检测非洲猪瘟病毒的引物对、探针、试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种基于巢式rpa(nestrpa)技术检测非洲猪瘟病毒p72基因的引物对、探针、试剂盒及其应用。

背景技术：

非洲猪瘟(infectionwithafricanswinefevervirus，asf)是由非洲猪瘟病毒(africaswinevirus,asfv)感染家猪、野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等)而引起的一种急性、出血性、烈性传染病。asf是一种传染性高、致病性极强的动物疫病。主要在猪群中传播，其中间宿主为软体蜱科下钝缘蜱属的软壁虱。猪被asfv感染后，会迅速出现皮肤、腹腔脏器甚至心脏出血，导致急性出血性死亡。病猪的体液、血液、肉制品均具有传染性。1921年，非洲猪瘟疫情首次在肯尼亚报道，此后疫情一直存在于撒哈拉以南的非洲国家，于1957年左右流传至西欧和拉美国家，多数疫情萌发时即被及时扑灭，但在葡萄牙、西班牙和意大利部分地区仍持续流行。

2007年以来，非洲猪瘟在全球多个国家发生、扩散、流行，特别是俄罗斯及其周边地区。2017年3月，俄罗斯远东地区伊尔库茨克州发生非洲猪瘟疫情。2020年2月6日，希腊农业发展和食品部宣布，该国东北部塞雷斯地区一家小型养猪场发生非洲猪瘟，这是希腊报告的首起非洲猪瘟疫情。2020年9月10日，德国联邦动物卫生研究所在德国境内的一头野猪尸体中检出非洲猪瘟病毒，这是德国确诊的首例非洲猪瘟病例。2020年11月27日俄罗斯、罗马尼亚共发生50起非洲猪瘟疫情。

自2018年8月至2019年12月，我国国内频繁发生非洲猪瘟疫情。2018年8月份我国发生首例非洲猪瘟疫情，当年全国共报告发生非洲猪瘟99起，累计扑杀生猪80万头，覆盖全国31个省市。2019年，全国共报告发生非洲猪瘟63起，累计扑杀生猪39万头。2020年度由于新冠疫情，造成全国的生猪量减少，但是，当年全国共报告发生非洲猪瘟19起，累计扑杀生猪1.4万头。

目前全世界没有有效的疫苗来预防asf，一旦发生疫情很难根除，是世界范围内养猪业重点防范的疫病。世界动物卫生组织(oie)已将asf列为法定报告疫病，我国将其列为一类动物疫病。虽然asf不是人畜共患病，一旦爆发疫情将对全球养猪业造成巨大经济损害，以及对猪肉产品造成严重食品安全危害。

非洲猪瘟病毒(africaswinevirus,asfv)是一种双链核质dna病毒。asfv形态为正二十面体，直径约200纳米，由多层物质构成：中央为内含拟核的蛋白质核壳，由内向外分别被一层脂质包膜和一层蛋白质衣壳包裹。该病毒的衣壳由8280个主要衣壳蛋白p72和60个戊蛋白构成，此外至少有三种蛋白质通过对临近蛋白的粘连来保持衣壳结构的稳定。p72蛋白是asfv的主要结构蛋白，由b646l基因编码，该基因序列高度保守，是病毒检测中最常用的靶基因。

目前应用于非洲猪瘟的检测方法包括核酸检测、抗原检测和抗体检测。其中病毒核酸检测是应用最为广泛的检测手段，适合疾病的早期发现和早期诊断。pcr是核酸检测中最主要的技术，其特异性好，但检测所需时间较长，且检测所需设备较为昂贵，需要专用实验室进行核酸检测，不利于养殖场现场采集样本的现场快速检测。到目前为止行业内尚未制定屠宰场非洲猪瘟pcr检测技术规范，仍存在非洲猪瘟pcr检测实验室不规范，试验样本采集不规范，检测人员水平良莠不齐，检测成本过高等问题。

重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymeraseamplification，rpa)是一种新型的等温核酸扩增技术，可在便携式恒温扩增荧光检测仪中实现检测结果的直接读取，检测时间和便利性均优于传统pcr方法，在动物疫病快速检测方面具有广泛的应用前景。但rpa技术本身对于引物设计要求极高，引物设计和筛选需要耗费巨大的经济和时间成本。

