一种自单细胞或微量RNA生成并扩增cDNA的方法和试剂盒与流程

一种自单细胞或微量rna生成并扩增cdna的方法和试剂盒
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域。尤其，本发明提供一种自单细胞或微量rna生成并扩增cdna的方法和试剂盒。本发明还涉及本发明方法和试剂盒的应用，例如对所得cdna进行3
′
和5
′
双向race、常规测序、下一代测序、转录组建库等等，例如用于优生优育中的胎检、疾病(例如癌症)筛查、辅助生殖和细胞疗法中的细胞筛查等等。


背景技术：

2.race(rapid amplification of cdna ends，cdna末端快速扩增)是一种基于逆转录pcr从转录本中快速扩增cdna的末端的技术。race包括3
′
race和5
′
race。利用含polyt的引物作为逆转录引物，根据基因的已知序列设计基因特异性引物，利用3
′
race获得3
′
端序列，利用5
′
race获得5
′
端序列，最终通过组装获得完整的cdna序列。
3.race流程主要包括以下步骤：rna提取，逆转录，3
′
或5
′
末端扩增，克隆转换，测序分析。目前，传统race以3
′
race和5
′
race两个流程分开进行，在逆转录过程中需要分别使用不同的含polyt寡核苷酸作为逆转录引物进行逆转录，后续分开进行3
′
race和5
′
race。
4.传统race对总rna的起始量有要求，一般是10ng至1μg。而且，当前无法实现单细胞的race，因为单细胞的总rna含量不满足传统race的要求。
5.因此，提供一种能够对单细胞或微量rna进行race的方法，对于转录组测序技术的发展具有重要的意义。
6.发明概述
7.本发明提供一种自单细胞或微量rna生成并扩增cdna的方法和试剂盒。本发明还涉及对所得cdna进行5
′
race和3
′
race。
8.本发明能够解决传统race要求rna起始量高的限制(单向race需要至少1ng总rna)，能以单个细胞的裂解物或低至5pg的总rna为起始物进行双向race。本发明可以以1至5000个细胞的裂解物或5pg至5μg的总rna为起始物。本发明也可以以少数细胞，甚至单个细胞为起始物。这克服了单细胞rna含量低，且提取困难的问题。
9.本发明能够解决传统5
′
race和3
′
race需要分两次逆转录，流程复杂的问题，能以一次逆转录支持后续同时进行5
′
race和3
′
race，且操作流程简单。
10.本发明还能够解决传统转录组测序无法获得完整转录本末端的缺陷。
11.本发明的方法整个流程只需要3
‑
5个小时，为分析单细胞、少数细胞或微量rna提供了一种快速的5
′
和3
′
race方式，对在肿瘤检测、新基因的认知等方面具有重要的应用前景。
12.一方面，本发明提供一种自微量rna样本生成cdna的方法，其包括：
13.(1)以样本中的mrna为模板，以逆转录引物为引物，利用逆转录活性，逆转录得到cdna一链；
14.(2)利用末端转移活性，在cdna一链的3'端增加oligoc；和
15.(3)以转换模板为模板，利用模板转换活性，进一步延伸cdna一链得到全长cdna。
16.另一方面，本发明提供一种自微量rna样本生成并扩增cdna的方法，其包括：
17.(1)以样本中的mrna为模板，以逆转录引物为引物，利用逆转录活性，逆转录得到cdna一链；
18.(2)利用末端转移活性，在cdna一链的3'端增加oligoc；
19.(3)以转换模板为模板，利用模板转换活性，进一步延伸cdna一链得到全长cdna；和
20.(4)以全长cdna为模板，以5
′
全长扩增引物和3
′
全长扩增引物为引物，利用dna聚合酶活性扩增全长cdna。
21.又一方面，本发明提供一种对微量rna样本进行5
′
race和3
′
race的方法，其包括：
22.(1)以样本中的mrna为模板，以逆转录引物为引物，利用逆转录活性，逆转录得到cdna一链；
23.(2)利用末端转移活性，在cdna一链的3'端增加oligoc；
24.(3)以转换模板为模板，利用模板转换活性，进一步延伸cdna一链得到全长cdna；
25.(4)任选地，以全长cdna为模板，以5
′
全长扩增引物和3
′
