具有细胞修复、保湿作用的长双歧杆菌BLG-19、应用及产品的制作方法

本发明涉及微生物
技术领域：
，具体涉及一种具有细胞修复、保湿作用的长双歧杆菌blg-19、应用及产品。
背景技术：
：爱美之心众人有之，但是每到秋冬季节，人们的皮肤干燥，皮肤细胞水分损失，严重时皮肤会出现干纹、细纹，造成皮肤老化。为避免出现皱纹、色斑、干燥、紧绷、粗糙及脱屑等肌肤衰老问题必须走补水、保湿之道，只有保持肌肤细胞水分的不流失，才能确保肌肤代谢正常进行，同时也可以加速细胞的自我修复功能。双歧杆菌是一种重要的肠道有益微生物，对人体健康具有生物屏障、营养作用、抗肿瘤作用、免疫增强作用、改善胃肠道功能、抗衰老等多种重要的生理功能。双歧杆菌还能抑制人体有害细菌的生长，抵抗病原菌的感染，合成人体需要的维生素，促进人体对矿物质的吸收，产生醋酸、丙酸、丁酸和乳酸等有机酸刺激肠道蠕动，促进排便，防止便秘以及抑制肠道腐败，在净化肠道环境、分解致癌物质、刺激人体免疫系统、提高抗病能力等方面有着重要作用。长双歧杆菌属于双歧杆菌，目前可知具有调节肠道健康的功效，调节人体肠道，改善健康功效。现阶段，市场上针对减少皮肤细胞流失、增加皮肤角质层水分的产品大多是一些保湿类化妆品，此类产品往往会破坏皮肤的自我保护系统，其中添加的部分化学成分也存在不利于受损皮肤创面愈合的弊端，使用后会留下疤痕，影响美观。技术实现要素：针对现有细胞修复和保湿功效的化妆品往往会破坏皮肤的自我保护系统，不利于皮肤创面愈合，容易留疤的技术问题，本发明提供一种具有细胞修复、保湿作用的长双歧杆菌blg-19、应用及产品，利用长双歧杆菌blg-19胞溶物可对皮肤发挥保水功效，增加皮肤角质层水分的特点，赋予产品良好的吸湿保湿功效，同时本发明产品还可促进创面愈合，减少疤痕的产生及对人体的损害。第一方面，本发明提供一种具有细胞修复、保湿作用的长双歧杆菌blg-19，所述长双歧杆菌blg-19已于2021年3月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc21894，分类命名为长双歧杆菌bifidobacteriumlongum。第二方面，本发明提供一种上述长双歧杆菌blg-19的应用，所述应用为利用长双歧杆菌blg-19制备细胞修复、保湿产品。进一步的，所述应用为利用长双歧杆菌blg-19的胞溶物制备细胞修复、保湿产品，所述胞溶物由长双歧杆菌blg-19高压均质自溶得到的自溶物经灭酶、离心、浓缩干燥和灭菌制得。第三方面，本发明提供一种长双歧杆菌blg-19的胞溶物的制备方法，包括如下步骤：（a）按1%的接种量，将长双歧杆菌blg-19接种到mrs液体培养基上，37℃培养24h，得到菌液，将菌液离心、真空冷冻干燥，获得长双歧杆菌blg-19菌粉；（b）将长双歧杆菌blg-19菌粉加入蒸馏水中，长双歧杆菌blg-19菌粉与蒸馏水的重量比为1：2，使用hcl调节溶液ph值至6.0，在70mpa压力下进行4次高压均质，每次20min，使长双歧杆菌blg-19细胞壁充分破碎，然后37℃条件下自溶16h，得到长双歧杆菌blg-19的自溶物；（c）将自溶物于15℃下放置30min，然后升温至90℃，并保温1h，得到灭酶溶液；（d）将灭酶溶液在22-26℃条件下离心10min，转速为5000r/min，取上清液；（e）离心得到的上清液用膜式超滤初步浓缩后，再经真空浓缩得到浓缩物，真空浓缩条件为-0.08mpa、60-65℃；（f）将浓缩物置于120℃条件下高温灭菌5min，得到长双歧杆菌blg-19的胞溶物。进一步的，所述mrs液体培养基包括：蛋白胨10g、牛肉粉5g、k2hpo4·7h2o2g、柠檬酸三铵2g、ch3coona·3h2o5g、葡萄糖20g、吐温801ml、mgso4·7h2o0.2g、mnso4·4h2o0.05g、蒸馏水1000ml。第四方面，本发明提供一种细胞修复、保湿产品，所述细胞修复、保湿产品含有上述长双歧杆菌blg-19的胞溶物。进一步的，所述细胞修复、保湿产品为长双歧杆菌blg-19胞溶物的水溶液。进一步的，所述细胞修复、保湿产品中，长双歧杆菌blg-19胞溶物的浓度为1wt%-5wt%。