一种有改善抑郁作用的瑞士乳杆菌菌株及其应用的制作方法

1.本发明涉及抑郁改善技术领域，尤其涉及一株有改善抑郁作用的瑞士乳杆菌及其应用。


背景技术：

2.抑郁是一类以心情抑郁、低落为主要特点的情绪障碍。抑郁症患者在心境低落的基础上常常伴有注意力不集中、失眠、反应迟钝、行为活动减少及疲乏感等其他认知、生理以及行为方面的症状。根据世界卫生组织(who)估算，目前世界范围内预计有超过3.5亿人饱受抑郁症的困扰，全球平均发病率在4.4％左右。在性别方面，女性平均发病率为5.1％，高于男性的3.6％；在年龄方面，55
‑
74岁的男性抑郁症患病率超过5.5％，55
‑
74岁的女性抑郁症患病率超过7.5％，其中60
‑
64岁女性为高危人群，发病率接近8％；近年来，中国的抑郁症群体出现明显的低龄化趋势。
3.抑郁症的治疗目前是以药物治疗为主，并结合心理治疗、物理治疗和其他治疗的综合治疗。但是长期服用药物易容产生副作用，引起如出汗、呕吐、震颤和躁郁等身体不适。因此，针对抑郁、焦虑情绪寻找一种安全有效的干预或治疗途径显得意义重大。
4.乳酸菌主要包括乳杆菌属、乳球菌属和双歧杆菌属内的一些细菌，具有调节肠道微生物菌群组成的功能。中国专利申请201780092741.9公开了鼠李糖乳杆菌hn001可用于治疗或者预防产后抑郁症以及产后焦虑症。因此，乳酸菌作为健康个体肠道菌群的重要组成部分，其在改善抑郁、缓解焦虑等功能方面存在一定的潜力。国内乳酸菌资源丰富，大力挖掘我国特有的具有改善抑郁功效的乳酸菌显得意义重大。同时改善抑郁相关的乳酸菌产品在国内市场尚属空白，筛选得到一株能够有效干预或缓解抑郁、焦虑等症状的乳酸菌株，将其应用于功能性食品产品中显得十分重要。


技术实现要素：

5.本发明的目的为提供一种有改善抑郁作用的瑞士乳杆菌菌株，可有效缓解抑郁行为。
6.本发明提供如下的技术方案：一种有改善抑郁作用的瑞士乳杆菌菌株，所述瑞士乳杆菌菌株命名为whh1889，所述瑞士乳杆菌菌株于2021年2月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.21832，微生物分类命名为瑞士乳杆菌lactobacillus helveticus。
7.本发明的瑞士乳杆菌菌株whh1889为发明人从我国西藏自治区日喀则市乡村采集的奶渣中分离得到，其16s rrna基因序列已上传至genbank数据库，登陆号：mw805391，可以通过口服的方式达到改善抑郁、缓解焦虑以及提升脑海马区5
‑
羟色胺、脑源神经营养因子bdnf水平，并降低血清皮质酮的水平的效果。进一步的研究发现，瑞士乳杆菌whh1889具备良好的耐酸耐胆盐特性、黏附特性，并具备良好的肠道屏障保护功能。
8.本发明还提供一种上述有改善抑郁作用的瑞士乳杆菌菌株的突变体，突变体为对瑞士乳杆菌whh1889进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。
9.本发明还提供一种上述瑞士乳杆菌菌株或上述突变体的菌体培养物。
10.作为本发明的优选，所述菌体培养物为菌液或菌剂。
11.本发明还提供一种组合物，含有上述瑞士乳杆菌菌株或含上述突变体或含上述菌体培养物，以及含有生理上可接受的赋形剂、载体和稀释剂的至少一种。该组合物可采用口服的方式达到改善抑郁、缓解焦虑以及提升脑海马区5
‑
羟色胺、脑源神经营养因子水平bdnf水平，并降低血清皮质酮的水平的效果。
12.作为本发明的优选，所述赋形剂、载体和稀释剂为食品、药品或保健品。
