一种海洋来源耐盐菌胶团形成菌新种及其应用

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种海洋来源的耐盐菌胶团形成菌新种的分离鉴定及其在污水处理中的应用。

背景技术：

近些年来，随着人口数量的激增和活动对自然生态平衡打破的加剧，引起了很多破坏生态环境的恶性结果，水体环境的严重污染尤其是工业废水就是其中的一类。工业废水多来源于化工、农业、医药等行业；在工业生产中，需要消耗大量的水资源，为了降低水资源的用量，行业内通常采取循环利用水资源的方法，从而形成了高盐水；总的来说，工业高盐水具有排放量较大、来源广、含盐量高、成分复杂，而且不同行业产生的高盐水差异较大的特点。在医药和农药及其中间体的制备过程中，盐析过程、化学合成、酸碱中和等工艺均会产生含盐量比较高的废水，而其大部分都具有高盐度的特性，其盐度含量多在10000mg/l以上。这类废水除了含有有机污染物外，还含有钙、镁、钠、氯和硫酸根等大量可溶性无机盐离子及药物残留，甚至含有放射性物质，另外，当未处理的高盐度废水进入地下水体后，会使地下水的硬度变大，对人们的日常和身体健康产生很大的迫害。长期饮用含高盐度的水，会损坏牙齿以及危害人体健康，严重的甚至会招致肾结石、胆结石等疾病；因此，高盐废水给人们的生活带来的危害是不可忽视的。目前，国内外传统的高盐废水处理方法主要包括物理法、化学法、物理-化学法、人工湿地处理法、生物法。生物法是通过微生物菌群对工业高盐废水中所含的污染物质进行处理，处理成本相对较低，但是条件苛刻，首先盐度不能太高，否则超过了微生物的耐受范围，尤其是菌胶团形成菌耐盐能力普遍较差，将会使处理效果大打折扣。因此，耐盐菌胶团形成菌对提升活性污泥法对高盐污水处理的效果作用巨大。

海水鱼由于其营养价值高、口感鲜美而深受人们喜爱，随着经济的快速发展及人类需求的日益增长，人们对海产品的种类、质量及需求量都有了更高的要求，沿海地域海产捕捞频繁化，过渡捕捞、海水污染、资源消耗等原因导致海洋渔业资源衰竭，但其捕捞量下降、供应量低、养殖困难、养殖成本高等因素导致海水鱼在市场上的售价偏高，这不仅不利于人们生活水平的提升，也限制了海洋渔业的可持续发展。海水养殖应运而生，海水养殖业因其具有养殖效率高、占地面积少、方式多样化、节约水资源等优点而蓬勃发展，需求量增加，我国海水养殖业也向集约化、高密度、高产出模式的转变，但在高密度、集约化养殖模式下，饵料投放、排出的粪便和鱼药滥用都会直接或间接影响水质平衡。氨氮、亚硝酸盐、硫化物及cod等是养殖海水中常见的有害物质。目前主要采用化学、物理和生物的方法进行去除。

本发明分离鉴定出一株海洋来源的苔藓球菌属的新种(tessaracoccusnanhaienis)syl-2，该菌株具有较好的耐盐特性和稳定的菌胶团形成能力，因此其在高盐化工污水、医药废水的处理、海产品的养殖等方面具有巨大潜力。

技术实现要素：

本发明提供了一种海洋来源的苔藓球菌新种tessaracoccusnanhaienissyl-2，该菌株具有较好的耐盐特性和稳定的菌胶团形成能力，在污水处理(尤其是高盐污水)方面具有巨大潜力。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明在活性污泥样品中分离出一株可稳定形成菌胶团的菌株syl-2，与已报道的菌株相比，该菌株在16srrna亲缘性、生理生化特性等方面具有显著差异，为一菌类新种，将其命名为苔藓球菌tessaracoccusnanhaienissyl-2，2019年12月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m20191064，保藏地址为：中国武汉武汉大学。