目前，非洲猪瘟疫情，在全球多个国家仍存在流行，未得到有效控制，为了提高asf的检出率，减少漏诊率，降低假阴性率，因此我们急需开发出一款具高灵敏度和快速准确的非洲猪瘟核酸检测技术。

技术实现要素：

本发明要解决目前缺乏快速、准确检测非洲猪瘟病毒试剂盒的技术问题，提供一种基于巢式rpa(nestrpa)技术检测非洲猪瘟病毒的引物对、探针、试剂盒，该试剂盒能快速、准确、灵敏、特异地对非洲猪瘟病毒(asfv)进行检测。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种检测非洲猪瘟病毒的引物对，所述引物对是针对seqidno：1所示非洲猪瘟病毒p72基因序列或其部分序列设计的引物对。

优选的，所述引物对是以巢式rpa检测非洲猪瘟病毒的引物对，其包含外引物对和内引物对。

更优选的，所述外引物对具有如seqidno：3和seqidno：4所示的碱基序列，所述内引物对具有如seqidno：5和seqidno：6所示的碱基序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种检测非洲猪瘟病毒的探针，所述探针是特异性针对seqidno：1所示非洲猪瘟病毒p72基因序列或其部分序列设计的探针。

优选的，所述探针具有如seqidno：2所示的碱基序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，所述试剂盒包含上述的引物对。

优选的，所述试剂盒还包含上述探针。

在本发明的另一方面，还提供了一种以巢式rpa检测非洲猪瘟病毒的方法，包括以下步骤：

用针对非洲猪瘟病毒p72基因的一对外引物，以待测样本核酸为模板进行第一次rpa反应，扩增目的基因第一片段；

用针对非洲猪瘟病毒p72基因的一对内引物，以扩增出的目的基因第一片段为模板、并在加入非洲猪瘟病毒p72基因特异性信号探针的条件下进行第二次rpa反应，扩增目的基因第二片段；

通过检测探针信号，获得非洲猪瘟病毒核酸的检测结果。

所述信号探针为荧光素标记的探针，所述检测探针信号是利用荧光检测设备检测标记在探针上的荧光素信号。

在本发明的另一方面，还提供了上述试剂盒在制备检测非洲猪瘟病毒的产品中的应用。

本发明检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，通过nestrpa技术检测非洲猪瘟病毒p72基因，最低可检测到2拷贝/ul的asfv病毒核酸片段，大大提高了检测灵敏度，且在39℃恒温条件下进行检测反应，无需昂贵检测设备，检测时间短，仅需12min，为非洲猪瘟的防控提供了强有力的技术支持，具有非常广阔的应用前景。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1的asfvp72基因序列保守性比对分析部分展示图；

图2是本发明实施例1的asfvp72基因突变碱基分布分析部分展示图；

图3是本发明实施例1的利用rpa方法筛选asfv的p72基因引物结果图；

图4是本发明实施例1的利用rpa方法检测p72优选引物的最低检测限(lod)结果图；

图5是本发明实施例2的利用nestrpa方法检测p72基因片段质粒dna的lod检测结果图；

图6是本发明实施例2的利用nestrpa方法对asfv标准品dna(含p72基因序列)的lod检测结果图；

图7是本发明实施例5的利用nestrpa方法检测p72基因引物探针特异性的检测结果图。

具体实施方式

本发明根据asfv基因组中序列保守稳定的p72基因设计特异性引物和探针，基于rpa反应原理，建立了asfv病毒nestrpa实时荧光快速检测法，实验室条件下可以检出2拷贝/ul的asfv病毒核酸片段，大大提高检测方法的灵敏度。

本发明以巢式rpa检测非洲猪瘟病毒的方法，包括以下步骤：

步骤一：使用asfvp72基因的一对外引物，对模板dna进行第一次rpa反应，预扩增目的基因的第一片段；

步骤二：使用asfvp72基因的一对内引物，以步骤一扩增出的目的基因第一片段为模板，并在加入p72基因特异性信号探针的条件下进行第二次rpa反应，扩增目的基因的第二片段；

