从复杂样本中富集真菌的方法及其在真菌研究中的应用

1.本发明涉及微生物领域，具体涉及一种从复杂样本中富集真菌的方法及其在真菌研究中的应用。


背景技术：

2.肠道为多种微生物提供了生长繁殖的环境，包括原核生物细菌和古菌、真核病毒和噬菌体以及真菌、原生动物等真核生物。这些肠道微生物在维持宿主的健康稳态中发挥重要作用，并影响宿主的多种功能，包括肠屏障完整性、维生素合成、代谢活动、神经系统及炎症和免疫等。
3.近15年来随着高通量测序技术的发展，对特定环境中复杂菌群的鉴定及基因功能研究受到广泛关注。目前对肠道菌群的研究多聚焦于细菌的组成特征和功能变化，主要基于细菌在肠道中的数量优势(每克粪便样本中平均有10
11
个细菌细胞)。肠道真菌由于其数量少(每克粪便样本中真菌细胞只有105‑
106个)，及数据库不完善等方面的限制，在以往的研究中对肠道真菌的关注较少。近年来对肠道真菌的一些研究表明，真菌在人体中存在于皮肤及几乎所有黏膜的表面，主要包括单细胞酵母、多细胞霉菌和以酵母和丝状细胞形式出现的双态性真菌，并以共生、寄生等方式与宿主互动，在维持人体健康体内平衡过程中也有着重要功能。
4.目前对肠道真菌的研究方法主要包括：
5.(1)通过对真菌的形态观察以及生理生化指标的分析对真菌菌株进行鉴定，对真菌菌株的代谢和功能特征进行研究。但是由于不明确合适的培养条件，许多物种检测不到；同时通过培养分离出的单菌株还需要进行sanger测序或飞行质谱进行鉴定。整个周期时间较长也较难实现高通量。
6.(2)通过高通量测序的方法在核酸水平实现对物种的鉴定。该方法对样本基因组核酸进行提取后，通过对基因组核酸上特征片段扩增得到的pcr产物进行测序(扩增子测序)或者直接建库测序(宏基因组测序)的方式对特定环境中真菌组成及功能进行研究。其中扩增子测序主要靶向真菌核糖体操纵子区域中2个高度变异区域its1和its2转录内间隔区。基于二代测序平台短读长的特征，目前独立使用its1或its2区域作为真菌鉴定的dna条形码，基本能够实现在物种水平对真菌进行鉴定。宏基因组和宏转录组测序不存在扩增步骤，能够直观的对样本中物种组成和结构进行分析，同时能够分析关键功能通路，挖掘新的基因功能，是研究肠道菌群的重要策略。
7.由于在肠道样本中与细菌细胞相比，真菌细胞在数量上占少数，测序信息会被高水平的细菌和宿主dna掩盖，肠道真菌的检出率非常低，以往对肠道样本进行宏基因组测序的研究中，检出真菌比例仅为0.01％，使得宏基因组及宏转录组在聚焦肠道真菌研究中应用较困难。同时肠道真菌的扩增子测序也存在检出物种丰富度较低的情况。但是目前还未见发表针对肠道真菌的富集方式。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提供一种从复杂样本中富集真菌的方法及其在真菌研究中的应用，通过在核酸提取前进行有效真菌富集，首次实现了对复杂样本(尤其是其中还含有在数量上占优势的细菌)中真菌核酸的富集，有利于促进复杂样本(如粪便)中真菌宏基因组及宏转录组测序的研究，提高传统扩增子测序中真菌物种检出的丰富度。
9.具体而言，本发明首先提供一种从复杂样本中富集真菌的方法，所述复杂样本中含有真菌和细菌，该方法包括：
10.1)从所述复杂样本去除粒径大于100μm的物质后，通过0.8
‑
1.0μm的滤膜对其进行浓缩，以得到浓缩样本；
11.2)裂解所述浓缩样本中的细菌，而后在dnase作用下去除细菌核酸。
12.本发明发现，通过上述方法，可以从复杂样本中高效富集真菌，从而有利于对其进行后续研究。
13.当在所述复杂样本中，细菌的丰度高于真菌，更进一步的，当所述复杂样本为人或动物的粪便时，使用本发明的方法仍可以很好地实现真菌富集效果。
14.作为优选，所述浓缩样本中的细菌含量为1x104～1x108(copies/ul)，真菌含量为1x102～1x105(copies/ul)。当细菌和真菌含量在上述范围内时，后续的裂解及纯化效果更优。
15.作为优选，步骤1)具体包括：
16.用磷酸盐缓冲液重悬所述复杂样本后，去除粒径大于100μm的物质，而后采用0.8
‑
1.0μm的滤膜过滤，弃滤液，用磷酸盐缓冲液冲洗滤膜后，在10000
‑
12000g下对冲洗液进行离心浓缩，以得到浓缩样本。
17.作为一种优选的实施方式，步骤1)的操作具体如下：
18.1.将所述复杂样本按1g：50
‑
70ml的比例与磷酸盐缓冲液(如pbs缓冲液)混匀，得到样本悬液；