苔藓球菌tessaracoccusnanhaienissyl-2的耐盐能力为0-6％，与其他菌胶团形成菌相比明显具有更强的耐盐能力，对污水(尤其是高盐污水)也有较好的处理效果。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的海洋来源的苔藓球菌tessaracoccusnanhaienissyl-2为菌类新种，与已报道的菌株及已发表的其它细菌菌种相比在16srrna亲缘性、生理生化特性方面具有显著差异，为一菌类新种。这为研究菌胶团与细菌耐盐的关系、菌胶团形成成菌耐盐机理等提供了良好的研究材料，该菌也可能在高盐化工业污水、医药废水的处理、海产品的养殖等方面具有应用潜力。

附图说明

图1为苔藓球菌tessaracoccusnanhaienissyl-2基于16srrna基因构建的生物进化树。

图2为苔藓球菌tessaracoccusnanhaienissyl-2的biologgenш碳源利用图片和对照图表。

图3为苔藓球菌tessaracoccusnanhaienissyl-2在tsb培养基中生长32h的光学显微镜照片。

图4为苔藓球菌tessaracoccusnanhaienissyl-2在tsb培养基中生长32h的透射电子显微镜照片。

图5为苔藓球菌tessaracoccusnanhaienissyl-2在tsb培养基中生长48h后，静置和震荡后的形态。

图6为苔藓球菌tessaracoccusnanhaienissyl-2对纺织污水净化情况(左处理前，右处理后)。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

本发明实施例所用培养基如下：

r2a液体培养基的配方(1l)：胰蛋白胨0.5g，酵母提取液0.5g，淀粉0.5g，酸水解酪素0.5g，丙酮酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.024g，调节ph7.0±7.2；

r2a固体培养基的配方(1l)：胰蛋白胨0.5g，酵母提取液0.5g，淀粉0.5g，酸水解酪素0.5g，丙酮酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.024g，琼脂15g，调节ph7.0±7.2；

液体种子培养集(tsb)的配方(1l)：胰酪蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，d-葡萄糖2.5g，nacl5g，k2hpo42.5g，ph7.3±0.2；

固体种子培养基(tsba)的配方(1l)：胰酪蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，d-葡萄糖2.5g，nacl5g，k2hpo42.5g，ph7.3±0.2，琼脂15g。

下面结合实施例对本发明进行详细说明，以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1苔藓球菌tessaracoccusnanhaienissyl-2的分离鉴定：

从香港某污水处理厂采集活性污泥样品，在超净工作台内用无菌水对其进行梯度(10^-l、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5)稀释，吸取100μl稀释液涂布在r2a培养基固体平板上，28℃，培养48h；挑取固体平板上单克隆接种到1.5ml的离心管中用r2a液体培养基培养；筛选能够稳定形成菌胶团的菌株转接扩大到10ml离心管中用r2a液体培养基培养，筛选扩大后依然可以稳定形成菌胶团的菌株；吸取上述10μl菌液至r2a固体平板上，进行划线纯化，28℃，培养48h，认真观察平板菌落单一性并挑取单克隆接种到12ml玻璃培养管中扩大培养，获得纯化的菌株syl-2。

离心收集菌体，提取基因组，利用已发表的16s通用引物(27f和1492r，引物序列为27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’；1492r：5’-ggttaccttgttacgactt-3’)对菌株syl-2的16srrna基因序列进行扩增和测序，pcr扩增产物送擎科生物有限公司(tsingkebio)初步测序。测序序列在ncbi进行blastn比对，最终测得菌株syl-2与近源模式株最高同源性为95.66％，由于该菌株的16srrna与已知数据库同源性低于97％，有较大可能性为细菌新种。

