本发明涉及生物
技术领域：
：，具体是一种间充质干细胞的分离和培养方法及制剂。
背景技术：
：：骨关节炎为中老年常见病，骨关节炎严重降低了老年人的生活质量，同时也给社会经济医疗保健带来沉重的负担，研究骨关节炎的治疗方法已成为解决我国民生大计的重要内容之一。骨关节炎（osteoarthritis，oa）是一种以关节软骨的磨损、破坏、丢失，并伴有关节周围骨质增生的一种退行性疾病，主要表现为关节疼痛及功能障碍，目前的治疗手段仅起到缓解的效果，不能有效逆转其进展。研究发现，oa患者滑膜中广泛分布着表达间充质干细胞(mesenchymalstemcells，mscs)标志物的细胞，而在健康关节滑膜中这种细胞仅分布在衬里层。已证实，滑膜间充质干细胞（synovium-derivedmesenchymalstemcells，smscs）除具有mscs的共性外，相比其他来源的mscs有更好的成软骨分化能力，以及更强的集落形成和扩增能力。此外，滑膜组织具有很强的自我修复能力，即便受到一定的手术创伤或化学损伤，滑膜组织也能够完全恢复，且不会对关节的正常结构和功能等产生十分明显的影响。所以，利用smscs治疗oa，采集标本时，以不损伤患者关节正常结构和功能为前提，可以在微创手术（关节镜）过程中获得所需的滑膜组织。动物来源（包括大鼠滑膜和兔滑膜等）的smscs已应用于同种异体组织工程动物模型的实验研究中，在动物软骨缺损最深层，smscs分化为骨细胞，次深层分化为肥大的软骨细胞，且新生组织与固有软骨融合良好，组织学评分逐渐升高；也有报道移植smscs后，smscs分泌了大量软骨基质，骨膜处的软骨祖细胞能分泌少量软骨基质。进一步研究发现滑膜间充质干细胞修复形成的组织是透明软骨而非纤维软骨，并且滑膜间充质干细胞更能适应关节内的微环境。说明smscs对于软骨损伤具有天然且有效的修复能力，是彻底根治oa的极为有效的理想选择，有必要对其进行提取制备及深入研究。目前对于smscs的研究很少，文献报道的分离提取smscs的方法不尽相同，也没有统一的分离制备标准，且现有分离提取smscs的方法存在培养周期长，产量低，所采用试剂较多等问题。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种间充质干细胞的分离和培养方法及制剂，以解决上述
背景技术：
：中提出的问题。为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：一种间充质干细胞的分离方法，其包括以下步骤：将滑膜组织剪碎，并置于完全培养基中后，再添加胶原酶溶液进行消化、震荡分散，得到沉降组织和第一上清液。将沉降组织置于完全培养基中进行震荡分散，得到上清液与第一上清液混合。将沉降组织再次置于完全培养基中进行震荡分散，得到上清液与上述上清液混合。对所得上清液进行过滤，得到滤液。将滤液进行离心处理，弃上清，得到原代间充质干细胞。作为本发明实施例的一个优选方案，所述胶原酶溶液的制备方法包括以下步骤：将胶原酶溶解于完全培养基中后，再经滤膜过滤，得到所述胶原酶溶液。作为本发明实施例的另一个优选方案，所述胶原酶溶液中，胶原酶的质量与完全培养基的体积的比值以g/ml计为(0.5~1.5):100。作为本发明实施例的另一个优选方案，所述完全培养基为添加有血清替代品和l-谷氨酰胺的lonza无血清培养基。作为本发明实施例的另一个优选方案，所述步骤中，过滤的方法为采用60~80μm的细胞滤网进行过滤。本发明实施例的另一目的在于提供一种间充质干细胞的培养方法，其包括以下步骤：将上述分离方法得到的细胞用原代培养基进行重悬后，再进行培养、换液，弃去未贴壁细胞；待原代细胞的融合度不低于60%时，将其进行传代培养，得到p1代细胞。待p1代细胞的融合度不低于80%时，将其进行传代培养，直至得到单一的梭形成纤维样的p3代细胞。