19.2.将所述复杂样本通过100μm滤膜除去其他物质后收集滤出液并采用0.8
‑
1.0μm(更优选为0.8μm)滤膜过滤，弃流出液，滤膜上为富集的真菌细胞，用磷酸盐缓冲液反复冲洗滤膜至冲洗液无色，10000
‑
12000g(更优选为11000g)离心对滤液进行浓缩。
20.作为优选，步骤2)中，使用溶菌酶和naoh
‑
sds裂解所述浓缩样本中的细菌。
21.本发明进一步发现，相较于其他裂解方式，通过对溶菌酶和naoh
‑
sds的结合使用，可以避免伤害真菌的同时，更好地破坏革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁并使细胞裂解，从而更有利于促使其dna释放至胞外以便于消化去除。其中，naoh
‑
sds对革兰氏阴性菌的裂解效果更优，溶菌酶对革兰氏阳性菌的裂解效果更优。
22.更优选的，步骤2)中，裂解所述浓缩样本中的细菌的操作具体包括：
23.i)将所述浓缩样本与naoh
‑
sds混合，并于室温下处理后，离心去上清；
24.ii)重悬步骤i)所得的沉淀，并将其与溶菌酶溶液混合，在36
‑
38℃下处理后，离心去上清；
25.其中，所述naoh
‑
sds中含有0.15
‑
0.25n naoh和0.8
‑
1.2wt％sds；所述溶菌酶溶液的浓度为40
‑
60mg/ml；
26.所述浓缩样本与naoh
‑
sds的体积比为1：0.8
‑
1.2；沉淀重悬液与所述溶菌酶溶液
的体积比为1：0.5
‑
0.8。
27.在上述用量下，更有利于实现理想的裂解效果。优选地，步骤i)中的处理时间为4
‑
6min，步骤ii)中的处理时间为0.8
‑
1.2h。
28.优选地，步骤i)、ii)中的离心在10000
‑
12000g下进行。
29.更优选的，所述naoh
‑
sds中含有0.2n naoh和1wt％sds；所述溶菌酶溶液的浓度为50mg/ml。
30.通过上述方式，更有利于在避免破坏真菌细胞的同时，提升对细菌的裂解效果。
31.作为优选，步骤2)中，使用非特异性核酸内切酶/核酸酶去除细菌核酸时，对细菌核酸的去除效果更好。
32.本领域人员可以根据常识选用核酸酶以及对应的核酸酶buffer对细菌裂解后的样本进行处理和操作，以去除其中的细菌核酸，其均可对本发明中细菌裂解后的样本实现不错的核酸去除效果。
33.作为优选的实施方案，步骤2)中，使用非特异性核酸内切酶/核酸酶hl
‑
san dnase去除细菌核酸的操作具体包括：
34.将细菌裂解后的样本与高盐核酸酶缓冲液hl
‑
san buffer(5.5 mnacl and 100 mm mgcl2 in nuclease
‑
free water)和非特异性核酸内切酶/核酸酶hl
‑
san dnase(25u/μl)混合，在36
‑
38℃、700
‑
900rpm，孵育13
‑
17min后；再次加入非特异性核酸内切酶/核酸酶hl
‑
san dnase(25u/μl)，在36
‑
38℃、700
‑
900rpm，孵育13
‑
17min；而后于5000
‑
7000g下离心去上清。
35.此外，本领域人员还可以根据常识在裂解及去除细菌核酸后分别对产物进行洗涤，其也在本发明的保护范围之内。
36.作为一种优选的实施方式，步骤2)的操作具体如下：
37.1.将浓缩样本按体积比1：0.8
‑
1.2与naoh
‑
sds(0.2n naoh,1％sds)混合，室温静置4
‑
6min，10000
‑
12000g室温离心4
‑
6min，弃上清。
38.2.用te缓冲液将沉淀重悬后，将沉淀重悬液按体积比1：0.5
‑
0.8与溶菌酶溶液(40
‑
60mg/ml)混合，36
‑
38℃处理0.8
‑
1.2h，10000
‑
12000g室温离心4
‑
6min。弃上清。
39.3.用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀，并于10000
‑
12000g室温离心3
‑
4min，弃上清(上述洗涤过程可重复1
‑
2次)；用90
‑
110μl磷酸盐缓冲液重悬沉淀。
40.4.加入90
‑
110μl hl
‑
san buffer(5.5 m nacl and 100 mm mgcl2in nuclease
‑
free water)，4
‑
6μl hl
‑
san dnase(25u/μl)，在36