全长扩增引物为引物，利用dna聚合酶活性扩增全长cdna；和
26.(5)以全长cdna为模板，以5
′
race通用引物和5
′
race基因特异性引物为引物，利用dna聚合酶活性扩增全长cdna的5
′
端序列，和/或，以全长cdna为模板，以3
′
race通用引物和3
′
race基因特异性引物为引物，利用dna聚合酶活性扩增全长cdna的3
′
端序列。
27.又一方面，本发明提供一种试剂盒，其用于实施本发明的方法。在一个实施方案中，所述试剂盒包含：
28.(1)具有末端转移活性、模板转换活性和逆转录活性的逆转录酶；
29.(2)高保真dna聚合酶；
30.(3)逆转录引物；
31.(4)转换模板；
32.(5)5
′
全长扩增引物；
33.(6)3
′
全长扩增引物；
34.(7)5
′
race通用长引物和任选的5
′
race通用短引物；
35.(8)3
′
race通用长引物和任选的3
′
race通用短引物；和/或
36.(9)任选的细胞裂解剂、rna酶抑制剂、逆转录反应缓冲液、dntp、扩增缓冲液、race稀释缓冲液、和经过灭菌和/或过滤的双蒸水。
37.在一个实施方案中，逆转录引物自5'端至3'端由3'接头序列、polyt和锚定碱基vn组成；转换模板自5'端至3'端由5'接头序列和oligog组成；5
′
全长扩增引物由5'接头序列组成；3
′
全长扩增引物由3'接头序列组成；5
′
race通用长引物自5'端至3'端由5'衔接头序列和5'接头序列组成，5
′
race通用短引物由5'衔接头序列组成；3
′
race通用长引物自5'端至3'端由3'衔接头序列和3'接头序列组成，3
′
race通用短引物由3'衔接头序列组成。
附图说明
38.图1为本发明提供的对单细胞或微量样本同时进行3
′
race和5
′
race的流程示意图。
39.图2为实施例1中3'race产物和5'race产物的电泳结果图。
40.图3为实施例2中3'race产物和5'race产物的电泳结果图。
41.图4为实施例3中3'race产物和5'race产物的电泳结果图。
42.发明详述
43.本发明的实施方案
44.在第一个方面，本发明提供一种自微量rna样本生成cdna的方法，其包括：
45.(1)以样本中的mrna为模板，以含有polyt的逆转录引物为引物，利用逆转录活性，逆转录得到cdna一链，其中，所述逆转录引物含有polyt(例如至少15个t，例如30个t)，或由其组成；
46.(2)利用末端转移活性，在cdna一链的3'端增加oligoc；和
47.(3)以含有oligog或由其组成的转换模板为模板，利用模板转换活性，进一步延伸cdna一链得到全长cdna。
48.在第二个方面，本发明提供一种自微量rna样本生成并扩增cdna的方法，其包括：
49.(1)以样本中的mrna为模板，以含有polyt或由其组成的逆转录引物为引物，利用逆转录活性，逆转录得到cdna一链，其中，所述逆转录引物还含有位于所述polyt的5'端的3'接头序列；
50.(2)利用末端转移活性，在cdna一链的3'端增加oligoc；
51.(3)以带有oligog的转换模板为模板，利用模板转换活性，进一步延伸cdna一链得到全长cdna，所述转换模板还含有位于所述oligog的5'端的5'接头序列；和
52.(4)以全长cdna为模板，以5
′
全长扩增引物和3
′
全长扩增引物为引物，利用dna聚合酶活性扩增全长cdna，其中，所述5
′
全长扩增引物包含5'接头序列，或由其组成；所述3
′
全长扩增引物包含3'接头序列，或由其组成；任选地，所述5'接头序列与所述3'接头序列相同或不同。
53.在第三个方面，本发明提供一种对微量rna样本进行5
′
race和3
′
race的方法，其包括：
54.(1)以样本中的mrna为模板，以含有polyt或由其组成的逆转录引物为引物，利用逆转录活性，逆转录得到cdna一链，，其中，所述逆转录引物还含有位于所述polyt的5'端的3'接头序列；
55.(2)利用末端转移活性，在cdna一链的3'端增加oligoc；
56.(3)以带有oligog的转换模板为模板，利用模板转换活性，进一步延伸cdna一链得到全长cdna，所述转换模板还含有位于所述oligog的5'端的5'接头序列；
