一种腺苷参与的nmn半合成方法
技术领域
1.本发明涉及β
‑
烟酰胺单核苷酸(nmn)合成技术领域，特别涉及一种腺苷参与的nmn半合成方法。
背景技术：
2.β
‑
烟酰胺单核苷酸(nmn)是肌体合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)的直接前体，补充nmn是提升肌体nad的含量水平的最有效途径，这对于促进肌体正常的新陈代谢具有广泛而深远的健康意义。因为长者nad水平减少，而从食物中不能获得足够的nmn，故而nmn有望成为大规模应用的膳食补充剂。
3.目前，nmn的现有合成技术有发酵法、化学合成法、半合成法及全酶法四种方法。其中发酵法需要构建产生nmn微生物菌种，在此微生物大量培养繁殖的过程中，由菌体细胞合成nmn。由于各个物种包括低等的单细胞生物体内催化合成 nmn的关键酶(nampt，烟酰胺磷酸核糖转移酶)的基础活性都普遍很低，使构建高效表达nmn的菌种异常困难，又因为nmn的合成路线长，涉及多酶体系及天然的分解酶系统，所以高效大规模的发酵法生产nmn的生产方法十分困难，工艺成本高，产品没有市场竞争力。化学合成法是以烟酰胺(或烟酸)、四乙酰核糖、三苯氧磷等基础原料，用化学方法先合成烟酰胺核糖(nr)，再进一步将nr磷酸化得到nmn。该方法的主要问题在于第二步的化学磷酸化步骤涉及易燃易爆及剧毒，大规模产业化面临严重的环保与安监问题，也存在化学对映体杂质及毒性原料及溶剂残留等问题，其产品长期人体应用的安全性疑虑是面对消费者难以消除的问题。半合成法是在化学合成nr的基础上用酶法使nr磷酸化而得到nmn，该方法兼具化学法及酶法的优缺点，其主要问题是既有化学法的溶剂及毒性成分残留风险，酶法磷酸化步骤也需要昂贵的三磷酸腺苷(atp)，成本较高。全酶法是用烟酰胺、核糖及atp(腺嘌呤核苷三磷酸)等为基础原料，用一系列酶的连环催化形成nmn。该方法优势在环保与安全，难点在于涉及多种酶的表达、纯化与固定化，现有技术存在规模化生产困难，酶的成本太高。
4.现有四种nmn的合成方法中，半合成法是当前合成nmn的主流方法。该方法的起始原料可以是烟酰胺(或烟酸)及四乙酰核糖，先用化学方法合成成nr，再用nr与atp在特定激酶的催化下生成nmn，或直接以nr为原料做酶促反应生产nmn。半合成法的核心步骤是nr的酶促磷酸化，由atp提供磷酸基给nr形成 nmn，而atp则变成了二磷酸腺苷(adp)，反应式为：nr+atp
→
nmn+adp，催化这一反应的酶为烟酰胺核糖激酶(nrk)。为了减少atp的用量，通常将adp 与多磷酸盐(焦磷酸钠、三聚磷酸钠或六片磷酸钠等)再做酶促反应转化成atp，实现atp的重复利用，反应式为：adp+ppi(焦磷酸)
→
atp+pi(磷酸盐)，催化这一反应的酶为腺苷酸磷酸转移酶(ppk2)。这两步酶促反应(nr的磷酸化及atp的再生)可以分开做也可以合在一起反应。其工艺难点主要有二，一是反应累积大量的磷酸盐会干扰进一步反应，磷酸盐的分离去除工艺难度大，也影响atp的回收率；二是反应系统涉及两个酶，酶的用量大成本高，同时不可避免地带来的杂酶也多，nr、nmn、atp、adp等的分解副反应程度也高，反应体系内会存在因副反应而产生的烟酰胺、核糖、adp、amp、nr、腺苷、腺嘌呤及磷酸盐等，因而体系成
分变得复杂而不易控制，致使nmn产品的纯化过程困难而成本高企，产品质量的稳定性也难以控制。
技术实现要素：
5.本发明的一个目的在于提供一种腺苷参与的nmn半合成方法，其中所述腺苷参与的nmn半合成方法相对于现有的半合成法能够简化nmn产品的纯化工艺而具有较低的成本。