‑
38℃、700
‑
900rpm下孵育13
‑
17min。
41.5.加入1
‑
3μl hl
‑
san dnase(25u/μl)，在36
‑
38℃、700
‑
900rpm，孵育13
‑
17min后，5000
‑
7000g离心去上清。
42.6.用磷酸盐缓冲液重悬沉淀，并通过5000
‑
7000g离心去上清；重复2
‑
3次。
43.本领域人员可依照常识对上述优选方案进行组合，得到本发明的从复杂样本中富集真菌的方法的较优实施例。
44.进一步的，本发明还提供一种从复杂样本中获得真菌核酸的方法，该方法包括：
45.使用所述的从复杂样本中富集真菌的方法获得富集样本，而后从富集样本中提取dna和/或rna。
46.进一步的，本发明还提供一种真菌的高通量测序及分析方法，其包括：
47.使用所述的从复杂样本中获得真菌核酸的方法获得dna样本后，进行高通量测序及分析；
48.其中，所述高通量测序包括扩增子测序和/或宏基因组测序。
49.进一步的，本发明还提供一种真菌的宏转录组分析方法，其包括：
50.使用所述的从复杂样本中获得真菌核酸的方法获得rna样本后，捕获其中的mrna并将其反转成cdna，而后进行宏转录组分析。
51.在一些优选的实施方案中，可通过oligo dt primer捕获mrna。
52.基于上述技术方案，本发明的有益效果如下：
53.本发明可以实现对人体或动物粪便样本中真菌及其核酸的富集，减少细菌核酸占比，使富集后样本可以应用于靶向真菌的扩增子、宏基因组以及宏转录组分析。此外，本发明还可以应用于任何由于细菌丰度高掩盖真菌信息的复杂样本，实现对真菌的富集。
54.本发明通过在提取核酸前对真菌进行富集，有效地提高核酸样本中的真菌拷贝数，使宏基因组和宏转录组测序技术在肠道真菌组学研究的应用成为可能，解决了宏基因组和宏转录组在肠道真菌菌群研究中的困境。同时在以往的扩增子测序中，富集后的真菌增加真菌物种丰富度，提高真菌种群的检出率。
附图说明
55.图1为本发明实施例中肠道真菌组中真菌核酸的富集提取方法的流程图。
56.图2是本发明实施例中1例样本的实时荧光定量pcr中细菌拷贝数和真菌拷贝数的标准曲线，其中，a图为实时荧光定量pcr中细菌拷贝数的标准曲线；b图为a图为实时荧光定量pcr中真菌拷贝数的标准曲线。
57.图3为本发明实施例的6例样本的处理结果，其中，a图为本发明实施的6例样本在不同富集处理阶段提取核酸样本中真菌拷贝数；b图为本发明实施的6例样本富集处理后的核酸样本中真菌和细菌拷贝数。
58.图4
‑
9为本发明实施例的6例样本在不同处理阶段经扩增子测序后top20物种组成情况。
59.鉴于该类处理图中各物种的颜色无法在黑白色下区分，以下对各图中的物种进行进一步说明：
60.具体的，图4中，每个柱形图从上至下物种依次为：other、torulaspora、candida、chaetomium、trichosporon、kazachstania、alternaria、paraphoma、penicillium、cystobasidium、fusarium、cyphellophora、aspergillus、talaromyces、nothophoma、gibberella、rhodotorula、cladosporium、wallemia、unidentified、saccharomyces。
61.图5中，每个柱形图从上至下物种依次为：other、alternaria、candida、sistotrema、ascotricha、chaetomium、trichoderma、tranzscheliella、rhodotorula、myrothecium、coprinus、aspergillus、agrocybe、wallemia、nakaseomyces、filobasidium、nigrospora、unidentified、nothophoma、cladosporium、saccharomyces。
62.图6中，每个柱形图从上至下物种依次为：other、trichosporon、knufia、fomitopsis、gibberella、exophiala、candida、acremonium、wallemia、resinicium、nothophoma、talaromyces、pithoascus、fusarium、wickerhamomyces、penicillium、