57.(4)任选地，以全长cdna为模板，以5
′
全长扩增引物和3
′
全长扩增引物为引物，利用dna聚合酶活性扩增全长cdna，其中，所述5
′
全长扩增引物包含5'接头序列，或由其组成；所述3
′
全长扩增引物包含3'接头序列，或由其组成；任选地，所述5'接头序列与所述3'接头序列相同或不同；和
58.(5)以全长cdna为模板，以5
′
race通用引物和5
′
race基因特异性引物为引物，利用dna聚合酶活性扩增全长cdna的5
′
端序列，和/或，以全长cdna为模板，以3
′
race通用引物和3
′
race基因特异性引物为引物，利用dna聚合酶活性扩增全长cdna的3
′
端序列，
59.其中，所述5
′
race通用引物包含5
′
接头序列，或由其组成，所述3
′
race通用引物包
含3
′
接头序列，或由其组成；任选地，所述5
′
race通用引物还包含位于所述5
′
接头序列的5
′
端的5
′
衔接头序列，所述3
′
race通用引物还包含位于所述3
′
接头序列的5
′
端的3
′
衔接头序列，任选地，所述所述5
′
衔接头序列与所述3
′
衔接头序列相同或不同，
60.进一步任选地，所述5
′
race通用引物与5
′
race通用短引物组合使用，所述5
′
race通用短引物包含5
′
衔接头序列，或由其组成，所述3
′
race通用引物与3
′
race通用短引物组合使用，所述3
′
race通用短引物包含3
′
衔接头序列，或由其组成。
61.在第四个方面，本发明提供一种用于自微量rna样本生成cdna的试剂盒，其用于实施第一个方面的方法。
62.在第五个方面，本发明提供一种用于自微量rna样本生成并扩增cdna的试剂盒，其用于实施第二个方面的方法。
63.在第六个方面，本发明提供一种用于对微量rna样本进行5
′
race和3
′
race的试剂盒，其用于实施第三个方面的方法。
64.在一个实施方案中，所述逆转录引物含有polyt和位于所述polyt的5'端的3'接头序列，或由其组成；和/或，所述转换模板含有oligog和位于所述oligog的5'端的5'接头序列，或由其组成。
65.在一个实施方案中，所述逆转录引物中的polyt是3
‑
50个、4
‑
40个、5
‑
30个或6
‑
20个，例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个t。
66.在一个实施方案中，所述逆转录引物含有位于3'端的锚定碱基。
67.在一个实施方案中，所述锚定碱基是v，v代表a、c和g。
68.在一个实施方案中，所述锚定碱基是vn，v代表a、c和g，n代表a、c、t和g。
69.在一个实施方案中，所述转换模板中的oligog是3
‑
6个，例如3、4、5或6个g。
70.在一个实施方案中，所述转换模板中的oligog中g的数目与oligoc中c的数目相同。
71.在一个实施方案中，所述转换模板中的oligog中g的数目多于oligoc中c的数目。在一个实施方案中，所述oligog的3'端第一个g是lna修饰的dg。
72.在一个实施方案中，所述oligog的3'端第二个和第三个g是rg。
73.在一个实施方案中，5
′
全长扩增引物与转换模板部分或完全相同，3
′
全长扩增引物与逆转录引物部分或完全相同。
74.在一个实施方案中，5
′
race通用引物与5
′
全长扩增引物和/或转换模板部分或完全相同，3
′
race通用引物与3
′
全长扩增引物和逆转录引物部分或完全相同。
75.在一个实施方案中，其中所述5
′
全长扩增引物与所述5'接头序列部分或完全相同，和/或，所述3
′
全长扩增引物与所述3'接头序列部分或完全相同。
76.在一个实施方案中，所述5
′
race通用引物与所述5'接头序列部分或完全相同，和/或，所述3
′
race通用引物与所述3'接头序列部分或完全相同。
77.在一个实施方案中，所述5
′
race通用引物是5
′
race通用长引物和5
′
race通用短引物的混合物，所述5
′
race通用长引物包含5
′
端的5
′
衔接头序列和3
′
端的5
′
接头序列，或由其组成，所述5
′
race通用短引物包含5
′
衔接头序列，或由其组成，和/或，所述3
′
race通用引物是3
′