6.本发明的一个目的在于提供一种腺苷参与的nmn半合成方法，其中所述腺苷参与的nmn半合成方法兼顾化学法和酶法的优点，在保障nmn产品的合成效率的同时能够降低排放，对应具有较低的生产成本和环境成本。
7.本发明的一个目的在于提供一种腺苷参与的nmn半合成方法，其中所述腺苷参与的nmn半合成方法相对于现有的半合成法通过采用廉价的腺苷代替atp，和在反应中引入酵母细胞依能量代谢将腺苷转化为atp的方式，能够结合现有nr 的磷酸化过程实现atp的重复利用而省去了atp的回收工艺，和将现有nr的磷酸化过程形成的磷酸盐作为反应物而省去了磷酸盐的去除工艺，如此以基于所述腺苷的参与简化nmn产品的纯化工艺。
8.本发明的一个目的在于提供一种腺苷参与的nmn半合成方法，其中所述腺苷参与的nmn半合成方法相对于现有的半合成法通过采用廉价的腺苷代替atp，和在反应中引入酵母细胞依能量代谢将腺苷转化为atp的方式，能够结合现有nr 的磷酸化过程实现atp的重复利用而降低所述腺苷的摩尔用量，并由于所述腺苷的价格远低于atp的价格，相应nmn产品的原料成本被显著降低而具有较低的生产成本。
9.本发明的一个目的在于提供一种腺苷参与的nmn半合成方法，其中所述腺苷参与的nmn半合成方法相对于现有的半合成法通过采用廉价的腺苷代替atp，和在反应中引入酵母细胞依能量代谢将腺苷转化为atp的方式，能够结合现有nr 的磷酸化过程实现atp的重复利用和将现有nr的磷酸化过程形成的磷酸盐作为反应物，即分离纯化nmn产品后的其他反应物与生成物能够被重复利用而降低排放，相应nmn产品的生产对环境友好而具有较低的环境成本。
10.本发明的一个目的在于提供一种腺苷参与的nmn半合成方法，其中所述腺苷参与的nmn半合成方法以nr、磷酸盐、腺苷以及蔗糖为原料，和以nrk和酵母细胞为催化剂，将atp的生成、nr磷酸化及atp的利用统一在一个反应体系内进行，即可完成nmn的高效合成，在兼顾化学法的优点保障nmn产品的合成效率的同时，各种反应物(nr、磷酸盐、腺苷、蔗糖等)可被基本消耗完成以兼顾酶法的优点降低排放，因而相对于现有的半合成法简单易行，成本低廉。
11.根据本发明的一个方面，本发明提供一种腺苷参与的nmn半合成方法，所述腺苷参与的nmn半合成方法包括同一反应体系下的以下步骤：
12.(a)腺苷、磷酸盐以及可被酵母细胞代谢的糖类在酵母细胞的催化作用下反应生成atp的步骤；和
13.(b)nr的酶促磷酸化步骤，对应nr和atp在nrk的催化作用下反应生成nmn和adp的步骤。
14.在一实施例中，其中在所述的腺苷参与的nmn半合成方法的反应体系中，nr 原料选自商用的nr纯品、含有nr的固体以及含有nr的液体中的至少一种。
15.在一实施例中，其中在所述的腺苷参与的nmn半合成方法的反应体系中，可被酵母细胞代谢的糖类选自葡萄糖、蔗糖、淀粉以及甘油中的至少一种。
16.在一实施例中，其中在所述的腺苷参与的nmn半合成方法的反应体系中，nrk 酶以液酶形态和固定化酶形态中的至少一种原始形态存在。
17.在一实施例中，其中在所述的腺苷参与的nmn半合成方法的反应体系中，酵母细胞是可进行氧化磷酸化代谢的酵母细胞。
18.在一实施例中，其中在所述的腺苷参与的nmn半合成方法的反应体系中，酵母细胞选自壁赤酵母和酿酒酵母中的至少一种。
19.在一实施例中，其中在所述的腺苷参与的nmn半合成方法的反应体系中，进一步添加有金属离子。
20.在一实施例中，其中在所述的腺苷参与的nmn半合成方法的反应体系中，添加的金属离子选自镁离子和锰离子中的至少一种。
21.在一实施例中，其中在所述的腺苷参与的nmn半合成方法的反应体系中，腺苷与nr的摩尔比范围是0.01～1。