alternaria、cladosporium、unidentified、aspergillus、saccharomyces。
63.图7中，每个柱形图从上至下物种依次为：other、fomitopsis、phialophora、meyerozyma、psathyrella、nakaseomyces、talaromyces、cladosporium、aspergillus、fusarium、torulaspora、ceratocystis、knufia、tulostoma、unidentified、cladosporium、rhodotorula、candida、nothophoma、saccharomyces。
64.图8中，每个柱形图从上至下物种依次为：other、penicillium、nakaseomyces、trichosporon、aureobasidium、naganishia、vishniacozyma、candida、exophiala、ogataea、kurtzmaniella、botrytis、wallemia、aspergillus、rhodotorula、talaromyces、nothophoma、cladosporium、unidentified、trichosporon、saccharomyces。
65.图9中，每个柱形图从上至下物种依次为：other、naganishia、cladosporium、fusarium、trichoderma、nakaseomyces、penicillium、tilletia、talaromyces、cordyceps、aureobasidium、unidentified、aspergillus、pleurotus、hypsizygus、alternaria、cladosporium、candida、saccharomyces、dictyophora、phallus。
具体实施方式
66.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
67.在以下实施例中，直径50mm、孔径0.8μm的水系pes滤膜来自天津津腾实验设备，薄膜过滤器(stv6)购自北京绿野创能机电设备有限公司。
68.溶菌酶lysozyme购自tiangen公司，hl
‑
san dnase购自arcticzymes公司。
69.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
70.实施例1
71.本实施例提供一种肠道真菌组中真菌核酸的富集提取方法，流程参考图1。
72.1.以6例
‑
80℃保存的成年健康人体粪便样本(此处取样记为f)作为实验对象，分别称取0.5g粪便样本于50ml离心管中，装入30ml灭菌的pbs缓冲液中，充分悬浮均匀。
73.2.粪便悬液经100μm滤膜过滤除去食物残渣后收集滤出液并采用0.8μm(直径50mm)滤膜利用薄膜过滤器进行过滤，弃流出液，用pbs缓冲液反复冲洗滤膜至冲洗液无色，11000g，5min多次离心将滤液浓缩至1ml(此处取样记为fv)。
74.3.取200μl富集滤液加入等体积naoh
‑
sds(0.2n naoh,1％sds)，室温静置5min，11000g室温离心5min，弃上清。
75.4.向沉淀中加入110μl te缓冲液，70μl溶菌酶溶液(50mg/ml),37℃处理1h。11000g室温离心5min。弃上清。
76.5.用500μl pbs缓冲液洗两次，11000g室温离心3min，弃上清(此处从沉淀中取样记为fvgj)。用100μl磷酸盐缓冲液重悬沉淀。
77.若不进行步骤3，直接进行步骤4,5，即仅采用溶菌酶处理时，从沉淀中取样记为fvj。
78.6.加入100μl hl
‑
san buffer(5.5m nacl and 100mm mgcl2 in nuclease
‑
free water)，5μl hl
‑
san dnase,37℃，800rpm，孵育15min。
79.7.加入2μl hl
‑
san dnase，37℃，800rpm，孵育15min。
80.8.6000g，离心3min。弃上清，300μl pbs缓冲液重悬沉淀。
81.9.6000g，离心3min。弃上清，150μl pbs缓冲液重悬沉淀。
82.10.6000g，离心3min。弃上清，保留沉淀。