13.作为本发明的优选，所述食品为发酵乳、乳酪、含乳饮料、乳粉或发酵果蔬；所述药品和保健品为胶囊、粉剂或片剂。
14.上述瑞士乳杆菌菌株或上述突变体或上述菌体培养物或上述组合物在提高脑海马区5
‑
羟色胺水平上的应用。在抑郁小鼠模型试验中，口服瑞士乳杆菌whh1889可明显提升脑海马区5
‑
羟色胺水平。
15.上述瑞士乳杆菌菌株或上述突变体或上述菌体培养物或上述组合物在提高脑源神经营养因子水平上的应用。在抑郁小鼠模型试验中，口服瑞士乳杆菌whh1889可明显提升脑源神经营养因子bdnf水平。
16.上述瑞士乳杆菌菌株或上述突变体或上述菌体培养物或上述组合物在降低血清皮质酮水平上的应用。在抑郁小鼠模型试验中，口服瑞士乳杆菌whh1889可明显降低血清皮质酮水平。
17.本发明的有益效果如下：(1)本发明所提供的瑞士乳杆菌whh1889可有效缓解抑郁小鼠抑郁/焦虑样行为。在抑郁小鼠模型试验中，服用剂量为1
×
109cfu/d时悬尾试验抑郁样行为减少18.31％，强迫游泳试验抑郁样行为减少14.85％，旷场试验焦虑样行为减少10.30％，与10mg/kg抗抑郁药物氟西汀效果相当；(2)本发明所提供的瑞士乳杆菌whh1889能够有效的提升脑海马区5
‑
羟色胺水平和bdnf水平，并降低血清皮质酮的水平；(3)本发明所提供的瑞士乳杆菌whh1889具备良好的耐酸耐胆盐特性；(4)本发明所提供的瑞士乳杆菌whh1889具备良好的黏附特性，在ht
‑
29细胞模型试验中表现出良好的黏附能力，单细胞黏附菌数达6.28
±
0.21，是对照商业菌株lgg的2倍以上；(5)本发明所提供的瑞士乳杆菌whh1889具备良好的肠道屏障保护功能，在ipec
‑
j2细胞模型试验中表现出良好的屏障保护能力，菌株(1
×
108cfu/ml)孵育细胞12h后细胞电阻值可上升90％，显著优于对照商业菌株lgg。
附图说明
18.图1是本发明的瑞士乳杆菌whh1889的菌落培养的形态特征视图。
19.图2是本发明的瑞士乳杆菌whh1889的革兰氏染色显微镜观察的形态特征视图。
20.图3是本发明的瑞士乳杆菌whh1889的生长曲线图。
21.图4是本发明的瑞士乳杆菌whh1889的黏附试验镜检结果图。
22.图5是商业菌株lgg的黏附试验镜检结果图。
23.图6是瑞士乳杆菌whh1889与商业菌株lgg的肠道屏障电阻值动态结果图。
24.图7是不同试验组别的旷场试验小鼠轨迹图。
具体实施方式
25.下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。
26.如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。
27.一种有改善抑郁作用的瑞士乳杆菌菌株，命名whh1889，由发明人从我国西藏自治区日喀则市乡村采集的奶渣中分离得到，2021年2月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号cgmcc no.21832，微生物分类命名为瑞士乳杆菌lactobacillus helveticus，16s rrna基因序列已上传至genbank数据库，登陆号：mw805391。
28.1、瑞士乳杆菌whh1889的生物学性质形态学特征：如图1所示，在mrs琼脂培养基中生长形态为白色菌落，不透明、圆形、表面光滑湿润、边缘整齐、中央凸起。如图2所示，革兰氏染色呈典型阳性，显微镜下观察细胞呈杆状，无鞭毛，不产芽孢，不运动。
29.培养特征：最适生长温度为37℃，兼性厌氧，生长于mrs培养基中。
