管分别加入30μl的双蒸水、溶菌酶标准应用液和经复性的重组蛋白zeb
‑
lys
‑
g1，再往各管中加入300 μl的应用菌液，混匀后置于37℃水浴中预温15 min，立即取出置于0℃以下的冰水浴中3 min，然后逐管取出加入96孔板中，测定各管530nm处的透光度t
15
，从而计算出重组蛋白zeb
‑
lys
‑
g1的酶活为689.68 u/mg。
[0023]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括
……”
或“包含
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。
[0024]
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以
上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。