作为本发明实施例的另一个优选方案，所述原代培养基包括完全培养基和青霉素-链霉素混合液；青霉素-链霉素混合液和完全培养基的体积比为1:100。作为本发明实施例的另一个优选方案，所述青霉素-链霉素混合液的浓度为10000单位/ml。作为本发明实施例的另一个优选方案，所述培养方法还包括以下步骤：取3d微载片作为培养的微载体。用胰酶替代物对p3代细胞进行消化，得到细胞悬液。将微载体置于完全培养基进行分散后，再添加悬液进行培养。培养结束后添加载体裂解液将细胞洗脱下来，收集液体，经离心得到3d扩增培养的间充质干细胞。其中，3d细胞培养技术既能保留体内细胞微环境的物质及结构基础，又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。3d支架为细胞提供类似体内生长环境的支架或基质，建立细胞间及细胞与胞外基质间的联系，促进细胞近似于体内的基因表达、基质分泌及细胞功能活动，对后续的研究和临床应用更有利。本发明实施例的另一目的在于提供一种上述培养方法得到的制剂。与现有技术相比，本发明实施例的有益效果是：本发明实施例提供了一种间充质干细胞的分离和培养方法，采用的试剂较少，避免了多种酶混合消化对细胞造成的多次损伤，另外，胶原酶使用含血清替代物的培养基配制，在组织间质被消化过程中血清能有效保护细胞的完整性，保证细胞活力。特别地，通过将2d培养与3d培养模式有机结合，不但纯化了细胞而且最大程度保留了细胞在体内环境下的特性，同时短时间内可获得足够数量的细胞，更有利于滑膜间充质干细胞的研究和临床应用。具体的，本发明相较于常规分离培养间充质干细胞的方法，优点在于：一是采用的试剂较少，避免了多种酶混合消化对细胞造成的多次损伤；二是胶原酶使用含血清替代物的培养基配制，先配置成高浓度母液，使用时再次用含血清替代物的培养基稀释成工作浓度，在组织间质被消化过程中血清能有效保护细胞的完整性，保证细胞活力；三是本方法在含血清替代物的环境中分离的滑膜间充质干细胞贴壁能力更强，贴壁率高；四是由于分离提取的细胞除滑膜间充质干细胞外还包括巨噬细胞样滑膜细胞，本方法能有效去除杂质细胞，更容易获得高纯度的滑膜间充质干细胞，且细胞生长状态均一，便于培养扩增；五是分离培养全过程均无动物源性成分，如无血清培养基、胰酶替代物、医药辅料级微载体，所以细胞安全性高，便于进行体内研究应用；六是培养中引入3d培养方式，促进细胞的贴附、散布、迁移、增殖和分化，不仅大大提高了细胞的产量，更增加了如ii型胶原、蛋白聚糖和软骨寡聚基质蛋白等基因的表达，使滑膜间充质干细胞更易向软骨分化；七是本方法分离和培养的滑膜间充质干细胞纯度高、活率高、活力强；八是本方法根据各阶段细胞培养的侧重点将2d培养与3d培养方式有机结合，充分发挥了不同细胞培养方式的优点，也最大限度保护和增强了细胞的特性。附图说明图1为实施例1培养至p4代的滑膜间充质干细胞72h生长形态（40×）。图2为实施例1培养至p4代的滑膜间充质干细胞的活率及计数结果图。图3为实施例1培养至p4代的滑膜间充质干细胞的流式检测图。图4为实施例1培养至p4代的滑膜间充质干细胞成脂诱导后行油红o染色图；镜下可见油滴染成红色（200×）。图5为实施例1培养至p4代的滑膜间充质干细胞成骨诱导后行茜素红染色图；镜下可见矿化结节染成红色（100×）。具体实施方式下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。另外，下述实施例中所涉及的设备和试剂未经特别注明的话，均可采用市售的设备和试剂。实施例1该实施例提供了一种间充质干细胞的分离和培养方法，其包括以下步骤：s1、在含磷酸缓冲盐溶液（phosphatebuffersaline，pbs）的10cm培养皿中，用眼科剪刀移除标本的脂肪和结缔组织，分离出平滑光亮的滑膜组织，接着，将滑膜组织移入另一个培养皿中，用pbs冲洗3次。