一种抗凝药物活性检测系统及其检测方法与流程

1.本发明涉及药物活性检测技术领域，具体涉及一种抗凝药物活性检测系统及其检测方法。


背景技术：

2.抗凝药物被用于治疗特定血栓栓塞，普通肝素(又称肝素，ufh)是使用得较为广泛的抗凝药物之一。普通肝素作用机制为：其与抗凝血酶iii结合后，更容易与活化的凝血因子iia、ixa、xa、xia、xiia、ka等同时结合并抑制这些活化的凝血因子的活性，从而发挥抗凝作用。另外，低分子量肝素(lmwh)由于其安全、方便、有效和副作用小等特点正逐渐取代普通肝素。肝素等抗凝药物同时作用于众多凝血因子，而不同个体间的这些凝血因子存在高可变性，维持适当的抗凝药物水平具有一定难度。因此，在利用肝素等抗凝药物进行治疗和预防时，药物的抗凝活性监测是非常重要的。
3.活化部分凝血活酶时间(aptt)是临床上最常用的反映内源性凝血系统凝血活性的敏感筛选试验，也是检测肝素等抗凝药物的抗凝活性的最常用的检测方法。但是，传统的凝血级联反应的初始步骤较长，对活化部分凝血活酶时间(aptt)及凝血酶原时间(pt)的检测产生了较大干扰，影响了aptt的检测准确程度和应用范围。亟需开发出一种能够绕开凝血级联反应的初始步骤的药物抗凝活性的检测方法，以及一种针对于抗凝血药疗效的稳定而可靠的检测系统。