race通用长引物和3
′
race通用短引物的混合物，所述3
′
race通用长引物包含5
′
端的
3
′
衔接头序列和3
′
端的3
′
接头序列，或由其组成，所述3
′
race通用短引物包含3
′
衔接头序列，或由其组成。
78.在一个实施方案中，所述5
′
race通用长引物和所述5
′
race通用短引物以1:10至1:1的比例使用，和/或，所述3
′
race通用长引物和所述3
′
race通用短引物以1:10至1:1的比例使用
79.在一个实施方案中，所述5
′
衔接头序列与所述3
′
衔接头序列相同或不同。
80.在一个实施方案中，3
′
/5
′
接头序列优选地不与模板有特异性结合，优选地序列本身不形成发夹结构，优选的3
′
和5
′
接头序列不会互补杂交形成引物二聚体。
81.在一个实施方案中，race扩增时5
′
和3
′
race基因特异性引物长度为15
‑
30nt，gc含量为50
‑
70％，所述特异性引物的tm≥65℃，优选地tm>70℃，特异性引物的设计位点应位于模板末端5kb以内，优选地在末端5kb
‑
1kb内进行设计。
82.在一个实施方案中，所述逆转录活性、所述末端转移活性和所述模板转换活性中的任一项、任两项或全部三项来自逆转录酶。
83.在一个实施方案中，所述逆转录酶是mmlv。
84.在一个实施方案中，所述dna聚合酶活性来自高保真dna聚合酶。
85.在一个实施方案中，所述高保真dna聚合酶是pfu、vent、kod1中的至少一种。
86.在一个实施方案中，所述步骤(1)至步骤(3)一起在37℃或42℃的温度进行5
‑
120、10
‑
100、15
‑
90、20
‑
80、25
‑
70或30
‑
60，例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115或120分钟，例如42℃，90分钟。
87.在一个实施方案中，所述步骤(1)包含在先的变性，例如在70
‑
100℃、75
‑
95℃或80
‑
90℃，例如70℃、72℃或85℃的温度进行1秒
‑
30分钟，例如1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60秒或2、3、4、5、10、15、20、25或30分钟，例如72℃变性3分钟，和/或，所述步骤(3)包含在后的灭活，例如在70
‑
100℃、75
‑
95℃或80
‑
90℃，例如70℃、72℃或85℃的温度进行1秒
‑
30分钟，例如1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60秒或2、3、4、5、10、15、20、25或30分钟，例如70℃灭活15分钟。
88.在一个实施方案中，所述步骤(4)如下进行：98℃预变性1分钟；5
‑
30、7
‑
25或10
‑
20个，例如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个循环，98℃变性10秒，65℃退火15秒，72℃延伸1
‑
30、2
‑
20或5
‑
10分钟，例如5、6、7、8、9或10分钟；72℃再延伸5分钟。
89.在一个实施方案中，尤其当gsp的tm>70℃时，所述步骤(5)如下进行：98℃预变性1分钟；5个循环，98℃变性10秒，72℃延伸3分钟；5个循环，98℃变性10秒，70℃退火15秒，72℃延伸3分钟；10
‑
30或20
‑
25个，例如20(用于mrna样本)或25(用于总rna样本)个循环，98℃变性10秒，68℃退火15秒，72℃延伸3分钟；72℃再延伸5分钟。
90.在一个实施方案中，尤其当gsp的tm为60
‑
70℃时，所述步骤(5)如下进行：98℃预变性1分钟；10
‑
30或20
‑
25个，例如20(用于mrna样本)或25(用于总rna样本)个循环，98℃变性10秒，68℃退火15秒，72℃延伸3分钟；72℃再延伸5分钟。
91.在一个实施方案中，当扩增片段>3kb时，可以延长延伸时间，例如每增加1kb，延长30秒。
92.在一个实施方案中，所述微量rna样本含有5pg至5μg、10pg至1μg、50pg至100ng、
