一种浮萍瞬时转化方法

1.本发明涉及植物瞬时转化技术领域，特别是涉及一种浮萍瞬时转化方法。


背景技术：

2.浮萍是单子叶水面漂浮植物，隶属于浮萍科浮萍属，广布于世界各地，其个体小，扩繁快，对环境的适应能力强，对盐碱水环境有一定的抗性，对重金属镉离子有富集能力。但是，对于浮萍富集重金属的生理机制和分子机制尚未阐明。通过制备浮萍瞬时转化体系，利用正置显微镜观察等技术，这将对重金属污染水境的生态学修复和植物抗重金属应用具有重要的价值和意义。
3.浮萍常规转化方法主要是农杆菌转化法，侵染时间需要花费1
‑
2月，时间较长，从愈伤组织到再分化为完整浮萍的难度大。这造成了侵染效率很低。建立转化效率高、稳定传代的侵染方法是构建转基因浮萍亟待解决的问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的是针对现有技术中存在的缺乏浮萍瞬时转化体系的问题，而提供一种浮萍瞬时转化方法。
5.为实现本发明的目的所采用的技术方案是：
6.一种浮萍瞬时转化方法，包括以下步骤：
7.步骤1，采集浮萍；
8.步骤2，采集到的浮萍在液体培养基上进行继代培养；
9.步骤3，活化并提取带有荧光标记目的基因的农杆菌；
10.步骤4，制备含有silwet
‑
775和蔗糖的溶菌液；
11.步骤5，将步骤3得到的带有荧光标记目的基因的农杆菌加入步骤4得到的溶菌液中，使菌体完全溶解于溶菌液中，裂解农杆菌使得质粒被释放出来；
12.步骤6，挑取步骤2得到的完整浮萍，用针头在浮萍叶片背面扎一个小孔后将浮萍放入步骤5得到的溶菌液中浸泡侵染，将侵染后的浮萍放入浮萍液体培养基中并进行暗培养，得到瞬时侵染浮萍。
13.在上述技术方案中，所述步骤1的浮萍为浮萍科浮萍属l.minor。
14.在上述技术方案中，所述步骤2的继代培养方法为：将浮萍培养于液体培养基上，培养条件为23
‑
25℃，光周期为16
‑
18小时/天，光强为95
‑
100μmol m
‑2s
‑1，每周继代一次。
15.在上述技术方案中，所述步骤2的液体培养基中包括0.4
‑
0.5mm的mgso4·
7h2o、1.4
‑
1.5mm的ca(no3)2·
4h2o、1.0
‑
1.2mm的kno3、0.4
‑
0.5mm的kh2po4、0.4
‑
0.5mm的mg(no3)2·
6h2o、50
‑
60μm的cacl2·
2h2o、50μ
‑
60m的kcl、6.1
‑
6.3μm的na2moo4·
2h2o、69
‑
72μm的h2bo3、30
‑
32μm的k2h2edta
·
2h2o、56.7
‑
57.1μm的fenh4‑
edta、13.8
‑
14.2μm的mncl2·
4h2o、2.8
‑
3.2μm的znna2edta
·
4h2o、4.8
‑
5.2μm的coso4·
7h2o、18.6
‑
19.2μm的na2‑
edta
·
2h2o，配置完成后调节ph至5.6
‑
5.8，并进行高压灭菌处理。
turionifera 5511。
36.步骤2，浮萍的培养：将浮萍培养于液体培养基上，培养条件为23℃温度下，光周期16小时/天，光强95μmol m
‑2s
‑1，每周继代一次。
37.大量元素包括：
[0038][0039]
微量元素包括：
[0040][0041][0042]
以上试剂调至ph 5.6
‑
5.8并于102.9kpa，121℃20分钟高压灭菌后使用。
[0043]
步骤3，菌体的活化与提取：将带有荧光标记目的基因(此实施例中选用gcamp)的农杆菌从甘油冻存管中平板活化3次。首先挑取单菌落并小体积活化菌体30h于5ml液体lb培养基(抗性)中，其次取1ml小体积活化的菌液进行大体积活化菌体4h于20ml液体lb培养基(抗性)中。检测农杆菌浓度，待菌体浓度达到od
600
＝0.6后在常温5000rpm，10min离心后弃去上清液得到菌体。
[0044]
液体lb培养基抗生素组成包括：
[0045][0046]
此次实验转入的基因为gcamp3，其为钙离子指示剂，是以单个荧光蛋白为基础构建而成，可以定位到特定的细胞亚型或细胞器，对细胞或细胞器内钙离子敏感，特异性结合钙离子后暴露出gfp末端，在488nm激发光照射下显示绿色荧光，其荧光强度与钙离子浓度成正比。
[0047]
步骤4，溶菌液的制备：
[0048]
溶菌液
[0049]
注：制备溶菌液的量可根据转化所需农杆菌和浮萍的量而定。
[0050]
步骤5，重悬菌体：在离心后得到的农杆菌离心管中加入8ml溶菌液，并摇晃离心管使菌体完全溶解于溶菌液中。
[0051]
步骤6，浮萍的侵染：将8ml菌液倒入6孔板中。用镊子挑取完整浮萍(约6
‑
8片)于滤纸上，用针头在浮萍叶片背面扎一个小孔后将浮萍放入装有菌液的六孔板中浸泡20min。最后将侵染后的浮萍放入装有浮萍液体培养基的锥形瓶中并进行暗培养24h。
[0052]
六孔板内共做三个重复实验，在488nm激发光照射下，第一个重复实验得到的浮萍根部的正置荧光观察显示结果如图2所示，第二个重复实验得到的浮萍根部的正置荧光观察显示结果如图3所示，第三个重复实验得到的浮萍根部的正置荧光观察显示结果如图4所示。
[0053]
实施例2
[0054]
对野生型浮萍和实施例1得到的瞬时侵染浮萍进行对比。
[0055]
在荧光显微镜下观察实施例1得到的瞬时侵染浮萍和采集的野生型浮萍，可观察到转化后浮萍根部带有绿色荧光标记瞬转基因的绿色荧光信号如图2
‑
4所示，而采集的野生型浮萍则无明显绿色荧光如图1所示。
[0056]
本项发明中农杆菌瞬时侵染浮萍的方法具有易操作、时间短(从处理到培养共计大约25小时)、成本低等特点，可应用于浮萍分子生物学、生物反应器构建和荧光标记等相关理论与应用研究中，是浮萍细胞与分子生物学分析不可或缺的关键操作。
[0057]
实施例3
[0058]
按照实施例1的方法和步骤进行第二次重复实验，得到瞬时侵染浮萍后，观察到转化后浮萍根部带有绿色荧光标记瞬转基因的绿色荧光信号如图5所示，而采集的野生型浮萍则无明显绿色荧光如图6所示。
[0059]
实施例4
[0060]
本实施例是本发明得到的农杆菌瞬时侵染浮萍的应用。
[0061]
ca
2+
信号在植物细胞响应环境胁迫中十分重要，浮萍在受到cd
2+
胁迫下细胞内ca
2+
通量会发生变化，而gcamp3可以特异性结合浮萍细胞内ca
2+
并在荧光显微镜下显示出绿色荧光，可根据荧光强度判断浮萍细胞在镉离子胁迫下钙信号的强弱，由此应用于浮萍富集重金属的生理机制和分子机制的研究中。
[0062]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。