技术实现要素：

4.本发明意在提供一种抗凝药物活性检测系统，以解决抗凝药物活性检测系统受到凝血级联反应的初始步骤影响的技术问题。
5.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.一种抗凝药物活性检测系统，其包括vpact活化剂和vpact启动剂；vpact活化剂中含有磷脂、v因子活化剂、活化因子x、hepes和甘露醇，vpact启动剂中含有钙离子。
7.本方案的原理及优点是：在本方案中，使用vpact试剂(包括vpact活化剂和vpact启动剂两个部分)针对于肝素等抗凝药物在血浆中的抗凝活性进行检测。vpact试剂中的v因子活化剂(rvv-v，来源于鲁氏蝰蛇毒素)可激活血浆中的凝血因子v(fv)，随后活化的凝血因子v(fva)与磷脂(pl)、活化因子x(fxa)和钙离子一起形成凝血酶原酶复合物。由于rvv-v对fv进行预激活，故凝血酶和纤维蛋白的形成仅取决于fxa和凝血酶(fiia)的活性，绕过了传统的凝血级联反应的初始步骤，从而消除了无论内源性还是外源性凝血因子活化过程的众多因素干扰，可实现对肝素等直接或间接靶向fxa和/或fiia抗凝血药物的抗凝活性监测。
8.本方案的抗凝药物活性检测系统(vpact)对活化因子x(fxa)或凝血酶抑制药物的抗凝作用非常敏感。通过本系统可以获得v因子活化凝血时间(vpact)指标，通过该指标反应抗凝药物的凝血活性。据研究数据表明，在各种肝素疗效监测中，本方案的抗凝药物活性
检测系统可以稳定而可靠地进行抗凝血药疗效监测，显示出广泛的适用范围。
9.进一步，磷脂、hepes和甘露醇在vpact活化剂中的质量百分数分别为0.001～0.2％、0.1～3％、0.5～6％；v因子活化剂和活化因子x在vpact活化剂中的含量分别为1～10u/ml、0.01～0.3u/ml。采用上述组成以及比例的vpact活化剂可有效对样品进行活化，为后续的凝血过程做好准备。
10.进一步，所述钙离子由氯化钙提供，氯化钙在vpact启动剂中的质量百分数为0.05～0.6％。采用上述组成的vpact启动剂可以有效启动凝血过程。
11.进一步，磷脂、hepes和甘露醇在vpact活化剂中的质量百分数分别为0.005％、0.6％、2％；v因子活化剂和活化因子x在vpact活化剂中的含量分别为4u/ml、0.024u/ml；氯化钙在vpact启动剂中的质量百分数为0.278％。上述组成以及用量是实现检测目的的最优化情形，可以获得较高的检测准确率。
12.进一步，vpact活化剂和vpact启动剂的体积比为1:1。上述用量比可有效促进凝血过程，绕开了凝血级联反应的初始步骤，减少了内源性和外源性凝血因子活化过程的干扰。
13.进一步，其还包括校准品和质控品；校准品包括无ufh的血浆和含1.72u/ml ufh的血浆；质控品包括含0.35u/ml ufh的血浆和含1.1u/ml ufh的血浆。
14.进一步，其还包括全自动凝血分析仪；所述全自动凝血分析仪为drc3200全自动凝血分析仪或者drc3600全自动凝血分析仪。
15.现有的凝血仪对凝血功能的检测，大多局限于常规术前检测(如凝血四项)。本方案将常规的凝血仪和vpact试剂结合使用，可扩展常规凝血仪的功能到评估多种抗凝血药疗效监测、术后凝血状态、常见病、多发病、中老年病检测项目，实现一台检测设备与多项检测指标的整合，为快速、精准的临床需要提供便利。
16.drc3200全自动凝血分析仪或者drc3600全自动凝血分析仪(即重庆鼎润医疗器械有限责任公司的全自动凝血分析仪：drc3200、drc3600)，不但能够检测常规凝血四项，还可以对抗凝药物的凝血活性进行检测。抗凝药物包括凝血因子直接抑制剂(凝血酶直接抑制剂和xa因子直接抑制剂等)、凝血因子间接抑制剂(抗凝血酶介导的各种肝素和xa因子选择性抑制剂等)。drc3200和drc3600等凝血仪操作简单，普通医护人员均可熟练掌握；且为各大医院必备的常规凝血四项检测仪器，不必购置专门针对于抗凝活性的设备，节约成本。
17.进一步，其用于监测凝血因子直接和/或间接抑制剂的活性。
18.抗凝药物在常规药物监测中并不需要对fxa抑制活性等进行检测，而在出血和紧急手术前快速获得检测结果又十分必要，遗憾的是对上述效果的监测，目前全球尚无统一的测定方法。将v因子活化凝血时间(vpact)指标应用于抗凝药物活性检测中，则更加有利于了解直接或者间接作用于fxa和fiia的抗凝药物的活性情况，以及有利于对肝素及类似物的疗效进行监测，为快速、精准的凝血功能状态床旁检测提供便利。
19.进一步，所述抗凝药物为肝素、低分子量肝素、磺达肝葵钠、阿加曲班或阿哌沙班。普上述药物为较为常用的抗凝药物，本方案的活性检测系统可对这些药物的抗凝活性进行有效检测。
20.进一步，一种抗凝药物活性检测系统的抗凝药物活性的检测方法，包括如下依次进行的步骤：
21.s1：使用校准品混合物绘制标准曲线；
22.s2：使用质控品混合物对全自动凝血分析仪进行定标；
23.s3：检测样品混合物的凝血时间，并根据s1获得的标准曲线计算样品中的抗凝药物的浓度；
24.其中，校准品混合物的配制方法为：将校准品和vpact活化剂混合，经孵育后，再加入vpact启动剂，获得校准品混合物；质控品混合物的配制方法为：将质控品和vpact活化剂混合，经孵育后，再加入vpact启动剂，获得质控品混合物；样品混合物的配制方法为：将样品和vpact活化剂混合，经孵育后，再加入vpact启动剂，获得样品混合物。
25.采用上述技术方案，先使用vpact试剂处理校准品，然后使用凝血仪测试校准品混合物的凝血时间，在制作出凝血时间随抗凝药物浓度变化的标准曲线；再使用质控品对凝血仪进行质控；最后使用凝血仪检测样品混合物的凝血时间，并通过标准曲线计算出样品中抗凝药物的浓度(即为抗凝药物的活性)。
附图说明
26.图1为抗凝药物活性检测系统的原理示意图。
27.图2为实施例1的肝素抗凝活性检测的凝固时间随肝素浓度变化的曲线。
具体实施方式
28.实施例1：利用抗凝药物活性检测系统进行抗凝药物活性检测的实例
29.使用本方案的抗凝药物活性检测系统进行抗凝药物的活性检测的原理如图1所示。在图1中，rvv-v表示v因子活化剂、fv表示凝血因子v、fva表示活化的凝血因子v、fxa表示活化因子x、pl表示磷脂、a表示凝血酶原酶复合物。在rvv-v的作用下，fv被活化成fva，fva和pl、fxa以及ca
2+