100pg至10ng或500pg至1ng，例如5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000pg总rna或mrna。
93.在一个实施方案中，所述微量rna样本来自1
‑
5000、2
‑
1000、5
‑
200或10
‑
50个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个细胞。
94.在一个实施方案中，靶基因，例如所述race针对的靶基因具有至少0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100的fpkm(fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments)。
95.在一个实施方案中，所述微量rna样本来自单个细胞。
96.在一个实施方案中，所述单个细胞经过裂解后进行逆转录反应，其中细胞裂解剂可以选自tween 20、triton x100、np40中的至少一种。凡是不完全抑制后续逆转录和pcr反应的细胞裂解剂均可使用。
97.在一个实施方案中，所述细胞裂解剂的使用浓度范围为0.02％
‑
0.2％。
98.在一个实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞，例如生殖细胞、胚胎细胞、羊水细胞、干细胞、神经细胞、淋巴细胞、t细胞、b细胞、car
‑
t细胞、或肿瘤细胞。
99.本发明的方法
100.本发明提供的同时自单细胞或微量rna生成并扩增cdna，并对所得cdna进行3
′
race和5
′
race的流程如图1所示。
101.步骤一：分离单细胞后，使用细胞裂解液裂解单细胞，释放带有polya尾(图中以4个a表示，但不限于4个a，下同)的mrna。
102.步骤二：以自单细胞释放的带有polya尾的mrna为模板，以具有3
′
接头序列和polyt序列的逆转录引物(还可具有3
′
锚定碱基vn)，利用逆转录酶的逆转录酶活性进行逆转录，合成cdna一链。
103.步骤三：当逆转录酶到达模板mrna的5
′
末端时，利用逆转录酶的末端转移酶活性，不依赖模板mrna，在cdna一链的3
′
末端添加3
‑
5个dc(oligoc，图中以4个c表示，下同)。
104.步骤四：cdna一链的3
′
末端oligoc序列与带有5
′
接头序列和oligog序列的转换模板退火，利用逆转录酶的模板转换活性，以转换模板为模板继续延伸cdna一链，产生带有5
′
末端3
′
接头序列和3
′
末端5
′
接头序列互补序列的延伸cdna一链。
105.步骤五：因步骤四产生的延伸cdna一链产物非常少，因此对延伸cdna一链进行全长扩增，放大产物量，以便有足够的延伸cdna一链作为模板进行后续实验。5
′
全长扩增引物根据5
′
接头序列进行设计，3
′
全长扩增引物根据3
′
接头序列进行设计。通过pcr扩增，得到足够量的cdna双链产物。(根据样本起始量和待扩增基因丰度，此步骤为可选步骤。)
106.步骤六：取一定量的步骤五全长扩增产物作为模板分开或一起进行3
′
race和5
′
race，其中：3
′
race中使用的引物分别为3
′
race基因特异性引物和通用引物r，3
′
race基因特异性引物是根据cdna中部已知序列设计的，通用引物r是根据3
′
接头序列设计的；5
′
race中使用的引物分别为5
′
race基因特异性引物和通用引物f，5
′
race基因特异性引物是根据cdna中部已知序列设计的，通用引物f是根据5
′
接头序列设计的。使用两对引物进行race，最终得到分别带有mrna模板5
′
端序列和3
′
端序列的dna产物。
107.本发明的产品
108.1、细胞裂解单元：细胞裂解剂和rnase抑制剂
109.细胞裂解剂，为1％tween 20；
110.rnase抑制剂，为南京诺唯赞生物科技股份有限公司murine rnase inhibitor(货号r301)；
111.2、逆转录单元：逆转录酶、逆转录反应缓冲液、逆转录引物、转换模板、dntp mix和无核酸酶水
112.逆转录酶，为南京诺唯赞生物科技股份有限公司hiscript
‑
ts 5'/3'race kit试剂盒(货号ra101)中的10
×
enzyme mix；
