1.本发明属于脂肪酶热稳定性的保护领域，具体提出一种基于乙酰氨基葡萄糖保护剂的游离脂肪酶制剂的制备方法。
背景技术：
2.酶是由活细胞产生的、具有催化功能的一种生物催化剂。酶具有高度专一性、高效性、作用条件温和等优点，其应用领域遍布食品、纺织、饲料、洗涤剂、造纸、皮革、医药以及能源开发、环境保护等多个方面。脂肪酶是一类被应用最广泛的酯催化剂，其易溶于水，可催化产物分离且副产物回收简单易行，绿色健康，但是脂肪酶的稳定性较差且重复利用率低，从而使成本增加。此外，脂肪酶在工业应用中，往往需要或遇到超过45℃的高温条件，而游离脂肪酶热稳定性普遍较差，这就阻碍了其应用范围。目前关于提高脂肪酶的热稳定性的方法主要有：固定化酶、对酶进行化学修饰或分子改造。
3.相比于游离的脂肪酶，固定化酶则具有重复利用和易分离的特点，可以极大的降低酶的使用成本。固定化酶是20世纪60年代发展起来的一种新技术，所谓固定化酶，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。通常酶是在水溶液下进行催化反应的，而固定化酶是将水溶性酶用化学或物理方法处理，使它不溶于水的，但仍具有酶化活性的状态。目前最普遍的吸附固定化方法存在一个很大的缺点，即由于其利用较弱的范德华力和分子间作用力吸附工业酶，有研究者发现，利用该方法制备的固定化酶在反应过程中酶易脱离，造成酶的损失，同时污染了反应产物。因此，固定化酶法也并非是一个可以长久用于提高热稳定性的方法，更好提高酶活的方法亟待被发现。
4.目前也有相关文献提出对酶进行分子改造，从而来提高游离酶的热稳定性。分子改造技术是一种通过改变脂肪酶的高级结构来实现热稳定性提高的方法，目前常见提高游离酶热稳定性的分子技术有随机突变、定向进化和定点突变。
5.现有技术：目前现有固定化脂肪酶的方法包括但不局限有：吸附法（物理吸附和化学吸附）、包埋法、交联法、共价结合法，这些方法都存在一定的局限性。比如：吸附法中酶与载体的相互作用较弱，容易导致已吸附在载体表面的酶重新脱落下来，导致得到的固定化酶活性不高；交联法常用的交联剂是戊二醛，但单用戊二醛去固定脂肪酶，得到的固定化酶酶活力较低，故常需要与其他方法结合使用；载体结合法是指酶与不溶于水的载体通过共价键结合的过程，该过程所需要的反应条件比较苛刻，时常会引起酶的高级结构发生改变，导致活性中心受损；包埋法一般只适合小分子底物与产物的酶催化反应，而对于大分子物质一般很难通过高分子聚合物进行扩散。
6.酶分子改造技术包括但不局限于随机突变、定向进化和定点突变等，定向进化指在实验室中模拟自然界的进化过程，将目的基因通过诱变与重组等技术加速改造，并通过特定的选择条件筛选出符合需要的突变子。对于酶热稳定性改造，先基于随机突变、dna 改
组和饱和突变等方法将目的基因改造得突变文库，再结合高温条件筛选出耐热突变子。虽然分子改造技术可以通过筛选出耐热突变子而提高游离脂肪酶的热稳定性，但是该方法的技术性要求较高，人员要求专业素质过硬，因此普通实验室也难以通过该方法进行酶分子改造。
技术实现要素：
7.本专利涉及到一种新颖的提高游离calb热稳定性的方法，公开了一种基于乙酰氨基葡萄糖保护剂的游离脂肪酶制剂的制备方法。包括制备不同浓度的乙酰氨基葡萄糖与游离calb的酶制剂冻干粉，以及研究不同乙酰氨基葡萄糖浓度的酶制剂的热稳定性。该实验的具体方法如下：首先制备不同浓度的乙酰氨基葡萄糖与游离calb混合的酶制剂冻干粉，然后将不同乙酰氨基葡萄糖浓度的酶制剂置于60、70、80℃下孵育1h、2h、3h，最后通过测定不同时间段游离calb与酶制剂的相对酶活来表征乙酰氨基葡萄糖的作用效果。
8.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
9.实施例1准确称取一定量的calb冻干粉，按质量比为1：25分别加入0~1.0mol/l的乙酰氨基葡萄糖溶液，于涡旋仪震荡一会，获得混合溶液；然后将混合溶液进行分装，分管容器使用10~50ml离心管，分装体积为4~25ml，之后置于-80℃冰箱预冻2~4h；接着将预冻好的样品置于真空冷冻干燥的托盘上，待冷阱温度为-55~-65℃，样品温度为-35~-45℃，真空压力为0.1~15pa时，开始冻干，连续冻干36~72h，得到酶制剂粉末。