s2、用组织剪将滑膜组织剪碎至1.5mm3，向15ml离心管中加入8ml完全培养基，称重m1，秤归零；接着，将滑膜组织碎块用镊子转移到上述加好培养基的离心管中，称量m2，计算标本净重m（净重=m2-m1）；然后，根据标本净重m，将2ml胶原酶溶液加入到滑膜组织中，37℃，120转，于摇床中消化2小时，期间震荡3次，待滑膜组织沉降下来后，得到沉降组织和第一上清液，将第一上清液转移到新的50ml离心管。其中，胶原酶溶液的制备方法包括以下步骤：将1g胶原酶溶解于100ml完全培养基中后，再经0.22μm滤膜过滤，得到胶原酶溶液母液，4℃保存备用；完全培养基的制备方法为：选取lonza通用型无血清培养基，按使用说明添加血清替代品及l-谷氨酰胺，即为完全培养基。s3、将上述沉降组织置于10ml新鲜的完全培养基中进行震荡分散，得到的上清液转移至上述步骤s2中含有第一上清液的50ml离心管中，并重复一次此步骤。s4、用70μm的细胞滤网过滤上清液，得到滤液，置于新的50ml离心管中。s5、将上述滤液以1500rpm速度进行离心处理5min，弃上清，即可得到原代细胞。s6、将上述分离方法得到的原代细胞用1ml原代培养基进行重悬后，接种到60mm的培养皿，并置于饱和湿度，37℃，5%co2条件下进行培养，24小时后换液，弃去未贴壁细胞，每3天换液一次；其中，原代培养基的制备方法为：往50ml的完全培养基中添加500μl青霉素-链霉素混合液（双抗）进行混合而得。s7、待原代细胞的融合度不低于60%时，将其按照4000个/cm2的接种密度进行传代培养，得到p1代细胞。s8、待p1代细胞的融合度不低于80%时，将其继续进行传代培养直至p3代细胞，此时，圆形巨噬样细胞几乎完全消失，得到单一的梭形成纤维样细胞。s9、采用3dtabletrix微载片tm作为培养的微载体，用0.25%胰酶替代物把p3代细胞消化下来制成细胞悬液，向50ml的叶轮搅拌培养瓶中先加入75ml完全培养基，再投入上述微载体，微载体遇水分散成数万微载体颗粒，待分散完全后，以0.9×105/片的密度接种上述细胞悬液，搅拌转速为50rpm，于37℃，5%co2条件下培养4天，再按照50ml/片加入载体裂解液将细胞洗脱下来，收集培养瓶中液体，并于1000rpm，5min离心洗涤2遍，即可获得3d扩增培养的间充质干细胞。实施例2该实施例提供了一种间充质干细胞的分离和培养方法，其包括以下步骤：s1、在含磷酸缓冲盐溶液（phosphatebuffersaline，pbs）的10cm培养皿中，用眼科剪刀移除标本的脂肪和结缔组织，分离出平滑光亮的滑膜组织，接着，将滑膜组织移入另一个培养皿中，用pbs冲洗3次。s2、用组织剪将滑膜组织剪碎至1mm3，向15ml离心管中加入7ml完全培养基，称重m1，秤归零；接着，将滑膜组织碎块用镊子转移到上述加好培养基的离心管中，称量m2，计算标本净重m（净重=m2-m1）；然后，根据标本净重m，将3ml胶原酶溶液加入到滑膜组织中，37℃，120转，于摇床中消化1小时，期间震荡3次，待滑膜组织沉降下来后，得到沉降组织和第一上清液，将第一上清液转移到新的50ml离心管。其中，胶原酶溶液的制备方法包括以下步骤：将1g胶原酶溶解于100ml完全培养基中后，再经0.22μm滤膜过滤，即可得到胶原酶溶液母液，4℃保存备用；完全培养基的制备方法为：选取lonza通用型无血清培养基，按使用说明添加血清替代品及l-谷氨酰胺，即为完全培养基。s3、将上述沉降组织置于10ml新鲜的完全培养基中进行震荡分散，得到的清液转移至上述步骤s2中含有第一上清液的50ml离心管中，并重复一次此步骤。s4、用60μm的细胞滤网过滤上清液，得到滤液，置于新的50ml离心管中。s5、将上述滤液以1500rpm速度进行离心处理5min，弃上清，即可得到原代细胞。