113.逆转录反应缓冲液，为南京诺唯赞生物科技股份有限公司discover
‑
sc wta kit v2试剂盒(货号n711)中的5
×
fs buffer v2；
114.逆转录引物，为带有3
′
接头序列、polyt序列和锚定碱基vn的寡核苷酸，如表1中seq id no：1所示(单下划线部分为3
′
接头序列)，其中，v为da、dg和dc中任一碱基，n为da，dg，dt和dc中任一碱基(其中，3
′
接头序列可以采用其它18
‑
25nt序列，只要与模板没有特异性结合，t数目也可以有变化，例如20
‑
40个)；
115.转换模板，为带有5
′
接头序列和oligog的寡核苷酸，如表1中seq id no：2所示(双下划线部分为5
′
接头序列)，其中，3
′
端第一个g碱基是lna修饰的脱氧核糖核苷酸，第二个和第三个g碱基为核糖核苷酸(其中，5
′
接头序列可以采用其它18
‑
25nt序列，只要与模板没有特异性结合，g的数目也可以有变化，例如4个、5个或更多)；
116.dntp mix，为南京诺唯赞生物科技股份有限公司dntp mix(p031)，即datp/dttp/dctp/dggp的混合物，每种浓度10mm；
117.无核酸酶水：为南京诺唯赞生物科技股份有限公司hiscript
‑
ts 5'/3'race kit试剂盒中的rnase
‑
free ddh2o；
118.3、转录组扩增单元：全长扩增试剂、5
′
全长扩增引物和3
′
全长扩增引物
119.全长扩增试剂(包含高保真dna聚合酶)，为南京诺唯赞生物科技股份有限公司discover
‑
sc wta kit v2试剂盒中的2
×
discover
‑
sc pcr mix；
[0120]5′
全长扩增引物，为根据5
′
接头序列设计的上游引物，如表1中seq id no：3所示(双下划线部分为5
′
接头序列)；
[0121]3′
全长扩增引物，为根据3
′
接头序列设计的下游引物，如表1中seq id no：4所示(单下划线部分为3
′
接头序列)；
[0122]
4、race单元：race试剂、5
′
race通用引物、3
′
race通用引物、5
′
race基因特异性引物、3
′
race基因特异性引物和稀释缓冲液
[0123]
race试剂，为南京诺唯赞生物科技股份有限公司discover
‑
sc wta kit v2试剂盒中的2
×
amplification mix；
[0124]5′
race通用引物，为根据5
′
衔接头序列和5
′
接头序列设计的通用长引物和根据5
′
衔接头序列设计的短引物的混合物，如表1中seq id no：5和6所示(双下划线部分为5
′
接头序列)；
[0125]3′
race通用引物，为根据3
′
衔接头序列和3
′
接头序列设计的通用长引物和根据3
′
衔接头序列设计的短引物的混合物，如表1中seq id no：7和8所示(单下划线部分为3
′
接头序列)；
[0126]5′
race基因特异性引物和3
′
race基因特异性引物，对于实施例中例示的β
‑
肌动蛋白(nm_001101.5)，是根据β
‑
肌动蛋白的基因序列设计的，如表1中seq id no：9和10所示；
[0127]
稀释缓冲液，为南京诺唯赞生物科技股份有限公司hiscript
‑
ts 5'/3'race kit试剂盒中的dilution buffer。
具体实施方式
[0128]
下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。但是，下述实施例仅仅是本发明的示例，并不代表或限制本发明的保护范围。本发明的保护范围以权利要求书为准。
[0129]
在以下实施例中，若无特别说明，所用试剂和耗材均购自本领域普通供应商，所用实验方法和技术手段均为本领域常规方法和手段。
[0130]
材料
[0131]
1、细胞裂解单元：细胞裂解剂和rnase抑制剂
[0132]
细胞裂解剂，为1％tween 20；
[0133]
rnase抑制剂，为南京诺唯赞生物科技股份有限公司murine rnase inhibitor(货号r301)；
[0134]
2、逆转录单元：逆转录酶、逆转录反应缓冲液、逆转录引物、转换模板、dntp mix和无核酸酶水
[0135]