83.11.采用allprep power fecal dna/rna kit(qiagen,货号：80244)对步骤10中收集沉淀样本进行dna和rna同时提取。
84.12.dna和rna样本采用nanodrop及qubit进行质量检测和定量。
85.13.dna样本采用kapa sybr fast试剂盒(货号：kk4601)利用abi quantstudio 7定量pcr仪仪对细菌和真菌拷贝数进行定量。具体引物、反应体系及反应程序具体如下：
86.(1)细菌部分：
87.具体引物见下表1：
88.表1
[0089][0090]
反应体系：
[0091][0092]
反应程序：95℃，3min；(95℃，15s，55℃，30s)40个循环。
[0093]
(2)真菌部分：
[0094]
具体引物见下表2：
[0095]
表2
[0096][0097]
注：在序列表的seq id no.3中所提到的“n”代表“i”。
[0098]
反应体系：
[0099][0100]
反应程序：95℃，10min；(95℃，15s，55℃，30s；70℃，60s；)40个循环。
[0101]
14.对rna样本捕获mrna后,采用oligo(dt)15primer(promega,货号：c1101)富集mrna,反转得到cdna。反应体系和反应条件如下：
[0102]
a)oligo(dt)捕获mrna
[0103]
rna(1ug)
ꢀꢀ
26μl
[0104]
oligo(dt)15(0.1ug/μl)
ꢀꢀ
2μl
[0105]
总计
ꢀꢀ
28μl
[0106]
温和混匀，并短暂离心。金属浴65℃，5min；冰浴2min。
[0107]
b)一链反应
[0108][0109]
温和混匀，短暂离心；
[0110]
25℃，10min；37℃，60min；95℃，5min；4℃，保存。
[0111]
c)二链反应
[0112][0113]
温和混匀，短暂离心；
[0114]
25℃，10min；37℃，60min；75℃，10min；4℃，保存。
[0115]
d)磁珠纯化
[0116]
将agencourt ampure xp磁珠(beckman coulter)提前放置于室温，充分震荡混匀。
[0117]
cdna样本分别转移到1.5ml离心管，加入等体积重悬的ampure xp磁珠，温和吹吸混匀。
[0118]
室温下孵育5min，将离心管放置在磁珠架上，室温静置至溶液变澄清。弃上清，注
意避免吸入磁珠。
[0119]
加入200μl现配的70％乙醇溶液，室温静置30s，弃乙醇溶液。重复上一步骤，乙醇溶液冲洗一共进行两次后，室温晾干磁珠，避免磁珠出现裂缝。
[0120]
取下离心管，加入32μl nuclear
‑
free water温和弹匀，使磁珠悬浮。室温孵育5min。
[0121]
将离心管放置在磁珠架上，室温静置直至洗脱液变清亮。吸取31μl的上清液于新的1.5ml离心管，得到cdna样本。
[0122]
15.将上述步骤11得到的dna样本进行扩增子以及宏基因组测序分析，步骤14得到的cdna样本进行宏转录组建库及测序分析。
[0123]
对从6例样本提取过程中所收集的样品f、fv、fvj、fvgj进行检测分析，具体方法如下：
[0124]
1.qpcr检测真菌和细菌拷贝数
[0125]
1)按照前述步骤13以起始量为100ng/ul，5倍梯度稀释的e.coil dna为模板，通过细菌qpcr反应得到ct值，绘制细菌ct值与每ul dna中16s rdna拷贝数的标准曲线(图2中a图为其中1例样本的细菌拷贝数的标准曲线)。
[0126]
2)按照前述步骤13以1ng/ul saccharomyces cerevisiae的18srdna为模板，通过真菌qpcr反应得到ct值，绘制真菌ct值与每ul dna中18s rdna拷贝数的标准曲线(图2中b图为1例样本的真菌拷贝数的标准曲线)。
[0127]
3)对收集到的样品f、fv、fvj、fvgj分别按照前述步骤13进行细菌和真菌qpcr反应，并通过得到的ct值以及对应的标准曲线，对细菌和真菌拷贝数进行定量(图3中a图、b图)。
[0128]
2.its扩增子文库构建与测序
[0129]
采用真菌its2区引物，将收集的样品f、fv、fvj、fvgj的dna样本进行扩增，选择gits7/its4引物对。gits7(seq id no.5，5
’‑