30.生理特征：使用api 50chl系统培养，表1中列出了本发明菌株瑞士乳杆菌whh1889的api 50chl测试的结果。
31.表1api 50结果
甘露醇
─
甲基
‑
αd
‑
吡喃葡萄糖苷
─
d
‑
来苏糖
─
赤藻糖醇
─
n
‑
乙酰葡萄糖胺+d
‑
塔格糖
─
d
‑
阿拉伯糖
─
苦杏仁苷
─
d
‑
岩藻糖
─
l
‑
阿拉伯糖
─
arbulin
─
l
‑
岩藻糖
─
d
‑
核糖
─
七叶灵柠檬酸铁
─
d
‑
阿拉伯醇
─
d
‑
木糖
─
水杨苷
─
l
‑
阿拉伯醇
─
l
‑
木糖
─
d
‑
纤维二糖
─
葡萄糖酸钾
─
d
‑
侧金盏花醇i
─
d
‑
麦芽糖
─
2酮基葡萄糖酸钾
─
甲基
‑
βd吡喃木糖苷
─
d
‑
乳糖+5酮基葡萄糖酸钾
─
d
‑
半乳糖+d
‑
密二糖
─
肌醇
─
d
‑
葡萄糖+d
‑
蔗糖
─
甘露醇
─
d
‑
果糖
─
d
‑
海藻糖
─
山梨醇
─
d
‑
甘露糖
─
菊粉
─
甲基
‑
αd
‑
吡喃甘露糖苷
─
l
‑
山梨糖
─
d
‑
松三糖
─
糖原
─
l
‑
鼠李糖
─
d
‑
棉子糖
─
木糖醇
─
卫茅醇
─
淀粉
─
d
‑
龙胆二糖
─
d
‑
土伦糖
─ꢀꢀꢀꢀ
生物学鉴定：针对16s rrna基因序列测序，所得结果于ncbi的genbank数据库中进
行同源性比对分析，结果显示该菌株为瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)，16s rrna基因序列已上传至genbank数据库(登陆号：mw805391)。
32.2、瑞士乳杆菌whh1889的培养本发明菌株瑞士乳杆菌whh1889经二代活化后，按1％接种量接种于mrs培养基中，在37℃温度下培养24h，每隔1h取样一次，测定其在600nm波长的光密度(od)值，绘制生长曲线，设置三次重复。
33.结果如图3所示，瑞士乳杆菌whh1889在经过0～2h的生长迟缓期后，从2h开始快速生长进入对数生长期，8h结束对数期进入稳定期。
34.3、瑞士乳杆菌whh1889的耐酸耐胆盐性能菌株瑞士乳杆菌whh1889、商业菌株鼠李糖乳杆菌gg(lgg)经二代活化后，取对数生长末期菌液，4000rpm离心10min，弃上清，收集菌泥，分别进行如下操作：(1)加入相同体积ph 2.0和2.5的mrs培养液，吹打混匀后，在37℃环境下孵育，用稀释涂布计数法测定0点及孵育1h、2h和4h后菌数的变化；(2)加入相同体积的含有0.3％胆盐的mrs培养液，吹打混匀后，在37℃环境下孵育，用稀释涂布计数法测定0h及孵育4h、8h后菌数的变化。
35.菌株存活率计算公式：菌株存活率(％)＝n1/n0
×
100％n1为菌株孵育后活菌数的log10值，n0为菌株初始活菌数的log10值。
36.结果如表2所示，本发明菌株具有良好的耐受特性。在ph 2.0环境下，孵育2h存活率88.39％，孵育4h存活率为73.03％，对照商业菌株lgg在1h后已检测不到活菌数；在ph 2.5环境下，孵育4h存活率为99.71％，高于商业菌株lgg孵育4h的存活率(99.16％)，因此，本发明菌株耐酸性优于商业菌株lgg。
37.在0.3％胆盐浓度下，孵育8h存活率为95.67％，与具有优秀耐胆盐特性的商业菌株lgg相似。
38.表2耐受性结果表2耐受性结果
‑
：未检测到。
39.4、瑞士乳杆菌whh1889的黏附性
建立ht
‑
29细胞培养体系，细胞生长于含10％胎牛血清的dmem培养基中(含青霉素100u/ml，链霉素100mg/ml)。待细胞传至第三代，采用0.25％的胰酶(含edta)消化，获得单细胞悬液，细胞以1