10.实施例2取一定量冻干完成的酶制剂粉末，按与磷酸盐缓冲液的质量比为（0.01~0.04）：1，涡旋振荡制备酶制剂溶液，游离calb酶液制法亦同；然后将游离calb酶液及不同乙酰氨基葡萄糖浓度的酶制剂溶液分别置于60、70、80℃水浴锅中孵育0、0.5、1.0、1.5、2.0h；接着在离心管中加入ph为7.5的磷酸盐缓冲液，每隔一段时间，按（8~10）：1比例在缓冲液中加入游离calb酶液及加入不同乙酰氨基葡萄糖浓度的酶制剂溶液，于室温下放置5~10min，之后按（1~1.5）：1比例加入底物溶液；加入后，在室温下，从0秒开始马上读取410nm波长的吸光度，继续读取30s，60s，90s，120s，之后每分钟读取一次，一直读到5min，最后以该过程变化曲线的斜率表征相对酶活，并通过比较不同时间段游离calb与加入不同乙酰氨基葡萄糖浓度的酶制剂溶液的相对酶活来表征乙酰氨基葡萄糖的作用效果；实施例3取一定量冻干完成的酶制剂粉末，按与磷酸盐缓冲液的质量比为1：50，涡旋振荡制备酶制剂溶液，游离calb酶液制法亦同；然后将游离calb酶液及不同乙酰氨基葡萄糖浓度的酶制剂溶液分别置于60、70、80℃水浴锅中孵育0、0.5、1.0、1.5、2.0h；接着在离心管中加入ph为7.5的磷酸盐缓冲液，每隔一段时间，按（8~10）：1比例在缓冲液中加入游离calb酶液及加入不同乙酰氨基葡萄糖浓度的酶制剂溶液，于室温下放置5~10min，之后按（1~1.5）：1比例加入底物溶液；加入后，在室温下，从0秒开始马上读取410nm波长的吸光度，继续读取30s，60s，90s，120s，之后每分钟读取一次，一直读到5min，最后以该过程变化曲线的斜率表征相对酶活，并通过比较不同时间段游离calb与加入不同乙酰氨基葡萄糖浓度的酶制剂溶液的相对酶活来表征乙酰氨基葡萄糖的作用效果。
11.实施例4取一定量冻干完成的酶制剂粉末，按与磷酸盐缓冲液的质量比为1：50，涡旋振荡制备酶制剂溶液，游离calb酶液制法亦同；然后将游离calb酶液及不同乙酰氨基葡萄糖浓度的酶制剂溶液分别置于60、70、80℃水浴锅中孵育0、0.5、1.0、1.5、2.0h；接着在离心管中加入ph为7.5的磷酸盐缓冲液，每隔一段时间，按8：1比例在缓冲液中加入游离calb酶液及加入不同乙酰氨基葡萄糖浓度的酶制剂溶液，于室温下放置5~10min，之后按（1~1.5）：1比例加入底物溶液；加入后，在室温下，从0秒开始马上读取410nm波长的吸光度，继续读取30s，60s，90s，120s，之后每分钟读取一次，一直读到5min，最后以该过程变化曲线的斜率表征相对酶活，并通过比较不同时间段游离calb与加入不同乙酰氨基葡萄糖浓度的酶制剂溶液的相对酶活来表征乙酰氨基葡萄糖的作用效果。
12.实施例5取一定量冻干完成的酶制剂粉末，按与磷酸盐缓冲液的质量比为1：50，涡旋振荡制备酶制剂溶液，游离calb酶液制法亦同；然后将游离calb酶液及不同乙酰氨基葡萄糖浓度的酶制剂溶液分别置于60、70、80℃水浴锅中孵育0、0.5、1.0、1.5、2.0h；接着在离心管中加入ph为7.5的磷酸盐缓冲液，每隔一段时间，按8：1比例在缓冲液中加入游离calb酶液及加入不同乙酰氨基葡萄糖浓度的酶制剂溶液，于室温下放置5~10min，之后按1：1比例加入底物溶液；加入后，在室温下，从0秒开始马上读取410nm波长的吸光度，继续读取30s，60s，90s，120s，之后每分钟读取一次，一直读到5min，最后以该过程变化曲线的斜率表征相对酶活，并通过比较不同时间段游离calb与加入不同乙酰氨基葡萄糖浓度的酶制剂溶液的相对酶活来表征乙酰氨基葡萄糖的作用效果。
附图说明
13.图1是60℃下calb与乙酰氨基葡萄糖的热稳定性曲线变化图，图2是70℃下calb与乙酰氨基葡萄糖的热稳定性曲线变化图，图3是80℃下calb与乙酰氨基葡萄糖的热稳定性曲线变化图。图1、2、3的曲线分别代表calb与不同浓度的（0、0.1、0.25、0.5、0.75、1.0mol/l）乙酰氨基葡萄糖作用的曲线。游离酶的热稳定性一般较差，通常需要通过与其它物质的相互作用来提高其热稳定性。如图1、2、3所示，与乙酰氨基葡萄糖相互作用的calb的热稳定性要优于游离酶，并且，不同浓度与不同温度下，乙酰氨基葡萄糖与calb的相互作用不同。相对而言，乙酰氨基葡萄糖浓度越高，于脂肪酶的热稳定性越好，如图1所示，游离calb在60℃水浴0.5h后，其相对酶活力仅为37.21%，而与浓度为0.75~1.0mol/l的乙酰氨基葡萄糖共同作用的calb，其相对酶活力依旧保留在91%以上；即便在该温度下水浴2h后，游离calb的相对酶活力仅剩22.26%，但与0.75~1.0mol/l的乙酰氨基葡萄糖共同作用的calb活性依旧保持在50%以上。纵观60、70、80℃下水浴，与乙酰氨基葡萄糖作用的calb热稳定性提高的越明显，如图1、2、3所示，水浴0.5h后，60℃下游离calb的相对酶活力略大于与浓度为0.1mol/l的乙酰氨基葡萄糖相互作用的calb，但在70℃以上，与乙酰氨基葡萄糖相互作用的calb相对酶活力都大于游离calb。可见，乙酰氨基葡萄糖的加入可以提高游离calb的热稳定性。