特异识别副溶血性弧菌的纳米抗体、重组载体、宿主细胞及其应用

1.本发明属于微生物检测领域。具体而言，本发明涉及特异识别副溶血性弧菌的纳米抗体、重组载体、宿主细胞及其应用。


背景技术：

2.副溶血性弧菌是一种食源性病原体，在临床上可引起腹痛、呕吐、腹泻。进食含有该菌的食物可致食物中毒，也称嗜盐菌食物中毒。副溶血性弧菌为革兰氏阴性杆菌，呈弧状、杆状、丝状等多种形状，无牙孢。其也是一种海洋细菌，主要来源于鱼、虾、蟹、贝类和海藻等海产品。随着海产品市场需求的逐渐加大，为保证从鲜食到餐桌各个食品加工环节的安全性，以及其对海产品的低感染剂量，一种快速灵敏的检测方法对于确保我们食品供应的安全至关重要。
3.目前针对副溶血性弧菌所研究的检测方法较多，传统方法包括平板培养法、细胞计数法、生物发光法、阻抗测定法、免疫学方法。目前应用最广泛的是平板计数法和以抗原
‑
抗体反应为基础的免疫学方法。基于微生物的生长原理，传统的食品病原体检测方法必须在微生物实验室中进行，并且通常需要复杂的样品处理，过程较为繁琐，一般需要4
‑
7天才能得到结果。免疫学方法是指以抗原抗体特异性结合反应为基础的检测方法。为了检测特异性的微生物及其毒素，抗体被广泛应用于各种免疫学检测方法研究。该方法中，大部分抗体都来源于鼠或兔血清，其主要评价指标包括特异性和灵敏性，种类包括多克隆抗体和单克隆抗体。虽然多克隆抗体制备过程操作较简单，制备周期也较短，成本较低。但是，应用多克隆抗血清也有其自身弊端，由于动物免疫反应具有可变性和偶然性，多克隆抗体在特异性方面较差。而单克隆抗体则需要较大的成本和时间，不同批次的抗体的效价也会有所差异，此外，这些抗体的生产并不符合当前动物福利的趋势，这促使人们越来越关注基因工程抗体。
4.噬菌体展示纳米抗体技术是将外源的基因片段插入到噬菌体的基因片段中，在噬菌体的衣壳蛋白外壳进行融合表达，此方法简单、快速，可以大批量生产。而纳米抗体作为一种缺乏重链只含有轻链的抗体，分子量只有常规抗体的十分之一，是目前已知的和抗原结合的最小单位，纳米抗体较长的cdr3区使得它可以识别抗原的隐蔽区域。本公司已申请发明专利：cn112707963a
‑
广谱识别沙门氏菌的纳米抗体、重组载体、宿主细胞及其应用，提供的抗沙门氏菌纳米抗体，广谱性好、稳定性强、表达产量高。
5.目前现有纳米抗体中，尚未有针对副溶血性弧菌的纳米抗体，且应用该纳米抗体对副溶血性弧菌的检测技术被提出。


技术实现要素：

6.针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种对副溶血性弧菌有良好特异性、识别能力和结合能力的纳米抗体，以及利用该纳米抗体作为捕获抗体和检测抗体，应用在副
溶血性弧菌的检测技术中，具体通过以下技术实现。
7.特异识别副溶血性弧菌的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列包括氨基酸序列框架区fr1、fr2、fr3、fr4，以及氨基酸序列互补决定区cdr1、cdr2、cdr3；
8.氨基酸序列框架区fr1(纳米抗体的第一段恒定区序列)的氨基酸序列如seq id no:3所示；氨基酸序列框架区fr2(纳米抗体的第二段恒定区序列)的氨基酸序列如seq id no:4所示；氨基酸序列框架区fr3(纳米抗体的第三段恒定区序列)的氨基酸序列如seq id no:5所示；氨基酸序列框架区fr4(纳米抗体的第四段恒定区序列)的氨基酸序列如seq id no:6所示；
9.氨基酸序列互补决定区cdr1(纳米抗体的第一段可变区序列)的氨基酸序列如seq id no:7所示；氨基酸序列互补决定区cdr2(纳米抗体的第二段可变区序列)的氨基酸序列如seq id no:8所示；氨基酸序列互补决定区cdr3(纳米抗体的第三段可变区序列)的氨基酸序列如seq id no:9所示。
10.上述这种纳米抗体，是一种对副溶血性弧菌有很好的结合能力和特异性的抗体。目前针对副溶血性弧菌的单克隆抗体和多克隆抗体均存在稳定性差、制备周期长，制备成本高、且易和其他菌类产生结合，本发明提供的抗副溶血性弧菌纳米抗体，特异性好、稳定性强、表达产量高。