本发明的有益效果在于，本发明提供一种长双歧杆菌blg-19及其在制备细胞修复、保湿产品上的应用和细胞修复、保湿产品，利用长双歧杆菌blg-19可对细胞进行修复和保湿的功效，产品中含有的长双歧杆菌blg-19胞溶物可对皮肤发挥保水功效，增加皮肤角质层的水分，具有良好的吸湿保湿功效，同时也可促进创面愈合，无副作用，能减少疤痕的产生及对人体的损害；该细胞修复、保湿产品还具有制备方法简单、易于操作、成本低的优势。本发明还提供一种长双歧杆菌blg-19的胞溶物的制备方法，通过限定高压均质等步骤参数，提升了长双歧杆菌blg-19内溶物提取率；所得胞溶物在一定时间内具备与甘油、丁二醇相同的吸湿能力和超越丁二醇的保湿能力，可有效促进皮肤含水量的增加，并具有较好的愈合创伤及疤痕抑制效果。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为长双歧杆菌blg-19胞溶物、甘油、丁二醇在相对湿度43%条件下吸湿率随时间的变化折线图；图2为长双歧杆菌blg-19胞溶物、甘油、丁二醇在相对湿度81%条件下吸湿率随时间的变化折线图；图3为长双歧杆菌blg-19胞溶物、甘油、丁二醇在相对湿度43%条件下保湿率随时间的变化折线图；图4为长双歧杆菌blg-19胞溶物、甘油、丁二醇在相对湿度81%条件下保湿率随时间的变化折线图；图5为皮肤含水量测试结果图；图6为大鼠创面愈合率的变化曲线图。具体实施方式为了使本
技术领域：
的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。实施例1菌种分离纯化及鉴定1、菌种分离纯化（1）四川成都，用灭菌的取样匙对自然发酵酸奶进行取样，取样过程避免其他部位接触样品以防污染，无菌条件下取1ml自然发酵酸奶置于99ml浓度为0.85%的无菌生理盐水的三角瓶中，振荡15min，使样品充分混匀，制得混悬液；（2）按倍数稀释法对混悬液进行10倍系列梯度稀释，每个梯度取100μl均匀涂布于mrs平板培养基上，随后置于厌氧罐中，37℃厌氧培养过夜，次日可见mrs平板培养基上长有特征菌落（特征为菌落中等大小，凸起，微白色，湿润，边缘整齐，菌落呈圆形，直径为1.5mm±1mm）；（3）按1%的接种量，对选取的特征菌落作二代划线接种到mrs平板培养基上进行纯化处理，37℃，厌氧活化1天，得到培养物，命名为blg-19，备用。2、菌种鉴定（1）引物：27f：5'-agagtttgatcmtggctcag-3'；1492r：5'-ggttaccttgttacgactt-3'。（2）鉴定序列利用细菌dna试剂盒提取培养物的dna，然后pcr扩增16srdna片段，得到扩增产物，之后将扩增产物送至生工生物工程股份有限公司进行测序，得到16srdna的全长，序列如下：cgtcttgcttggtggtgagagtggcgaacgggtgagtaatgcgtgaccgacctgccccatacaccggaatagctcctggaaacgggtggtaatgccggatgctccagttgatcgcatggtcttctgggaaagctttcgcggtatgggatggggtcgcgtcctatcagcttgacggcggggtaacggcccaccgtggcttcgacgggtagccggcctgagagggcgaccggccacattgggactgagatacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatggaggccttcgggttgtaaacctcttttatcggggagcaagcgagagtgagtttacccgttgaataagcaccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagggctcgtaggcggttcgtcgcgtccggtgtgaaagtccatcgcttaacggtggatccgcgccgggtacgggcgggcttgagtgcggtaggggagactggaattcccggtgtaacggtggaatgtgtagatatcgggaagaacaccaatggcgaaggcaggtctctgggccgttactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacggtggatgctggatgtggggcccgttccacgggttccgtgtcggagctaacgcgttaagcatcccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaagaaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgcggattaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctgggcttgacatgttcccgacggtcgtagagatacggcttcccttcggggcgggttcacaggtggtgcatggtcgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgccccgtgttgccagcggattatgccgggaactcacgggggaccgccggggttaactcggaggaaggtggggatgacgtcagatcatcatgccccttacgtccagggcttcacgcatgctacaatggccggtacaacgggatgcgacgcggcgacgcggagcggatccctgaaaaccggtctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaaggcggagtcgctagtaatcgcgaatcagcaacgtcgcggtgaatgcgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcaagtcatgaaagtgggcagcacccgaagccggtggcctaaccccttgtgggatggagccgtctaaggtgaggctcgtataaac。（3）鉴定结果16srdna在eztaxon数据库进行blast比对，进行同源性比较，该菌种属于长双歧杆菌（bifidobacteriumlongum），其分类单元为：bacteria；actinomycetes；actinobacteria；bifidobacteriales；bifidobacteriaceae；bifidobacteriumlongum。实施例2一种细胞修复、保湿产品一种细胞修复、保湿产品，该产品含有长双歧杆菌blg-19胞溶物，长双歧杆菌blg-19胞溶物由长双歧杆菌blg-19高压均质自溶得到的自溶物经灭酶、离心、浓缩干燥、灭菌后得到，具体为：（a）按1%的接种量，将长双歧杆菌blg-19接种到mrs液体培养基上，37℃培养24h，得到菌液，将菌液离心、真空冷冻干燥，获得长双歧杆菌blg-19菌粉；mrs液体培养基包括：蛋白胨10g、牛肉粉5g、k2hpo4·7h2o2g、柠檬酸三铵2g、ch3coona·3h2o5g、葡萄糖20g、吐温801ml、mgso4·7h2o0.2g、mnso4·4h2o0.05g、蒸馏水1000ml；（b）将长双歧杆菌blg-19菌粉加入蒸馏水中，长双歧杆菌blg-19菌粉与蒸馏水的重量比为1：2，使用hcl调节溶液ph值至6.0，在70mpa压力下进行4次高压均质，每次20min，使长双歧杆菌blg-19细胞壁充分破碎，然后37℃条件下自溶16h，得到长双歧杆菌blg-19的自溶物；（c）将自溶物于15℃下放置30min，然后升温至90℃，并保温1h，得到灭酶溶液；（d）将灭酶溶液在23℃条件下离心10min，转速为5000r/min，取上清液；（e）离心得到的上清液用膜式超滤初步浓缩后，再经真空浓缩得到浓缩物，真空浓缩条件为-0.08mpa、60℃；（f）将浓缩物置于120℃条件下高温灭菌5min，得到长双歧杆菌blg-19的胞溶物。