×
106细胞/孔的密度接种于已放置细胞爬片的12孔细胞培养板中，于37℃，5％co2培养箱中培养2d。
40.本发明菌株瑞士乳杆菌whh1889和对照商业菌株鼠李糖乳杆菌gg(lgg)经二代活化后，取对数生长末期菌液，4000rpm离心10min，弃上清，获得菌泥，重悬于含10％胎牛血清的dmem完全培养基(不加双抗)中，取1
×
108cfu/ml的菌液1ml接种于上述12孔细胞培养板中，37℃下于5％co2培养箱中孵育2h。孵育结束后，缓慢吸去培养液，用pbs洗涤3次，用100％甲醇固定8min。取出细胞爬片静置20min，经革兰氏染色后，用中性树脂封片。于光学显微镜下进行观察，设置三次重复，每个片子随机选取10个视野计数。
41.结果如表3和图4、图5所示，瑞士乳杆菌whh1889的单细胞黏附数达6.23
±
0.21，显著优于对照商业菌株lgg(2.80
±
0.23)。
42.表3黏附性结果菌株编号黏附率(菌数/细胞数)lgg2.80
±
0.23whh18896.23
±
0.21***与对照商业菌株相比，***：差异极显著，p<0.001。
43.5、瑞士乳杆菌whh1889的肠道屏障保护功能建立ipec
‑
j2细胞培养体系，细胞生长于含10％胎牛血清的dmem培养基中(含青霉素100u/ml，链霉素100mg/ml)。待细胞传至第三代，采用0.25％的胰酶(含edta)消化，获得单细胞悬液，细胞以1
×
106细胞/孔的密度接种于24孔transwell细胞(小室孔径0.4μm)培养板中，于37℃，5％co2培养箱中培养7d。
44.本发明菌株瑞士乳杆菌whh1889和对照商业菌株鼠李糖乳杆菌gg(lgg)经二代活化后，取对数生长末期菌液，4000rpm离心10min，弃上清，获得菌泥，重悬于含10％胎牛血清的dmem完全培养基(不加双抗)中，取1
×
108cfu/ml的菌液1ml接种于上述24孔transwell小室内(呈上下、左右轻微振荡混匀)，37℃下于5％co2培养箱中孵育12h。试验于0、2、4、6、8、10和12h分别将transwell细胞板取出，采用millicell ers
‑
2电阻仪对不同细菌处理后肠道屏障小室的电阻值进行检测，试验设置三次重复。根据公式，随后对电阻值进行数据统计统计。
45.电阻值teer计算公式：teer＝(电阻值
‑
空白电阻值)
×
膜面积teer变化率(％)＝(teer/初始teer)
×
100
‑
100。
46.结果如图6所示。图6中，*：表示与lgg组相比，差异显著，p<0.05；**：表示与lgg组相比，差异极显著，p<0.01；***：表示与lgg组相比，差异极显著，p<0.001。
47.从图6中可以看出，瑞士乳杆菌whh1889在孵育12h的肠道屏障电阻值增加92.69％
±
1.04％，显著优于对照商业菌株lgg(66.43％
±
2.22％)。
48.7、瑞士乳杆菌whh1889的改善抑郁功效本发明采用健康的spf级雄性balb/c小鼠(4
‑
5周龄，22
±
0.2g)，建立慢性不可预见性温和抑郁小鼠模型(cums)。同时每天灌胃瑞士乳杆菌whh1889菌株，活菌数1
×
109cfu/
ml，试验为期32天，最后检测抑郁小鼠抑郁/焦虑样行为、脑部5
‑
羟色胺和bdnf水平，以及血清皮质酮水平，来判断该菌株是否具有改善抑郁的功效。
49.7.1改善抑郁/焦虑样行为小鼠饲养于室温26
±
0.5℃、湿度50
‑