11.利用本发明的纳米抗体建立的双纳米抗体夹心的酶联免疫分析方法，可以特异性检测副溶血性弧菌，检测结果较好。本发明可以解决现有的检测方法特异性差、成本较高的问题，使双纳米抗体夹心的酶联免疫分析方法得到更广泛应用。
12.优选地，上述特异识别副溶血性弧菌的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如seq id no:1所示。
13.优选地，编码上述纳米抗体的核苷酸序列如seq id no:2所示。利用该核苷酸序列，通过转录、翻译，即可合成上述对应氨基酸序列的纳米抗体。
14.本发明还提供了上述纳米抗体的应用方法，即特异识别副溶血性弧菌的检测试剂盒，含有特异性识别副溶血性弧菌的纳米抗体。
15.例如，利用上述纳米抗体为检测试剂，制备双纳米抗体夹心的酶联免疫分析检测试剂盒，选取特异识别副溶血性弧菌的纳米抗体作为捕获抗体，噬菌体展示的纳米抗体作为检测抗体进行双抗体夹心的酶联免疫分析法检测副溶血性弧菌。采用该试剂盒的抗副溶血性弧菌检出限为4.29
×
106cfu/ml。
16.本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体上含有上述编码纳米抗体的核苷酸序列。
17.一种宿主细胞，所述宿主细胞内含有上述的重组载体。
18.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
19.(1)本发明公开一种特异型抗副溶血性弧菌的纳米抗体，对其他非副溶血性弧菌均不结合，可以特异识别副溶血性弧菌，能与副溶血性弧菌的不同位点结合，结合能力强，特异性好，热稳定性高，纳米抗体在37～80℃条件下，仍能保持较好的和抗原结合的能力。
20.(2)本发明提供的特异型抗副溶血性弧菌纳米抗体，稳定性强、制备周期短，制备成本低、特异性好、表达产量高，解决目前副溶血性弧菌的多克隆抗体在特异性方面较差、以及单克隆抗体需要较大的成本和时间，不同批次的抗体的效价也会有所差异以及易和其
他菌类产生结合的问题。
21.(3)本发明解决副溶血性弧菌检测方法特异性差、成本较高的问题，建立的双纳米抗体夹心的酶联免疫分析方法可以应用于海产品中的副溶血性弧菌检测，检测结果精确，使双纳米抗体夹心的酶联免疫分析方法得到更广泛应用。
附图说明
22.图1为实施例的第一轮pcr扩增vhh基因电泳鉴定图；
23.图2为实施例的第二轮pcr扩增vhh基因电泳鉴定图；
24.图3为淘选的阳性克隆鉴定elisa结果；
25.图4为抗副溶血性弧菌纳米抗体vp+nb1的sds
‑
page电泳图；
26.图5为抗副溶血性弧菌纳米抗体vp+nb1的热稳定性分析；
27.图6为抗副溶血性弧菌纳米抗体vp+nb1的特异性分析；
28.图7为抗副溶血性弧菌纳米抗体vp+nb1检测副溶血性弧菌的标准曲线。
具体实施方式
29.下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
30.实施例
31.1、抗副溶血性弧菌噬菌体展示纳米抗体文库的构建
32.1.1骆驼的免疫：
33.选取一只身体健康的、未经免疫任何抗原的骆驼，将等体积的灭活的副溶血性弧菌与弗式完全佐剂的乳化混合物以108cfu/ml的浓度对双峰驼初免，之后的免疫采用弗氏不完全佐剂对抗原乳化，每隔2周加强免疫1次，共免疫6次。每次免疫后1周，收集骆驼血液检测血清中的抗体效价。
34.1.2血液总rna的提取：第五次免疫后，取骆驼外周血，按照rna提取试剂盒的操作步骤提取总rna。
35.1.3反转录获得cdna：
36.以获得的总rna为模板，oligo(dt)
15
为引物进行反转录，合成cdna第一链，获得cdna文库。
37.1.4纳米抗体(vhh)基因片段的扩增：
38.以合成的cdna为模板，call001和call002为引物，进行第一轮pcr扩增。
39.反应体系如下：
40.10
×
ex taq buffer，5μl
41.50mm mgso4，2μl
42.10mm dntp，1μl
43.10mm call001引物，1μl
44.10mm call002引物，1μl
45.ex taq dna聚合酶，0.1μl
46.cdna模板，2μl
47.ddh2o补至总体系，50μl；