实施例3一种细胞修复、保湿产品一种细胞修复、保湿产品，该产品含有长双歧杆菌blg-19胞溶物，长双歧杆菌blg-19胞溶物由长双歧杆菌blg-19高压均质自溶得到的自溶物经灭酶、离心、浓缩干燥、灭菌后得到，具体为：（a）按1%的接种量，将长双歧杆菌blg-19接种到mrs液体培养基上，37℃培养24h，得到菌液，将菌液离心、真空冷冻干燥，获得长双歧杆菌blg-19菌粉；mrs液体培养基包括：蛋白胨10g、牛肉粉5g、k2hpo4·7h2o2g、柠檬酸三铵2g、ch3coona·3h2o5g、葡萄糖20g、吐温801ml、mgso4·7h2o0.2g、mnso4·4h2o0.05g、蒸馏水1000ml；（b）将长双歧杆菌blg-19菌粉加入蒸馏水中，长双歧杆菌blg-19菌粉与蒸馏水的重量比为1：2，使用hcl调节溶液ph值至6.0，在70mpa压力下进行4次高压均质，每次20min，使长双歧杆菌blg-19细胞壁充分破碎，然后37℃条件下自溶16h，得到长双歧杆菌blg-19的自溶物；（c）将自溶物于15℃下放置30min，然后升温至90℃，并保温1h，得到灭酶溶液；（d）将灭酶溶液在25℃条件下离心10min，转速为5000r/min，取上清液；（e）离心得到的上清液用膜式超滤初步浓缩后，再经真空浓缩得到浓缩物，真空浓缩条件为-0.08mpa、65℃；（f）将浓缩物置于120℃条件下高温灭菌5min，得到长双歧杆菌blg-19的胞溶物。筛选例1长双歧杆菌blg-19胞溶物的提取称取5份重量为50g的长双歧杆菌blg-19菌粉，分别加入100g蒸馏水中，使用hcl调节溶液ph值至6.0，标记为1#~5#样品，将1#~5#样品在70mpa压力下分别进行0、1、2、3、4次高压均质，每次均质20min，然后37℃条件下自溶16h，得到5份长双歧杆菌blg-19自溶物；将上述5份自溶物按照实施例2记载的步骤（c）-（f）进行灭酶、离心、浓缩干燥和灭菌处理，得到胞溶物，计算1#~5#样品的胞溶物得率、蛋白质溶出率和氨基酸态氮含量，结果如下表1所示。表1高压均质次数对胞溶物提取效果的影响序号均质次数胞溶物得率/%蛋白质溶出率/%氨基酸态氮含量/%1#033.1337.982.812#151.2455.993.953#262.3367.134.294#363.5968.974.765#464.9769.544.82可以看出，长双歧杆菌blg-19内溶物提取率的高低关键在于长双歧杆菌blg-19细胞壁的破碎程度，细胞壁的破碎程度越高，越有利于胞内物质的扩散溶出，胞溶物的得率越高，高压均质次数对长双歧杆菌blg-19自溶有很大的影响，选取高压均质4次制取长双歧杆菌blg-19胞溶物可以诱导和促进长双歧杆菌blg-19自溶，增强各类水解酶的作用，缩短自溶时间，且能够将细胞完全破碎，使胞溶物全部溶出。测试例对上述5#样品经4次高压均质、灭酶、离心、浓缩干燥和灭菌处理得到的长双歧杆菌blg-19胞溶物的性能进行测定。1、吸湿性实验：称取胞溶物3g两份，量取甘油3ml、丁二醇3ml各两份，并记录甘油和丁二醇重量，将其中一份3g胞溶物、3ml甘油和3ml丁二醇置于相对湿度为43%的干燥器中，将另一份3g胞溶物、3ml甘油和3ml丁二醇置于相对湿度为81%的干燥器中，保持两干燥器内温度为20℃，50h后分别测定两干燥器中胞溶物、甘油和丁二醇的重量。按照下式计算胞溶物、甘油和丁二醇的吸湿率，结果如图1、2所示。吸湿率=(mn-m0)/m0×100%，式中，m0表示样品放置前的质量，mn表示样品放置50h后的质量。由图1可知，在相对湿度为43%的情况下，前10h内，长双歧杆菌blg-19与丁二醇、甘油没有差异；10h后，吸湿性能排序为甘油>丁二醇>长双歧杆菌blg-19，其中，在30h后各个实验组间吸湿率变化逐渐减缓，基本达到饱和状态。由图2可知，在相对湿度为81%的情况下，前10h内，长双歧杆菌blg-19与丁二醇、甘油没有差异，10h-20h，长双歧杆菌blg-19与丁二醇的吸湿率相似。综合图1、图2结果可知，长双歧杆菌blg-19胞溶物在前10h内有与甘油、丁二醇相同的吸湿性能。2、保湿性实验用去离子水配制两份胞溶物浓度为1wt%的溶液、两份丁二醇浓度为1wt%的溶液以及两份甘油浓度为5wt%的溶液，并记录各溶液含水量，将其中一份胞溶物溶液、丁二醇溶液和甘油溶液置于相对湿度为43%的干燥器中，将另一份胞溶物溶液、丁二醇溶液和甘油溶液置于相对湿度为81%的干燥器中，保持两干燥器内温度为20℃，50h后分别测定两干燥器中各溶液含水量。