22.在一实施例中，其中在所述的腺苷参与的nmn半合成方法的反应体系中，nr 与磷酸盐的摩尔比范围是1～20。
23.在一实施例中，其中在所述的腺苷参与的nmn半合成方法的反应体系中，酵母细胞是冰冻储存过的湿酵母。
24.在一实施例中，其中在所述的腺苷参与的nmn半合成方法的反应体系中，进一步添加有甲苯、正丁醇以及吐温20中的至少一种有机试剂。
25.在一实施例中，其中所述步骤(a)在所述步骤(b)之前被启动，以为所述步骤(b)的反应提供atp而形成所述步骤(a)和所述步骤(b)在同一反应体系中相互促进的反应状态。
26.在一实施例中，其中所述的腺苷参与的nmn半合成方法进一步包括adp和磷酸盐在酵母细胞作用下再生为atp的步骤。
具体实施方式
27.以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。在以下描述中界定的本发明的基本原理可以应用于其他实施方案、变形方案、改进方案、等同方案以及没有背离本发明的精神和范围的其他技术方案。
28.本领域技术人员应理解的是，在本发明的揭露中，术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此上述术语不能理解为对本发明的限制。
29.可以理解的是，术语“一”应理解为“至少一”或“一个或多个”，即在一个实施例中，一个元件的数量可以为一个，而在另外的实施例中，所述元件的数量可以为多个，术语“一”不能理解为对数量的限制。
30.本发明提供一种腺苷参与的nmn半合成方法，其中所述腺苷参与的nmn半合成方法相对于现有的半合成法通过采用廉价的腺苷代替atp，和在反应中引入酵母细胞依能量代
谢将腺苷转化为atp的方式，结合现有nr的磷酸化过程实现atp 的重复利用和将现有nr的磷酸化过程形成的磷酸盐作为反应物。
31.具体地，在所述腺苷参与的nmn半合成方法以nr、磷酸盐、腺苷以及可被酵母细胞代谢的糖类(如葡萄糖、蔗糖以及甘油等)为原料，和以nrk和酵母细胞为催化剂，将atp的生成、nr磷酸化及atp的利用统一在一个反应体系内进行，即可完成nmn的高效合成，反应式为：nr+蔗糖+腺苷+磷酸盐+o2→
nmn +atp+co2+h2o。在该反应系统中，酵母细胞通过氧化磷酸化代谢过程，以糖的氧化提供能量驱动磷酸盐与腺苷的结合生成一磷酸腺苷(amp)，继而生成adp 及atp，atp参与nr的磷酸化变成adp后也自动再转化为atp继续参与反应。也就是，反应系统内的腺苷、amp及adp等都能快速转化为可参与nr的磷酸化的 atp，相对于现有的半合成法能够将nr的磷酸化过程形成的磷酸盐作为反应物而省去了磷酸盐的去除工艺，并能够实现atp的重复利用而省去了atp的回收工艺，如此以基于所述腺苷的参与简化nmn产品的纯化工艺。
32.进一步地，在本发明的一个实施例中，所述腺苷参与的nmn半合成方法以nr、磷酸盐、腺苷、蔗糖以及镁离子为原料，以nrk(不限定于液酶或固定化酶)和酵母细胞为催化剂，在水溶液中，起始ph在中性范围，接触空气搅拌反应实施。则atp的生成、nr磷酸化及atp的利用在一个反应体系内进行，各种反应物(nr、磷酸盐、腺苷、蔗糖等)可被基本消耗完成，相应反应体系简单易行，成本低廉，并对环境友好而具有较低的环境成本。
33.在本发明的另一实施例中，所述腺苷参与的nmn半合成方法以nr及腺苷为底物，采用酵母及烟酰胺核糖激酶一锅法生产nmn。示例地，在1l反应体系中依次加入终浓度为100mm的nrc，50mm腺苷，330mm磷酸氢二钾，70mm磷酸二氢钾，120mm蔗糖，50mm氯化镁，5mm氯化锰，300g酵母，500mg烟酰胺核糖激酶粗酶冻干粉，充分搅拌溶解后，控制反应温度为37℃，300rpm搅拌反应，反应过程中用高效液相色谱检测nmn浓度，反应在六小时内结束，反应得到nmn 29.84g，反应收率为89.3％。