形成凝血酶原酶复合物。在该凝血酶原酶复合物的介导下，凝血酶原fⅱ被活化，形成凝血酶fⅱa。在凝血酶fⅱa的作用下，纤维蛋白原i被活化，形成纤维蛋白ia，从而实现凝血。在本方案中rvv-v直接活化fv并形成可直接作用于凝血酶原fⅱ的凝血酶原酶复合物，绕开了凝血级联反应的初始步骤，减少了内源性和外源性凝血因子活化过程的干扰。对于如肝素等的可以直接或间接靶向fxa和/或凝血酶fⅱa的抗凝血药物具有较为理想的监测效果。
30.本实施例以普通肝素的抗凝活性检测为例，来说明以本系统进抗凝药物活性检测的过程，并具体使用了重庆鼎润医疗器械有限责任公司的全自动凝血分析仪(drc3200和drc3600)进行了凝血分析，具体如下：
31.1.试剂配制
32.vpact活化剂：
33.a.准确称取5.958g的hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)于1.5l玻璃烧杯中，随后注入500ml纯化水，室温下进行磁力搅拌；
34.b.待hepes完全溶解(5分钟内)，加入20g的甘露醇，继续搅拌；
35.c.待甘露醇完全溶解(5分钟内)，加入50mg的磷脂，超声处理10分钟后，继续搅拌；
36.d.待固体充分溶解，随后加入1ml(4000u/ml)rvv-v和96ml(0.25u/ml)活化因子x，继续搅拌10分钟；
37.e.待溶液混匀，用纯化水定容至1l，继续搅拌，并将ph调至7.4。
38.vpact启动剂：
39.a.准确称取2.78g氯化钙(cacl2)于1.5l玻璃烧杯中，随后注入500ml纯化水，室温下进行磁力搅拌；
40.b.待溶液混匀，用纯化水定容至1l，继续搅拌，并将ph调至7.4。
41.2.检测程序(参数设置)
42.以drc3200和drc3600凝血仪为例，先在50μl样品或质控血浆中加入50μl vpact活化剂，37℃孵育180秒(3分钟)，然后加入50μl的vpact启动剂(37℃)，选定程序，仪器进行自动测试并记录结果。
43.3.校准曲线绘制
44.分别用1ml去离子水中复溶校准品(1：无ufh抗凝活性血浆，含0的ufh添加；2：高ufh抗凝活性血浆，含1.72u/ml的ufh添加)，对应于测试点1和5。测试点2、3和4分别用校准品1作为稀释剂对校准品进行1/4、1/2和3/4稀释而成。复溶的校准品在封闭的小瓶中室温孵育30分，并在使用前轻轻旋转，随后将不同浓度的校准品转入微量管中。仪器开机预温不超过30分钟，打开凝血仪配套软件，将微量管分别放置在样品盘上相应孔位(a1-a5)，点击开始(试剂布局-拖拽到指定孔位)
→
确定
→
添加，仪器自动测定并输出标形成血块所需的时间，以肝素(普通肝素，ufh)活性为横坐标，以血凝块形成时间为纵坐标，绘制校准曲线(图2)。
45.4.定标程序
46.分别用1ml去离子水中复溶质控品(1：低ufh抗凝活性血浆，含～0.35u/ml的ufh添加；2：高ufh抗凝活性血浆，含～1.1u/ml的ufh添加)，复溶的质控品在封闭的小瓶中室温孵育30分，并在使用前轻轻旋转，随后将不同浓度的质控品转入微量管中，放置在样品盘上任意孔位(如b1、b2)，点击测试界面的“质控图标”，进入设置窗口
→
选择样本位孔号、质控编号、质控批号
→
选择质控测试项目
→
点击“添加图标
”→
点击“关闭图标
”→
点击“开始图标
”→
布局确定，开始质控测试。用低值质控血浆(含～0.35的ufh)和高值质控血浆(含～1.1的ufh)分别重复测试10次，分别计算测量值的平均值和标准差(sd)，所得结果应符合≤10％的要求。仪器进行自动测试并记录结果，所得结果见表1。所检测结果均在规定范围内，提示所使用系统(仪器、试剂、样品)运行正常，结果可靠。
47.表1：定标程序测定结果
48.次数低值质控(～0.35)高值质控(～1.1)10.351.1320.341.1330.351.1240.371.0950.351.1360.361.1270.351.0880.341.1290.341.13
100.351.1平均值0.351.12标准差sd0.010.02cv测定值2.69％1.65％cv质控范围cv≦10％cv≦10％
49.5.样本测试
50.取20个正常志愿者新鲜血浆各10ml(且凝血四项pt、aptt、tt、fib检测均在正常范围内)，采样前志愿者应静息10分钟。小心地将静脉血收集于3.2％或3.8％的柠檬酸三钠真空管中，采样后直接将血液和抗凝剂轻轻混合，避免形成气泡。立即在室温下以不低于2000
×
g的速度离心至少15分钟。当血浆与细胞分离时，小心吸取上层血浆，并将20人血浆混合待用(共约100ml左右)。
51.吸取9.9ml混合血浆，并加入0.1ml肝素钠标准品(heparin sodium brp，10101u/ml，国家标准物质资源平台)，得到浓度为101.01u/ml的贮存液。以混合血浆对贮存液进行1:100稀释，得到浓度为1.0u/ml的工作液。继续以混合血浆对工作液进行相应稀释，使肝素浓度在0.0～1.0u/ml范围内。本例中选择浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0u/ml，各5次重复。
52.点击“测试图标
”→
点击“样本图标
”→
进入测试项目设置窗口
→
选择位置，选择标本所在起始和终止孔位号
→
勾选测试项目“vpact
”→
系统生成/自定义标本号(注：要求标本号和孔位号要相对应)
→
点击“添加图标
”→
点击“关闭图标
”→
退出设置窗口
→
核对测试信息
→
点击“开始图标
”→
布局确定，仪器进行自动测试并记录结果。测定形成血块所需的时间，根据校准曲线(图2)，求出各凝固时间点对应的浓度测量值(抗凝剂活性)，计算测量平均值与理论值(标示值)的相对偏差。检测结果见表2，其中检测不同肝素浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0u/ml)的相对偏差分别为0.31％、1.21％、4.71％、0.87％和-0.76％(现今市面上ivd产品要求相对偏差应≤15％)。结果显示，以vpact检测抗凝剂(肝素)活性，其凝血时间与抗凝剂活性(或浓度)有很好的相关性，其中相关系数r＝0.999(drc3200)。
53.表2：样本测试结果
[0054][0055]
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。