s6、将上述分离方法得到的原代细胞用1ml原代培养基进行重悬后，接种到60mm的培养皿，并置于饱和湿度，37℃，5%co2条件下进行培养，24小时后换液，弃去未贴壁细胞，每3天换液一次；其中，原代培养基的制备方法为：往50ml的完全培养基中添加500μl青霉素-链霉素混合液（双抗）进行混合而得。s7、待原代细胞的融合度不低于60%时，将其按照3000个/cm2的接种密度进行传代培养，得到p1代细胞。s8、待p1代细胞的融合度不低于80%时，将其继续进行传代培养直至p3代细胞，此时，圆形巨噬样细胞几乎完全消失，得到单一的梭形成纤维样细胞。s9、采用3dtabletrix微载片tm作为培养的微载体，用0.25%胰酶替代物把p3代细胞消化下来制成细胞悬液，向50ml的叶轮搅拌培养瓶中先加入70ml完全培养基，再投入上述微载体，微载体遇水分散成数万微载体颗粒，待分散完全后，以0.8×105/片的密度接种上述细胞悬液，搅拌转速为40rpm，于37℃，5%co2条件下培养4天，再按照50ml/片加入载体裂解液将细胞洗脱下来，收集培养瓶中液体，并于1000rpm，5min离心洗涤2遍，即可获得3d扩增培养的间充质干细胞。实施例3该实施例提供了一种间充质干细胞的分离和培养方法，其包括以下步骤：s1、在含磷酸缓冲盐溶液（phosphatebuffersaline，pbs）的10cm培养皿中，用眼科剪刀移除标本的脂肪和结缔组织，分离出平滑光亮的滑膜组织，接着，将滑膜组织移入另一个培养皿中，用pbs冲洗3次。s2、用组织剪将滑膜组织剪碎至2mm3，向15ml离心管中加入9ml完全培养基，称重m1，秤归零；接着，将滑膜组织碎块用镊子转移到上述加好培养基的离心管中，称量m2，计算标本净重m（净重=m2-m1）；然后，根据标本净重m，将1ml胶原酶溶液加入到滑膜组织中，37℃，120转，于摇床中消化3小时，期间震荡3次，待滑膜组织沉降下来后，得到沉降组织和第一上清液，将第一上清液转移到新的50ml离心管。其中，胶原酶溶液的制备方法包括以下步骤：将1g胶原酶溶解于100ml完全培养基中后，再经0.22μm滤膜过滤，即可得到胶原酶溶液母液，4℃保存备用；完全培养基的制备方法为：选取lonza通用型无血清培养基，按使用说明添加血清替代品及l-谷氨酰胺，即为完全培养基。s3、将上述沉降组织置于10ml新鲜的完全培养基中进行震荡分散，得到的上清液转移至上述步骤s2中含有第一上清液的50ml离心管中，并重复一次此步骤。s4、用80μm的细胞滤网过滤上清液，得到滤液，置于新的50ml离心管中。s5、将上述滤液以1500rpm速度进行离心处理5min，弃上清，即可得到原代细胞。s6、将上述分离方法得到的原代细胞用1ml原代培养基进行重悬后，再接种到60mm的培养皿，并置于饱和湿度，37℃，5%co2条件下进行培养，24小时后换液，弃去未贴壁细胞，每3天换液一次；其中，原代培养基的制备方法为：往50ml的完全培养基中添加500μl青霉素-链霉素混合液（双抗）进行混合而得。s7、待原代细胞的融合度不低于60%时，将其按照5000个/cm2的接种密度进行传代培养，得到p1代细胞。s8、待p1代细胞的融合度不低于80%时，将其继续进行传代培养直至p3代细胞，此时，圆形巨噬样细胞几乎完全消失，得到单一的梭形成纤维样细胞。s9、采用3dtabletrix微载片tm作为培养的微载体，用0.25%胰酶替代物把p3代细胞消化下来制成细胞悬液，向50ml的叶轮搅拌培养瓶中先加入80ml完全培养基，再投入上述微载体，微载体遇水分散成数万微载体颗粒，待分散完全后，以1×105/片的密度接种上述细胞悬液，搅拌转速为60rpm，于37℃，5%co2条件下培养5天，再按照50ml/片加入载体裂解液将细胞洗脱下来，收集培养瓶中液体，并于1000rpm，5min离心洗涤2遍，即可获得3d扩增培养的间充质干细胞。