60％、昼夜明暗交替时间(12/12h)的洁净环境中。饲养期间，小鼠可自由采食和饮水。cums小鼠致郁项目包括：束缚6h、4℃冰水游泳1min、禁食24h、禁水24h、潮湿环境24h和无垫料环境24h等，试验组小鼠每天随机进行一项项目。
50.小鼠随机分为4组，每组10只。分组如下：对照组：正常小鼠，灌胃200μl无菌生理盐水抑郁组：cums抑郁小鼠，灌胃200μl无菌生理盐水药物组：cums抑郁小鼠，灌胃200μl无菌氟西汀液(10mg/kg/d)whh1889组：cums抑郁小鼠，灌胃200μl本发明菌株悬液(1
×
109cfu/d)试验32天后，对试验小鼠进行行为学检测，通过悬尾试验和强迫游泳试验评价小鼠抑郁样行为，采用旷场试验评价小鼠的焦虑样行为。
51.试验小鼠抑郁样行为结果如表4所示，抑郁组小鼠悬尾试验不动时间和强迫游泳试验不动时间均显著高于对照组小鼠(p<0.05)，表明造模成功。瑞士乳杆菌whh1889组小鼠悬尾试验不动时间(p<0.05)和强迫游泳试验不动时间(p<0.05)均显著低于抑郁组小鼠，与对照组小鼠差异不显著(p>0.05)，表明瑞士乳杆菌whh1889服用浓度在1
×
109cfu/d具有缓解抑郁小鼠抑郁样行为的能力。瑞士乳杆菌whh1889组小鼠悬尾试验不动时间与药物组差异不显著(p>0.05)，同时强迫游泳试验不动时间显著低于药物组(p<0.05)，表明瑞士乳杆菌whh1889服用浓度在1
×
109cfu/d缓解抑郁样行为的功效与药物氟西汀(10mg/kg)相当。
52.试验小鼠焦虑样行为结果如表4和图7所示，瑞士乳杆菌whh1889组小鼠旷场试验中央探索时间显著高于抑郁组小鼠(p<0.05)，表明瑞士乳杆菌whh1889服用浓度在1
×
109cfu/d具有缓解抑郁小鼠焦虑样行为的能力。同时，与药物组无显著差异(p>0.05)，说明瑞士乳杆菌whh1889服用浓度在1
×
109cfu/d缓解焦虑样行为的功能与药物氟西汀(10mg/kg)相当。
53.表4小鼠行为学结果a，b，c：差异显著，p<0.05。
54.7.2降低血清皮质酮水平在7.1中的小鼠行为学检测结束后，1％戊巴比妥钠(0.5ml/100g bw)麻醉，采用心脏穿刺取血获得小鼠血液样本，将血液样本取出后，静置30min，4℃，4000rpm离心15min，取上清，用elisa试剂盒检测血清皮质酮含量。
55.试验小鼠血清皮质酮水平如表5所示，抑郁组小鼠血清皮质酮浓度显著高于对照
组小鼠(p<0.05)，表明造模成功。瑞士乳杆菌whh1889组小鼠血清皮质酮浓度显著低于抑郁组小鼠(p<0.05)，表明瑞士乳杆菌whh1889服用浓度在1
×
109cfu/d具有回调抑郁小鼠血清皮质酮浓度水平的能力。
56.表5小鼠抑郁相关生物学指标结果a，b，c：差异显著，p<0.05。
57.7.3提升脑海马区5
‑
羟色胺和bdnf水平在7.1中的小鼠行为学检测结束后，脱颈处死后，解剖取大脑海马区组织，匀浆后用elisa试剂盒检测海马区5
‑
羟色胺和bdnf浓度。
58.(1)试验小鼠脑海马区5
‑
羟色胺水平如表5所示，抑郁组小鼠脑海马区5
‑
羟色胺浓度显著低于对照组小鼠(p<0.05)，表明造模成功。瑞士乳杆菌whh1889组小鼠脑海马区5
‑
羟色胺浓度显著高于抑郁组小鼠(p<0.05)，与对照组小鼠差异不显著(p>0.05)，表明瑞士乳杆菌whh1889服用浓度在1
×
109cfu/d具有上调抑郁小鼠脑海马区5
‑
羟色胺水平的能力。同时，与药物组无显著差异(p>0.05)，说明瑞士乳杆菌whh1889服用浓度在1
×
109cfu/d对脑海马区5