逆转录酶，为南京诺唯赞生物科技股份有限公司hiscript
‑
ts 5'/3'race kit试剂盒(货号ra101)中的10
×
enzyme mix；
[0136]
逆转录反应缓冲液，为南京诺唯赞生物科技股份有限公司discover
‑
sc wta kit v2试剂盒(货号n711)中的5
×
fs buffer v2；
[0137]
逆转录引物，为带有3
′
接头序列、polyt序列和锚定碱基vn的寡核苷酸，如表1中seq id no：1所示(单下划线部分为3
′
接头序列)，其中，v为da、dg和dc中任一碱基，n为da，dg，dt和dc中任一碱基；
[0138]
转换模板，为带有5
′
接头序列和oligog的寡核苷酸，如表1中seq id no：2所示(双下划线部分为5
′
接头序列)，其中，3
′
端第一个g碱基是lna修饰的脱氧核糖核苷酸，第二个和第三个g碱基为核糖核苷酸；
[0139]
dntp mix，为南京诺唯赞生物科技股份有限公司dntp mix(p031)，即datp/dttp/dctp/dggp的混合物，每种浓度10mm；
[0140]
无核酸酶水：为南京诺唯赞生物科技股份有限公司hiscript
‑
ts 5'/3'race kit试剂盒中的rnase
‑
free ddh2o；
[0141]
3、转录组扩增单元：全长扩增试剂、5
′
全长扩增引物和3
′
全长扩增引物
[0142]
全长扩增试剂(包含高保真dna聚合酶)，为南京诺唯赞生物科技股份有限公司discover
‑
sc wta kit v2试剂盒中的2
×
discover
‑
sc pcr mix；
[0143]5′
全长扩增引物，为根据5
′
接头序列设计的上游引物，如表1中seq id no：3所示(双下划线部分为5
′
接头序列)；
[0144]3′
全长扩增引物，为根据3
′
接头序列设计的下游引物，如表1中seq id no：4所示(单下划线部分为3
′
接头序列)；
[0145]
4、race单元：race试剂、5
′
race通用引物、3
′
race通用引物、5
′
race基因特异性引物、3
′
race基因特异性引物和稀释缓冲液
[0146]
race试剂，为南京诺唯赞生物科技股份有限公司discover
‑
sc wta kit v2试剂盒中的2
×
amplification mix；
[0147]5′
race通用引物，为根据5
′
衔接头序列和5
′
接头序列设计的通用长引物和根据5
′
衔接头序列设计的短引物的混合物，如表1中seq id no：5和6所示(双下划线部分为5
′
接头序列)；
[0148]3′
race通用引物，为根据3
′
衔接头序列和3
′
接头序列设计的通用长引物和根据3
′
衔接头序列设计的短引物的混合物，如表1中seq id no：7和8所示(单下划线部分为3
′
接头序列)；
[0149]5′
race基因特异性引物和3
′
race基因特异性引物，对于实施例中例示的β
‑
肌动蛋白(nm_001101.5)，是根据β
‑
肌动蛋白的基因序列设计的，如表1中seq id no：9和10所示；
[0150]
稀释缓冲液，为南京诺唯赞生物科技股份有限公司hiscript
‑
ts 5'/3'race kit试剂盒中的dilution buffer。
[0151]
表1
[0152][0153][0154]
单下划线部分为3
′
接头序列；双下划线部分为5
′
接头序列。
[0155]
实施例1
[0156]
在本实施例中，对作为单细胞样本的单个hek293细胞或作为微量rna样本的自hek293细胞提取的10pg总rna(单细胞通常含有约10pg总rna)，利用具有末端转移活性和模板转换活性的逆转录酶，针对持家基因β
‑
肌动蛋白(nm_001101.5)(fpkm≈200)同时进行5
′
race和3
′
race，具体实验流程如下。
[0157]
1、样本处理(细胞裂解)
[0158]
(1)按照下表2配制9
×
细胞裂解液，用移液器轻轻混匀，并短暂离心收集，混匀时应避免出现气泡。
[0159]
表2
[0160][0161][0162]
(2)按照下表3配制单细胞样本和微量rna样本，立即置于冰上。
[0163]
表3
[0164]
组分阳性对照单细胞样本阴性对照9