gtgartcatcgartctttg
‑3’
)，its4(seq id no.6，5
’‑
tcctccgcttattgatatgc
‑3’
)。
[0130]
文库构建共包括两轮扩增。
[0131]
1)第一轮扩增体系：
[0132][0133]
反应程序：95℃,3min；(95℃,15s；55℃,30s；72℃，30s；)40个循环；72℃，5min；4
℃保存。
[0134]
2)pcr反应后，采用agencourt ampure xp试剂盒的操作步骤进行pcr产物纯化：
[0135]
取出22ul第一轮的pcr产物，转移至新的1.5ml离心管中，然后加入18ul ampure xp磁珠，涡旋振荡混匀后瞬离，室温静置15min，充分与磁珠结合。
[0136]
将含有磁珠和pcr产物的离心管放置于磁力架上，静置5min，待溶液变澄清后，用移液枪除去上清液。80％乙醇洗涤两次：加入200ul 80％乙醇洗涤磁珠，静置30sec后，迅速吸走上清。重复一次该操作后，室温静置5min，彻底晾干磁珠且避免磁珠干裂。
[0137]
向离心管中加入25ul rb洗脱溶液，用移液枪反复吹打混匀，室温静置5min后，将离心管放回磁力架上，静置至溶液变澄清，用移液枪转移约23ul dna样本洗脱至新的1.5ml离心管。
[0138]
3)第二轮pcr扩增：
[0139]
扩增体系：
[0140][0141]
反应程序：95℃,3min；(95℃,30s；55℃,30s；72℃，30s；)8个循环；72℃，5min；4℃保存。
[0142]
4)接下来，重复步骤4
‑
8，纯化第二轮pcr产物，并用nanodrop检测构建的文库浓度，使用1.5％琼脂糖凝胶电泳(120v，35min)检测文库完整性。
[0143]
5)利用qubit核酸荧光定量仪对构建完成的肠道菌群its2基因测序文库进行浓度检测。不同浓度的dna文库样品进行等量混合后，采用illumina hiseq 2500测序仪，进行pe250双端测序。
[0144]
3.its2扩增子测序数据分析
[0145]
1)对illumina hiseq 2500测序平台获得的双端测序数据，我们首先使用vsearch软件的fastq_mergepairs命令对原始下机数据的双端序列进行合并。
[0146]
2))利用vsearch软件的fastx_filter命令对拼接好的序列进行质控，过滤低质量的序列，参数为fastq_maxee_rate 0.01即，read错误率不超过1％。
[0147]
3)采用itsx软件提取质控后的双端序列，为保证不同样本之间可以进行横向比较分析，我们以所有样本的最低序列数为标准，利用usearch软件中fastx_subsample命令随机抽取每个测序数据相应数目的序列进行抽平。合并标准化后的数据，利用vsearch软件derep_fulllength命令对序列进行去冗余，接下来利用usearch软件的uchime命令，采用its数据库去除嵌合体。
[0148]
4)接下来序列利用usearch软件otutab命令生成丰度谱矩阵；利用blast软件，采用unite数据库进行物种注释。进行下一步物种组成分析。
[0149]
5)物种组成分析采用r语言中ggalluvial包对top20的物种组成进行分析和展示。
[0150]
结果见图2～9，由结果可知，利用本发明提供的真菌富集方法对6个成人粪便样本
处理后，使真菌拷贝数增加，并使its扩增子测序的物种丰富度增加。具体来说：
[0151]
(一)与对照组(未经处理的粪便样本)相比，富集后每单位dna(ng)中真菌的拷贝数增加约2个数量级(18s rdna平均拷贝数由2.87*104增加为1.63*106)(图3中a图)；富集处理后真菌核酸拷贝数与细菌相比占优势(16s rdna平均拷贝数为1.42*105小于真菌拷贝数1.63*106)。(图3中b图)
[0152]
(二)与对照组相比，富集后6个样本经its扩增子测序分析后，丰度为top20的真菌物种组成丰富度均增加。(图4
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9)
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虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。