实验例：1、将上述实施例1分离的间充质干细胞在倒置相差显微镜下观察，刚接种时，可见大量有核细胞，最早在接种后数小时即可见部分细胞贴壁，呈卵圆形。24h可见贴壁细胞增多，48~72h大部分贴壁细胞伸展，经换液可除去巨噬细胞样滑膜细胞，获得相对均一的成纤维样滑膜细胞，细胞呈长梭形，平行或漩涡状排列（如图1所示）。培养至第4代，细胞活率检测及计数结果显示：细胞成活率高且纯度也高（如图2的a和b所示），表明细胞生长旺盛，状态良好。2、目前研究表明滑膜间充质干细胞表达常见的间充质干细胞表面抗原cd105、cd90，更高表达cd44。cd44是透明质酸受体，具有促进成软骨分化的能力。因此，作为鉴定滑膜间充质干细胞的方法之一，采用流式细胞仪检测滑膜间充质干细胞表面标志物。具体方法如下：1）取上述实施例1培养至p4代的间充质干细胞悬液，1200rpm，离心5min。2）用pbs重悬细胞沉淀，调节细胞浓度为1.0×106cell/100μl。3）分别加抗体cd44、cd105、cd90、cd45、hla-dr、cd34，轻轻吹打混匀，4℃避光孵育30min，同时设置同型对照。4）加1ml的pbs于流式检测管中，1200rpm，5min，弃上清。5）加100μl的pbs，轻轻吹打混匀，上机检测。结果：对上述实施例1培养至p4代的间充质干细胞进行流式检测，三种表面标志物的阳性率均在98%以上，其中cd44阳性率高达99.47%，说明细胞向软骨分化的能力极强，证明该方法分离和培养滑膜间充质干细胞极易分化成软骨。而抗原cd45、hla-dr、cd34呈阴性表达，也符合滑膜间充质干细胞表面标记的特点，具体如图3所示。3、为鉴定滑膜间充质干细胞的成脂、成骨分化能力，在体外对其进行诱导分化，观察其形成脂滴和矿化结节的情况。3.1滑膜间充质干细胞向脂肪细胞诱导分化及油红o染色3.1.1成脂诱导液的配制成脂诱导液a：由l-dmem/f12、5mmol/l谷氨酰胺、8.5mol/l地塞米松、100nmol/l胰岛素、2mmol/l吲哚美辛、5%fbs混合而得。成脂诱导液b：由l-dmem/f12、5mmol/l谷氨酰胺、100nmol/l胰岛素、5%fbs混合而得。3.1.2成脂诱导取上述实施例1培养至p4代的间充质干细胞，以2×104cells/cm2的细胞密度接种于六孔板，待密度达到100%时，加入成脂诱导液a，诱导3天；再换用成脂诱导液b，继续诱导3天；如此循环3次，即可终止诱导过程，随时监测成脂情况。3.1.3油红o染色鉴定从培养箱中取出成脂诱导后的细胞，生理盐水清洗2次，每孔加2ml4%多聚甲醛固定30min，生理盐水清洗2次。加入1ml油红o染色30min后，去除染液，生理盐水冲洗2~3遍。显微镜下观察、拍照，结果如图4所示。3.2滑膜间充质干细胞向成骨细胞诱导分化及茜素红染色3.2.1成骨诱导液的配制：由dmem/f12、10%fbs、0.25mmol/l抗坏血酸、10mmol/l的β-甘油磷酸钠、8.5mol/l地塞米松。3.2.2成骨诱导取上述实施例1培养至p4代的间充质干细胞，以2×104cells/cm2的细胞密度接种在事先包被0.1%明胶的六孔板中，每孔加入2ml完全培养基。当细胞融合度达到60%-70%时，将孔内培养基吸走，加入成骨诱导液，每3天换液1次，21天后结束诱导。3.2.3茜素红染色鉴定从培养箱中取出成骨诱导后的细胞，生理盐水清洗2次，每孔加2ml4%多聚甲醛固定30min，用生理盐水清洗2次。加入1ml茜素红染色3~5min后，去除染液，生理盐水冲洗2~3遍。显微镜下观察、拍照，结果如图5所示。以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。当前第1页12当前第1页12