为进一步确认，进行pmd-18t载体的构建确认测序与新种鉴定。具体是使用高保真酶分别扩增出上下游同源臂序列(27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’；1492r：5’-ggttaccttgttacgactt-3’)，上述扩增出的序列与pmd-18t载体相连接，重组载体通过热激转化进入dh5α化学感受态细胞；将含有重组载体的dh5α在37℃复苏，然后涂布到含有氨苄青霉素的lb固体平板上；从lb固体平板上挑取菌落为模板进行菌落pcr扩增，选取扩增片段大小正确的克隆进行液体培养，提质粒测序(m13-47:5’-cgccagggttttcccagtcacgac-3’；m13-48:5’-gagcggataacaatttcacacagg-3’)；质粒测序剪裁处理结果在ncbi进行blastn比对，发现其16srrna基因与tessaracoccusarenaestraincau1319(nr156959)的序列同源性最高，相似性为95.85％(种间分布小于97％)。利用16srrna基因构建系统发育树(图1)，与其它的clade相比，菌株syl-2与tessaracoccusclade为一枝，其中与tessaracoccusarenaecau1319模式菌株最为相近。对菌株syl-2全基因组进行测序，利用服务器ezbiocloud把菌株syl-2全基因组与最相近的3株模式菌株进行平均核苷酸同源性(ani)分析和dna–dna分子杂交(ddh)，得其ani值为75.23–77.46％(种间分布65-90％)，ddh值为19.2–26.1％(种间分布小于50％)；因此，菌株syl-2为tessaracoccus属新种细菌。

与已报道的菌株及已发表的其它细菌菌种相比，菌株syl-2在16srrna亲缘性、生理生化特性方面具有显著差异，为一菌类新种。syl-2的biologgenш碳源利用生理生化鉴定如图2；syl-2在营养琼脂(tsba)培养基上繁殖生长形成圆形菌落，在tsb琼脂固体培养基上培养2天后，单克隆菌落直径约为0.8-2.1mm，呈半透明的乳白色、圆形、光滑扁平微凸起，有完整的边缘。该菌镜检为革兰氏阴性，单个、成对或成堆，能够形成稳定的菌胶团、无孢子形成的圆球状新种细菌，菌体直径大约0.9-2.1μm。不水解明胶、精氨酸、丙氨酸、谷氨酸、组氨酸、丝氨酸等；可利用糊精、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、蔗糖、水苏糖、葡萄糖和果胶等为唯一碳源生长；光学显微照片见图3，透射电镜照片见图4；液体培养玻璃管中形态如图5。

综上所述，菌株syl-2属于tessaracoccus属的一新种，该菌株由中国科学院水生生物研究所分子微生物与生物技术实验室邱东茹研究员、李书杨博士生根据国际双名法(国际命名规则：属名+种名)命名为海洋来源新种菌tessaracoccusnanhaienissyl-2，属名为tessaracoccus，种名为nanhaienis，编号为syl-2。tessaracoccusnanhaienissyl-2已于2019年12月18日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为cctccno：m20191064，保藏地址为：中国武汉武汉大学。

实施例2不同菌胶团形成菌耐盐能力的对比

为了比较不同菌胶团形成菌的耐盐能力，通过改变r2a液体培养基盐度确定耐盐区间。挑取r2a平板上的单克隆菌落接种到装有50ml的r2a液体培养基的锥形瓶中培养，以最适生长温度震荡培养2天左右，观察待其大致处于对数生长期时，吸取新鲜的菌液按1％(对盐度影响不足以影响实验结果)接种量转接到已配制好的100ml的含量为0～15％nacl(w/v，浓度梯度为0.5％)盐度的r2a液体培养基中，根据已确定的最适生长温度震荡培养3-4天，然后离心收集菌体，用电子天平称取湿重，根据菌体湿重质量确定其耐盐区间。不同菌胶团形成菌耐盐能力对比见表1。

表1不同菌胶团形成菌耐盐能力比较

菌株syl-2的耐盐能力为0-6％，与其他菌胶团形成菌相比明显具有更强的耐盐能力，在盐度低于6％的高盐污水处理中具有开发潜力。

实施例3tessaracoccusnanhaienissyl-2对高盐高污水cod去除情况

我们从武汉阳逻纺织厂采集纺织污水，测得其盐度大约为3.65％，其cod约为373.76mg/l。挑取菌株tessaracoccusnanhaienissyl-2单克隆，在2ml的r2a液体培养基中培养48h，用灭菌双蒸水洗涤两次，加入到200ml纺织污水中，摇床培养24h。发现菌株tessaracoccusnanhaienissyl-2对纺织污水有明显净化效果，纺织污水cod去除率超过65％，净化后明显澄清(见表2、图6)。表2为tessaracoccusnanhaienissyl-2对纺织污水cod去除情况