48.涡旋混匀，短暂离心后，进行第一轮pcr扩增反应，pcr条件为：
49.(1)94℃，2min；
50.(2)94℃，30s；
51.(3)55℃，30s；
52.(4)68℃，1min；
53.上述pcr步骤(2)
‑
(4)扩增30个循环；
54.(5)68℃，5min。
55.上述方案中，所述pcr扩增vhh其正向引物call001(见seq id no:10)为：
[0056]5’‑
gtcctggctgctcttctacaagg
‑3’
[0057]
反向引物call002(见seq id no:11)为：
[0058]
call002:5
’‑
ggtacgtgctgttgaactgttcc
‑3’
[0059]
pcr产物经过1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收700bp大小的dna片段，为第一轮pcr扩增vhh基因，具体的电泳鉴定图见图1，图中m表示dl2000marker，1表示第一轮pcr扩增vhh基因产物。
[0060]
以第一轮pcr扩增vhh基因产物为模板，cam
‑
for和cam
‑
back为引物，进行第二轮pcr扩增。
[0061]
反应体系如下：
[0062]
10
×
ex taq buffer，5μl
[0063]
50mm mgso4，2μl
[0064]
10mm dntp，1μl
[0065]
10mm cam
‑
for引物，1μl
[0066]
10mm cam
‑
back引物，1μl
[0067]
ex taq dna聚合酶，0.1μl
[0068]
cdna模板，2μl
[0069]
ddh2o补至总体系，50μl；
[0070]
涡旋混匀，短暂离心后，进行第二轮pcr扩增反应，pcr条件为：
[0071]
(1)94℃，2min；
[0072]
(2)94℃，30s；
[0073]
(3)55℃，30s；
[0074]
(4)68℃，1min；
[0075]
上述pcr步骤(2)
‑
(4)扩增20个循环；
[0076]
(5)68℃，5min。
[0077]
上述方案中，所述pcr扩增vhh其正向引物cam
‑
for(见seq id no:12)为：
[0078]
cam
‑
for：
[0079]5’‑
catgccatgactgtggcccaggcggcccaggtgcagctcgtggagtctggrggagg
‑3’
[0080]
反向引物cam
‑
back(见seq id no:13)为：
[0081]
cam
‑
back:5
’‑
catgccatgactcgcggccggcctggccggagacggtgaccagggt
‑3’
[0082]
pcr产物经过1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收400bp大小的dna片段，即为vhh片段，具体的电泳图见图2，图2中m表示dl 2000marker，1表示第二轮pcr扩增vhh基因产物。
[0083]
1.5载体的构建
[0084]
酶切处理pcomb3xss：
[0085]
按照如下体系配制反应液：
[0086]
pcomb3xss vector，2μl
[0087]
sfi i，1μl
[0088]
10
×
buffer，2μl
[0089]
ddh2o补至总体系，20μl
[0090]
酶切产物经过1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，用试剂盒纯化回收3400bp大小的载体片段。
[0091]
vhh基因与双酶切处理的pcomb3xss载体的连接，按照如下体系进行in
‑
fusion连接：
[0092]
酶切后的pcomb3xss vector，1.4μg
[0093]
vhh基因，495ng
[0094]
10
×
buffer，20μl
[0095]
t4 ligase，10μl
[0096]
ddh2o补至总体系，200μl
[0097]
16℃过夜反应16h，用琼脂糖凝胶dna纯化试剂盒进行回收，
‑
20℃保存待用。
[0098]
1.6连接产物的电转化
[0099]