按照下式计算胞溶物、甘油和丁二醇的保湿率，结果如图3、4所示。保湿率=(m2-m1)/m1×100%，式中，m1表示样品放置前所含水的重量，m2表示样品放置50h后所含水的重量。由图3可知，在相对湿度为43%的情况下，前10h内，甘油与长双歧杆菌blg-19在前10h内保湿性能优异，之后保湿速率逐渐变慢；10h后，长双歧杆菌blg-19的保湿性能始终大于丁二醇。由图4可知，在相对湿度为81%的情况下，前20h内，保湿性能排序为长双歧杆菌blg-19>甘油>丁二醇，这说明长双歧杆菌blg-19有很好的保湿性。综合图3、图4结果可知，长双歧杆菌blg-19胞溶物具有潜在的替代常用保湿剂的价值。3、皮肤含水量实验分别用去离子水配制胞溶物浓度为1wt%、3wt%和5wt%的溶液作为实验组1-3，用去离子水配制甘油浓度为5wt%的溶液作为阳性对照组，用去离子水作为空白对照组。选取20名年龄在25-30岁的女性作为此次实验的受试者，以受试者的手前臂内侧进行测试，受试者在实验开始前0.5h进入测试房间（室内温度20℃，相对湿度50%±2%），并将手前臂暴露，使其呈测试状态，在每位受试者的手前臂内侧划定5个测试区域，每一测试区域的规格均为3cm×3cm，相邻测试区域间隔1cm，测试时在5个测试区域分别涂抹实验组1-3、阳性对照组和空白对照组，每个测试区域的涂抹量均为2ml，定时使用cm825皮肤水分测试仪测定各组测试区域的皮肤含水量，记录测量值，比较各组样品对皮肤含水量影响的差异，结果如图5所示。由图5可知，长双歧杆菌blg-19胞溶物能够促进皮肤含水量的增加，并呈剂量依赖性，随胞溶物浓度增加，皮肤含水量逐渐增加，实验组3的保湿性与甘油相近（p>0.05)。涂抹实验组3的受试区域与空白对照组对比，差异性显著（p<0.05)，表明长双歧杆菌blg-19溶液能够有效地促进皮肤含水量的增加。4、创面修复实验选取清洁级8周龄sd雌性大鼠18只，体重200-250g左右，分成实验组、阳性对照组和空白对照组，每组6只，将各组大鼠用6mg/kg(bw)的异戊巴比妥钠麻醉，后剪去大鼠背部毛发，用恒温热水浴加热至99℃的24层医用纱布为热载体，在大鼠背部烫15s，形成深ⅱ度烫伤创面，使创面与创周正常皮肤形成明显分界，同时用碘酒进行消毒，半个小时后对各组大鼠的创伤处进行第一次给药，实验组使用以去离子水配制的胞溶物溶液（胞溶物浓度为1wt%）1ml均匀涂抹创面，后每天涂药一次；阳性对照组采用成纤维细胞生长因子(bfgf）1ml均匀涂抹创面，后每天涂药一次；空白对照组采用生理盐水1ml均匀涂抹创面，后每天涂药一次。每隔3天记录一次创伤面积大小，计算创面愈合率并统计愈合率变化趋势，结果如图6所示。创面愈合率计算公式为：创面愈合率=（原创面面积－剩余创面面积）/原创面面积×100%，式中，原创面面积为麻醉状态下，以透明网格纸描出所有烫伤模型分组创面用药前的图形，用adobephotoshop7.0和osiris软件计算得到的图形面积；剩余创面面积为烫伤后每隔3天，以透明网格纸描出所有烫伤模型分组创面用药前的图形，用adobephotoshop7.0和osiris软件计算得到的图形面积。由图6可以看出，阳性对照组与实验组愈合速度明显比空白组快，并且实验组在愈合率上略高于阳性对照组，表明长双歧杆菌blg-19胞溶物有较好的创伤愈合和疤痕抑制的效果。综上所述，本发明提供的含有长双歧杆菌blg-19胞溶物的产品具有细胞修复、保湿效果。尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求所述的保护范围为准。