×
细胞裂解液1μl1μl1μlnuclease
‑
free h2o7μl7μl8μl10 pg总rna1μl
‑‑
1个细胞
‑
1μl
‑
总体积9μl9μl9μl
[0165]
2、逆转录反应
[0166]
(1)按照下表4配制rna变性反应体系，使用移液器轻轻混匀，短暂离心收集后置于冰上。
[0167]
表4
[0168]
组分体积上一步骤产物9μl逆转录引物(10μm)2μldntp mix(10 mm)2μl总体积13μl
[0169]
在pcr仪中运行以下程序：72℃，3 min；立即置于冰上2 min。
[0170]
(2)按下表5配制逆转录反应体系，使用移液器轻轻混匀，短暂离心收集后置于冰上。
[0171]
表5
[0172]
组分体积上一步骤产物13μl5
×
fs buffer v24μl
10
×
enzyme mix2μl转换模板(10μm)1μl总体积20μl
[0173]
(3)逆转录反应条件：42℃，90 min；70℃，15 min；4℃，保持。
[0174]
3、全长cdna扩增
[0175]
(1)在超净台中按照下表6配置反应体系，用移液器轻轻混匀，短暂离心收集后置于冰上。
[0176]
表6
[0177]
组分体积上一步骤产物20μlddh2o4μl2
×
discover
‑
sc pcr mix25μl5
′
全长扩增引物和r(各10μm)1μl总体积50μl
[0178]
(2)在pcr仪中运行下表7所示的反应程序。
[0179]
表7
[0180][0181]
4、cdna末端的快速扩增(race)
[0182]
(1)模板稀释：取10μl全长cdna扩增产物加入10μl dilution buffer进行产物稀释，获得5'/3'race
‑
ready cdna。
[0183]
(2)按照下表8配制5'race反应体系，使用移液器轻轻混匀，短暂离心收集后置于冰上。
[0184]
表8
[0185]
组分体积5'/3'race
‑
ready cdna2.5μl5'gsp(β
‑
actin)(10μm)1μl5'通用引物混合物(长引物和短引物各10μm)5μl2
×
pcr mix25μlddh2o16.5μl总体积50μl
[0186]
按照下表9配制3'race反应体系，使用移液器轻轻混匀，短暂离心收集后置于冰上。
[0187]
表9
[0188]
组分体积5'/3'race
‑
ready cdna2.5μl3'gsp(β
‑
actin)(10μm)1μl3'通用引物混合物(长引物和短引物各10μm)5μl2
×
pcr mix25μlddh2o16.5μl总体积50μl
[0189]
(3)在pcr仪中运行下表10所示反应程序。
[0190]
表10
[0191][0192]
5、电泳检测
[0193]
将5'race产物和3'race产物取5μl进行1.5％琼脂糖电泳检测。结果如图2所示，显示5
′
race和3
′
race均扩增出特异性条带，条带大小符合预期，说明本方案能够实现对单细胞或10pg总rna微量样本同时进行5
′
race和3
′
race。
[0194]
实施例2
[0195]
在本实施例中，针对低丰度表达的unc5b(nm_001244889.2)(fpkm≈1)同时进行5
′
race和3
′
race。具体实验流程参见实施例1，只是在全长cdna扩增环节将pcr扩增步骤的热循环从18轮增加至22轮，并且在race环节省略模板稀释步骤。
[0196]
结果如图3所示，显示5
′
race和3
′
race均扩增出特异性条带，条带大小符合预期，说明本方案能够实现对单细胞或10pg总rna微量样本同时进行5
′
race和3
′
race。
[0197]
实施例3
[0198]
在本实施例中，对自hek293细胞提取的1μg总rna，针对β
‑
肌动蛋白同时进行5
′
race和3
′
race。具体实验流程参见实施例1，只是省略细胞裂解环节和全长cdna扩增环节。结果如图4所示。
[0199]
以上所述仅为本发明的具体实施方式。但是，本发明的保护范围并不限于此。本发明所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换均落在本发明的保护范围和公开范围之内。