利用荧光检测设备检测带标记的探针信号，获得非洲猪瘟病毒核酸检测结果。

所述信号探针为带有信号标记的探针，通常为带有荧光素标记的探针，本发明具体实施例中使用的荧光素标记的探针为fam荧光素标记探针。

步骤一中rpa反应体系为：酶的冻干粉(包括重组酶、单链dna结合蛋白及聚合酶)，25ul缓冲液v，2.1ul正向外引物(10um)，2.1ul反向外引物(10um)，5ul待测样品，2.5ul乙酸镁(280mm)。醋酸镁一旦加入反应体系中，反应立即开始。

步骤二中rpa反应体系为：酶的冻干粉(包括重组酶、单链dna结合蛋白、聚合酶及核酸外切酶)，25ul缓冲液vi，2.1ul正向内引物(10um)，2.1ul反向内引物(10um)，0.6ul探针(10um),全部预反应产物(约37ul)，2.5ul乙酸镁(280mm)。醋酸镁一旦加入反应体系中，反应立即开始。

步骤一的rpa反应可在37-42℃进行，反应时间为5-20min。优选反应温度为39℃，反应时间15min。

步骤二的rpa反应可在在37-42℃进行，反应时间为1-30min。优选反应温度为39℃，反应时间15min。

通过恒温荧光扩增仪实时观察，在上机检测15min内可见典型指数型扩增曲线，曲线斜率大于20，且荧光值差值与空白/阴性对照具有显著统计学差异(p<0.05)，判断为阳性结果，待测样本asfvp72基因检测结果为阳性。

实施例1asfv病毒p72基因的引物和探针设计及筛选

通过检索pubmed核酸数据库，发现asfvp72(b646l)基因序列保守性较好，但仍存在个别碱基突变(图1)。以genbank:ay578706.1为参考序列，分析突变碱基分布情况(图2)，并在碱基突变频率较低的片段设计引物和探针(表1)。

表1asfvp72基因引物和探针

合适的引物序列是rpa高效扩增的重要一环，首先在有连续3个胸腺嘧啶(t)的序列设计探针，以fam荧光素修饰探针。在探针两端不同位置分别设计11对引物，以筛选出最高效的引物和探针组合(表1)。在引物筛选时，将第一条正向引物(f)分别与第一至第十条反向引物(r)配对。接着再筛选反向引物，将第一条反向引物(r)分别与第一至第十条正向引物(f)配对。通过两轮引物筛选，找到具有最大斜率和最短起峰时间的最佳引物组合。由于购买到的asfvdna标准品(假病毒培养液)的初始浓度较低(5.9×10³拷贝/ul)，未达到筛选引物的适合浓度(1×10⁵拷贝/ul)，因此合成含asfvp72基因片段的阳性质粒用于引物筛选，在1×10⁵拷贝/ul浓度下测试各引物对与探针组合的敏感性和特异性。(阳性质粒、引物和探针的合成均由生工生物(上海)有限公司完成)

将含有asfvp72基因序列的质粒dna用系列稀释法依次稀释为1×10⁶拷贝/ul、1×10⁵拷贝/ul、1×10⁴拷贝/ul、1×10³拷贝/ul、500拷贝/ul、200拷贝/ul、100拷贝/ul、10拷贝/ul。用rpa方法，在30分钟反应终点，观察待测样本与空白对照之间的荧光度差异是否有统计学意义，判断标准是p<0.05为阳性，p>0.05为阴性。经过筛选，发现p72基因的引物对f5/r2和f6/r7具有更高的灵敏度(表2和图3)，其最低检测限分别为10⁴拷贝/ul和10³拷贝/ul(图4)。但这一结果与目前的qpcr方法相比，检测方法的灵敏度并没有优势。

表2优选asfvp72基因的引物对和探针组合

实施例2p72基因优选引物、探针组合对asfv质粒dna的nestrpa检测

进一步将含有asfvp72基因序列的质粒dna依次稀释为50拷贝/ul、20拷贝/ul、5拷贝/ul、2拷贝/ul、1拷贝/ul，用于测试nestrpa对asfvp72基因的检出能力。发现使用优选的p72基因的引物对和探针组合进行nestrpa检测，可检测到浓度低至1拷贝/ul的含asfvp72基因片段的阳性质粒dna(图5，图5中的图例数值单位为拷贝/ul)，说明nestrpa新技术可显著提高asfv病毒核酸p72基因检测灵敏度。