sequencelisting<110>中科嘉亿营养医学（山东）微生态研究院有限公司<120>具有细胞修复、保湿作用的长双歧杆菌blg-19、应用及产品<130>2021<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>人工合成<400>1agagtttgatcmtggctcag20<210>2<211>19<212>dna<213>人工合成<400>2ggttaccttgttacgactt19<210>3<211>1393<212>dna<213>bifidobacteriumlongum<400>3cgtcttgcttggtggtgagagtggcgaacgggtgagtaatgcgtgaccgacctgccccat60acaccggaatagctcctggaaacgggtggtaatgccggatgctccagttgatcgcatggt120cttctgggaaagctttcgcggtatgggatggggtcgcgtcctatcagcttgacggcgggg180taacggcccaccgtggcttcgacgggtagccggcctgagagggcgaccggccacattggg240actgagatacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcg300caagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatggaggccttcgggttgtaaacctctttt360atcggggagcaagcgagagtgagtttacccgttgaataagcaccggctaactacgtgcca420gcagccgcggtaatacgtagggtgcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagggctc480gtaggcggttcgtcgcgtccggtgtgaaagtccatcgcttaacggtggatccgcgccggg540tacgggcgggcttgagtgcggtaggggagactggaattcccggtgtaacggtggaatgtg600tagatatcgggaagaacaccaatggcgaaggcaggtctctgggccgttactgacgctgag660gagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacggt720ggatgctggatgtggggcccgttccacgggttccgtgtcggagctaacgcgttaagcatc780ccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaagaaattgacgggggcccgcacaa840gcggcggagcatgcggattaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctgggcttgacatg900ttcccgacggtcgtagagatacggcttcccttcggggcgggttcacaggtggtgcatggt960cgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgcc1020ccgtgttgccagcggattatgccgggaactcacgggggaccgccggggttaactcggagg1080aaggtggggatgacgtcagatcatcatgccccttacgtccagggcttcacgcatgctaca1140atggccggtacaacgggatgcgacgcggcgacgcggagcggatccctgaaaaccggtctc1200agttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaaggcggagtcgctagtaatcgcgaat1260cagcaacgtcgcggtgaatgcgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcaagtcatgaa1320agtgggcagcacccgaagccggtggcctaaccccttgtgggatggagccgtctaaggtga1380ggctcgtataaac1393当前第1页12