将e.colier2738感受态细胞置于冰上融化，向50μl感受态细胞中加入3μl上述连接产物，轻轻混匀后迅速转移到预冷的电转杯中，放在bio
‑
rad电转化仪上进行电转化，电转化条件：1.8kv，200ω，25μf，电转化后立即在电转化杯中加入1ml预热的soc液体培养基，吹打后转移至一干净的灭菌1.5ml摇菌管中。如上所述，进行十次电转，将十次电转后的菌液混合，37℃缓慢振摇复苏1h。
[0100]
1.7抗副溶血性弧菌噬菌体展示纳米抗体文库的构建
[0101]
将复苏后的菌液全部转入200mlsb培养基中，于37℃，250rpm振摇至od600值为0.5时，加入1ml，1
×
10
11
pfu的辅助噬菌体m13ko7，37℃静置1h后，加入卡那霉素至终浓度为70μg/ml，并振摇过夜。次日，将过夜菌于4℃，10000rpm离心15min，将上清转移至无菌的离心瓶中，加入1/5体积的peg/nacl，于冰上静置2h后，4℃，12000rpm离心20min，用10ml无菌的0.5％，bsa的pbs缓冲液重悬沉淀，溶解沉淀得到扩增后的抗副溶血性弧菌噬菌体展示纳米抗体文库。
[0102]
2、抗副溶血性弧菌纳米抗体的淘选与鉴定
[0103]
2.1抗副溶血性弧菌纳米抗体的淘选：
[0104]
以灭活的副溶血性弧菌为包被原，每孔100μl，浓度为108cfu/ml(包被的菌浓度逐轮递减)，加入300μl，3％脱脂奶粉封闭1h，用含0.05％，tween
‑
20的pbst溶液洗板3次，每孔加入100μl噬菌体展示纳米抗体文库，37℃孵育1h，洗板6次，加入100μl甘氨酸溶液(ph值＝2.2)洗脱，立即加入tris
‑
hcl中和洗脱的噬菌体。取10μl洗脱的噬菌体测定滴度，剩余的用
于侵染培养至对数期的er2738菌株进行扩增，扩增后的噬菌体立即用于后续淘选。第二轮、第三轮淘选过程中，包被抗原浓度为1
×
108cfu/ml，其余淘选过程与第一轮淘选相同，共进行3轮淘选。第三轮淘选结束后，取10μl噬菌体测定滴度，次日，在平板上随机挑取50个克隆，进行噬菌体扩增，扩增的噬菌体采用间接elisa进行阳性克隆鉴定。
[0105]
2.2抗副溶血性弧菌纳米抗体的鉴定：
[0106]
通过间接elisa对淘选的噬菌体展示纳米抗体进行阳性克隆鉴定。具体操作为：用一定浓度的灭活的副溶血性弧菌4℃包被过夜，用3％的脱脂奶粉封闭后，加入100μl噬菌体展示的纳米抗体，37℃静置1h，弃上清，用0.05％的pbst溶液洗板6次，加入100μl酶标抗m13二抗，37℃孵育1h。洗板6次，加入tmb底物显色，孵育15min，加入50μlh2so4终止反应，在450nm读取各孔的od值，如图3所示。计算p/n值，p/n值≥2.1的孔作为阳性孔进行测序分析。
[0107]
每轮淘选的包被抗原浓度递减，可以淘选到亲和力较高的纳米抗体，通过间接elisa筛选得到了能够和副溶血性弧菌结合的阳性克隆，用bioedit软件对测序结果进行分析，登录imgt网站(http://www.imgt.org/),对抗体基因序列进行分析，确定抗体序列的框架区和互补决定区。
[0108]
3、抗副溶血性弧菌纳米抗体的制备
[0109]
3.1以噬菌体扩增的方式制备噬菌体展示的纳米抗体phage+nb28
[0110]
具体操作步骤如下：将100ml，e.coli er2738感受态细胞，37℃下200rpm震荡培养至od600为0.6左右，加入10μl淘选得到的噬菌体展示的纳米抗体phage+nb28，加入1ml辅助噬菌体m13ko7(感染复数为20：1)，37℃静置30min，37℃下250rpm过夜培养；次日，离心收集上清，加入1/5体积peg
‑
nacl溶液，颠倒混合均匀后沉淀噬菌体；离心收集沉淀，得到噬菌体展示的纳米抗体，留10μl用于滴度测定。
[0111]
3.2以蛋白表达的方式制备可溶性的纳米抗体vp+nb1
[0112]
提取噬菌体展示纳米抗体vp+nb1的质粒，热击转化至表达菌株top10f
′
中。次日，挑取平板上的单克隆进行扩大培养。当od600＝0.6时，加入iptg诱导表达，次日，离心收集菌体沉淀，加入细胞裂解液，使细胞裂解，收集可溶性蛋白，经过镍柱纯化，sds