34.在本发明的另一实施例中，所述腺苷参与的nmn半合成方法以nr及腺苷为底物，采用酿酒酵母及烟酰胺核糖激酶磁性固定化酶一锅法生产nmn。示例地，在1l反应体系中依次加入终浓度为50mm的腺苷，330mm磷酸氢二钾，70mm磷酸二氢钾，120mm蔗糖，50mm氯化镁，5mm氯化锰，300g湿酿酒酵母，充分搅拌溶解后，控制反应温度为37℃，静置发酵一小时。在上述酵母发酵液中加入终浓度为100mm的nrc，及300g烟酰胺核糖激酶磁性固定化酶，300rpm搅拌反应，控制反应温度为37℃，采用自动滴定仪，以3m氢氧化钠控制反应ph为6.0。反应过程中用高效液相色谱检测nmn浓度，反应在二小时内结束，反应得到nmn 31.58g，反应转化率为94.5％。
35.为进一步描述本发明，本发明的所述腺苷参与的nmn半合成方法包括同一反应体系下的以下步骤：
36.(a)腺苷、磷酸盐以及可被酵母细胞代谢的糖类在酵母细胞的催化作用下反应生成atp的步骤；和
37.(b)nr的酶促磷酸化步骤，对应nr和atp在nrk的催化作用下反应生成nmn和adp的步骤。
38.其中可以理解的是，在所述的腺苷参与的nmn半合成方法的反应体系中，nr 原料选自商用的nr纯品、商用的烟酰胺氯化物(nrc)纯品、含有nr的固体、含有nrc的固体、含有
nr的液体以及含有nrc的液体中的至少一种。
39.进一步地，在所述的腺苷参与的nmn半合成方法的反应体系中，可被酵母细胞代谢的糖类包括但不限于葡萄糖、蔗糖、淀粉以及甘油中的单一糖类或混合糖类。
40.特别地，在所述的腺苷参与的nmn半合成方法的反应体系中，nrk酶可以是液酶，也可以是固定化酶，本发明对此不作限制。
41.进一步地，在所述的腺苷参与的nmn半合成方法的反应体系中，酵母细胞是可进行氧化磷酸化代谢的各种酵母细胞，如壁赤酵母或酿酒酵母。
42.可选地，其中在所述的腺苷参与的nmn半合成方法的反应体系中，可以进一步添加金属离子，如镁离子、锰离子。
43.优选地，其中在所述的腺苷参与的nmn半合成方法的反应体系中，腺苷与nr 的摩尔比范围是0.01～1。
44.优选地，其中在所述的腺苷参与的nmn半合成方法的反应体系中，nr与磷酸盐的摩尔比范围是1～20。
45.值得一提的是，其中在所述的腺苷参与的nmn半合成方法的反应体系中，酵母细胞可以是冰冻储存过的湿酵母。
46.特别地，其中在所述的腺苷参与的nmn半合成方法的反应体系中，可以进一步添加甲苯、正丁醇以及吐温20中的至少一种有机试剂。
47.值得一提的是，在本发明的一些实施例中，在反应进程上，所述步骤(a) 在所述步骤(b)之前被启动，以为所述步骤(b)的反应提供atp而形成所述步骤(a)和所述步骤(b)在同一反应体系中相互促进的反应状态。
48.特别地，在本发明的这些实施例中，其中所述的腺苷参与的nmn半合成方法进一步包括adp和磷酸盐在酵母细胞作用下再生为atp的步骤。
49.本领域的技术人员可以理解的是，以上实施例仅为举例，其中不同实施例的特征可以相互组合，以得到根据本发明揭露的内容很容易想到但是在上述描述中没有明确指出的实施方式。
50.本领域的技术人员应理解，上述描述所示的本发明的实施例只作为举例而并不限制本发明。本发明的目的已经完整并有效地实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中展示和说明，在没有背离所述原理下，本发明的实施方式可以有任何变形或修改。