实施例3p72基因优选引物、探针组合对asfv标准品dna的nestrpa检测

用asfv标准品dna(假病毒培养液，含p72基因)，其dna含量为5.9×10³拷贝/ul，验证p72基因优选引物的灵敏度。取室温复温混匀的假病毒培养液200ul，使用柱式抽提法提取dna，溶解于20ul无酶水。根据假病毒培养液初始dna含量计算得标准品dna提取液的浓度约为5.9×10⁴拷贝/ul，即p72基因dna浓度为5.9×10⁴拷贝/ul。

将标准品dna提取液用倍比稀释法依次稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍、12500倍、20000倍、25000倍、40000倍、50000倍、80000倍和100000倍。利用nestrpa方法进行检测，结果显示本发明最低可检测到标准品原液稀释至50000倍的asfv标准品dna，约为1.18拷贝/uldna(图6)，这与使用含p72基因片段的阳性质粒的最小可检出浓度接近(图5)。进一步证明nestrpa确实可显著提高asfv病毒p72基因检测灵敏度。

实施例4nestrpa方法与qpcr方法检测asfv标准品p72基因灵敏度比较

将nestrpa方法与两种市售的qpcr方法对asfv标准品dna的灵敏度进行对比。三种方法均使用asfv标准品dna(假病毒培养液)作为待测样本。取室温复温混匀的假病毒培养液200ul，使用柱式抽提法提取dna，溶解于20ul无酶水。根据假病毒培养液初始dna含量计算得标准品dna提取液的浓度约为5.9×10⁴拷贝/ul，即p72基因dna浓度为5.9×10⁴拷贝/ul。将标准品dna提取液用倍比稀释法依次稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍、25000倍、40000倍、50000倍。分别采用nestrpa、qpcr1和qpcr2方法对上述稀释样品进行p72基因检测，检测fam荧光信号通道。

结果显示，nestrpa技术的检测灵敏度最高，其最低可检测到asfv标准品原液稀释至50000倍的dna，浓度低至1.18拷贝/ul。而以ct值38.00为cutoff值时，qpcr1和qpcr2方法的阳性最低可检出浓度为5.90拷贝/ul(标准品原液稀释10000倍)(表3)。同时，我们对三种方法的上机检测时间进行比较，发现nestrpa技术在1min左右，即可报告高浓度dna样本(约4*10⁴拷贝/ul)的结果，在12min左右即可报告极低初始浓度dna样本(1.18拷贝/ul)的结果，而qpcr方法则需要至少30min(表3)。上述结果表明，本发明nestrpa方法检测asfvp72基因相比qpcr方法，具有更高的灵敏度(1.18拷贝/ul)和更短的检测时间(1～12min)。

表3nestrpa与qpcr方法对asfv标准品dna的检出能力比较

实施例5利用nestrpa对asfvp72基因的优选引物、探针组合进行特异性检测

获取猪细小病毒(porcineparvovirus,ppv)、猪伪狂犬病毒(pseudorabiesvirus,prv)、以及猪圆环病毒2型(porcinecircovirustype2，pcv)的阳性样本dna，进行nestrpa检测。使用本发明nestrpa方法，利用asfvp72基因的优选引物和探针组合，分别对asfv、ppv、prv、pcv2病毒dna进行检测，结果显示本发明nestrpa的特异性良好，仅在asfv质粒dna样本出现典型阳性扩增曲线，其他病毒dna样本未见典型扩增曲线(图7)。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>黄婉秋，黄健，北京睿偲达科技有限公司

<120>检测非洲猪瘟病毒的引物对、探针、试剂盒及其应用

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>409

<212>dna

<213>非洲猪瘟病毒（africanswinefevervirus）

<400>1

tcgcattgcctccgtagtggaagggtatgtaagagctgcagaactttgatggaaatttat60

cgataagattgataccatgagcagttacggaaatgtttttaataataggtaatgtgatcg120

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<213>人工序列（artificial）

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<213>人工序列（artificial）

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<213>人工序列（artificial）

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<212>dna

<213>人工序列（artificial）

<400>6

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