‑
page对纳米抗体进行鉴定。
[0113]
结果见图4，图4中m表示protein marker；图4中第二个孔表示抗副溶血性弧菌纳米抗体vp+nb1。用nanodrop测纳米抗体浓度，通过计算可得该纳米抗体的产量为10mg/l培养基。
[0114]
抗副溶血性弧菌纳米抗体vp+nb1的氨基酸序列框架区fr1的氨基酸序列如seq id no:3所示；
[0115]
抗副溶血性弧菌纳米抗体vp+nb1的氨基酸序列框架区fr2的氨基酸序列如seq id no:4所示；
[0116]
抗副溶血性弧菌纳米抗体vp+nb1的氨基酸序列框架区fr3的氨基酸序列如seq id no:5所示；
[0117]
抗副溶血性弧菌纳米抗体vp+nb1的氨基酸序列框架区fr4的氨基酸序列如seq id no:6所示；
[0118]
抗副溶血性弧菌纳米抗体vp+nb1的氨基酸序列互补决定区cdr1的氨基酸序列如seq id no:7所示；
[0119]
抗副溶血性弧菌纳米抗体vp+nb1的氨基酸序列互补决定区cdr2的氨基酸序列如seq id no:8所示；
[0120]
抗副溶血性弧菌纳米抗体vp+nb1的氨基酸序列互补决定区cdr3的氨基酸序列如seq id no:9所示；
[0121]
抗副溶血性弧菌纳米抗体vp+nb1的氨基酸序列如seq id no:1所示；
[0122]
抗副溶血性弧菌纳米抗体vp+nb1的核苷酸序列如seq id no:2所示。
[0123]
4、抗副溶血性弧菌纳米抗体热稳定性分析
[0124]
将一定浓度的灭活的副溶血性弧菌包被于酶标板上，4℃包被过夜，次日，pbst洗板3次，加入在37℃、50℃、60℃、70℃、80℃下处理15min的纳米抗体溶液，37℃孵育1h，pbst洗板3次，加入抗ha的酶标二抗，37℃孵育1h，pbst洗板6次，加入tmb底物显色15min，用2mh2so4终止反应，在450nm处测定吸光度值。比较不同温度处理对纳米抗体活性的影响，结果如图5，纳米抗体在37～80℃条件下，能保持较好的和抗原结合的能力，说明纳米抗体有一定的热稳定性。
[0125]
5、抗副溶血性弧菌纳米抗体的特异性分析
[0126]
利用双纳米抗体夹心方法，以一种副溶血性弧菌和5种非副溶血性弧菌为分析物，测定纳米抗体vp+nb1和其他的食源性致病菌的结合能力。在酶标板上4℃包被15μg/ml的抗副溶血性弧菌纳米抗体，次日，每孔加入300μl脱脂奶粉封闭1h，洗板3次，加入一定浓度的副溶血性弧菌和阪崎肠杆菌、福氏志贺氏菌、李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌5种非副溶血性弧菌，孵育1h后，洗板3次，加入100μl噬菌体展示的纳米抗体，37℃孵育1h，pbst洗板三次后，加入抗m13
‑
hrp二抗，37℃静置1h，洗板六次，加入tmb溶液显色15min，加入硫酸溶液终止反应，通过测定各孔在450nm下的吸光度值判断纳米抗体的特异性。结果如图6，纳米抗体vp+nb1对其他5种非副溶血性弧菌均不结合。实验结果表明纳米抗体vp+nb1可以特异识别副溶血性弧菌，结合能力强，特异性好。
[0127]
6、建立双纳米抗体夹心的酶联免疫分析方法
[0128]
根据筛选配对，选取抗副溶血性弧菌纳米抗体vp+nb1作为捕获抗体，噬菌体展示的纳米抗体phage+nb28作为检测抗体进行双抗体夹心的酶联免疫分析法检测副溶血性弧菌。具体步骤如下：将捕获抗体vp+nb1包被于96孔酶标板上，每个孔的包被浓度为15μg/ml，4℃过夜；次日，弃上清液，用0.05％的pbst洗板三次后，用3％的脱脂奶粉封闭1h，梯度稀释肠炎副溶血性弧菌，其浓度为7.81
×
105～1
×
108cfu/ml，每孔加入100μl不同浓度的菌悬液，37℃孵育1h。0.05％pbst洗板三次，加入100μl噬菌体展示的纳米抗体phage+nb28，37℃孵育1h，洗板三次，加入抗m13的酶标二抗，37℃孵育1h。洗板六次，加入tmb底物显色液，室温显色15min，加入2m硫酸溶液终止反应，在450nm处，检测各孔的od值，绘制标准曲线，标准曲线如图7所示。该方法的检出限为4.29
×
106cfu/ml。