‑
羟色胺水平的调节能力与药物氟西汀(10mg/kg)相似。
59.(2)试验小鼠脑海马区bdnf水平如表5所示，抑郁组小鼠脑海马区bdnf浓度显著低于对照组小鼠(p<0.05)，表明造模成功。瑞士乳杆菌whh1889组小鼠脑海马区bdnf浓度显著高于抑郁组小鼠(p<0.05)，与对照组小鼠差异不显著(p>0.05)，表明瑞士乳杆菌whh1889服用浓度在1
×
109cfu/d具有上调抑郁小鼠脑海马区bdnf水平的能力。同时，与药物组无显著差异(p>0.05)，说明瑞士乳杆菌whh1889服用浓度在1
×
109cfu/d对脑海马区bdnf水平的调节能力与药物氟西汀(10mg/kg)相当。
60.现有研究表明抑郁、焦虑与人体肠道微生物失衡密切相关，如与正常人相比，抑郁患者肠道内拟杆菌属(bacteroides)的相对丰度较高，而布劳特氏菌属(blautia)和真杆菌属(eubacterium)的相对丰度较低。而乳酸菌具有调节肠道微生物菌群组成的功能，乳酸菌改善抑郁作用主要是通过帮助抑郁患者恢复肠道稳态的路径实现的。
61.但从表4和表5分析可知，本发明的瑞士乳杆菌whh1889菌株不仅可以显著缓解抑郁/焦虑行为，而且可通过回调脑海马区5
‑
羟色胺、bdnf和血液皮质酮水平的路径来改善抑郁作用。这与已知的乳酸菌改善抑郁作用的机制存在明显的区别。
62.总之，口服瑞士乳杆菌whh1889菌株能显著缓解抑郁/焦虑样行为，回调脑海马区5
‑
羟色胺、bdnf和血液皮质酮水平，尤其是服用浓度在1
×
109cfu/d时效果最为显著，是一株具有改善抑郁功能的新菌株。
63.8、应用实施例实施例1瑞士乳杆菌whh1889冻干菌粉的制作本发明菌株瑞士乳杆菌whh1889以1％的接种量接种于10ml液体mrs培养基中，在
37℃恒温培养箱中培养8h(一代种子液)，以此传至两代。二代种子1％的接种量接种于10l含有液体mrs培养基的发酵罐中，37℃培养8h，收集菌液，8000rpm离心10min收集菌体，用0.9％生理盐水洗涤一次，加入四倍菌泥量的含有脱脂乳粉、葡萄糖、甘油的保护剂中重悬，真空冷冻干燥，菌粉真空包装。制得菌粉活菌数可达1
×
10
11
cfu/g，可用于含有瑞士乳杆菌whh1889的具有改善抑郁功能相关药品、保健品、食品、饮料或发酵剂产品等组合物的制作和生产。
64.实施例2瑞士乳杆菌whh1889发酵乳的制作准确称取脱脂乳100g，45
‑
50℃纯净水900g，50℃温水溶解，剪切20min，50℃水化30min，均质，95℃杀菌5min。降温后，按1％接种量接入应用实施例1中的瑞士乳杆菌whh1889发酵剂，37℃发酵10h，4℃后熟12h。观察其凝乳状态，用打蛋器破乳后，检测其拉丝长度、ph、酸度、黏度和活菌数，设置三次重复，结果表6所示。
65.表6瑞士乳杆菌whh1889发酵乳特性ph酸度(
°
t)黏度(cp)活菌数(cfu/ml)4.40
±
0.0296
±
0.753289
±
9.211.20e+09瑞士乳杆菌whh1889的发酵乳凝乳状态紧实，表面光滑，有少量清洗出，破乳后，经较长时间搅拌丝滑粘稠，无拉丝，活菌数达1.20
×
109cfu/ml，感官和风味良好，奶香浓郁，口感细腻丝滑，该发酵乳即为含有瑞士乳杆菌whh1889的具有改善抑郁功能的发酵乳。
66.本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
67.以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。