一种高效生物秸秆发酵菌剂及其制备方法与流程

1.本发明属于农用微生物技术领域，具体涉及一种高效生物秸秆发酵菌剂及其制备方法。


背景技术：

2.我国农作物秸秆的产量高，利用率低，焚烧和堆放在田间地头会造成巨大的资源浪费和环境污染。秸秆主要含有纤维素、半纤维素、木质素、蛋白质及灰分物质，纤维素类物质在自然状态下降解率不高，往往降低了秸秆的再利用水平。
3.目前秸秆的综合利用有多种途径。秸秆能源化会产生二次污染并且总利用率低。直接还田的降解周期长，还会增加来年耕作难度；作为动物饲料，由于其纤维素、半纤维素和木质素的含量高，蛋白含量低，适口性差，使得秸秆的消化率低和营养价值低，有效提高消化率和营养价值可以改善秸秆的再利用价值；堆沤还田是利用微生物将大部分有机质转化为腐殖质，使秸秆中的氮磷钾等被转化为可利用的状态再应用于土壤中。而秸秆腐熟后还田，不仅能够使有机物料转化为有机肥，同时具有增加土壤肥力、减量化肥、促进秸秆回收利用、保护环境等多方面的功效。
4.生物发酵秸秆可以降低其纤维素、木质素含量，并提高蛋白含量，提高秸秆的营养价值和利用率。微生物的生长和繁殖会分泌大量酸类、酶类，酶类可以将秸秆中的木聚糖链和木质素聚合物酯链进行酶解，酸类可以软化秸秆。发酵过程中有益微生物的繁殖还会抑制其他有害细菌的生长。自然环境中秸秆降解缓慢，纤维素酶活力低限制着纤维素的降解，制约着秸秆的再利用，在秸秆中加入微生物有助于加快秸秆的降解。
5.而目前秸秆用微生物发酵菌剂，存在着菌剂活性差，产酶活性不高，导致秸秆发酵不充分，发酵效率低，且功能单一，很难在农业种植领域得到有效的应用。


技术实现要素：

6.本发明提供一种秸秆发酵菌剂，其可实现秸秆的高效发酵，活化土壤，减量化肥，促进秸秆在农业领域的高效循环利用。为实现上述技术目的，本发明所采用的技术方案为：
7.一种高效生物秸秆发酵菌剂，包括奇异酵母，保藏编号为cgmcc2.5692；噬果胶黄杆菌，保藏编号为cgmcc 1.12362和苏云金芽孢杆菌，保藏编号为cgmcc1.15822。
8.具体的，是将每种菌株单独培养，得种子菌剂，在进行扩繁培养后混合，得到混合菌剂。
9.一种高效生物秸秆发酵菌剂的制备方法，包括以下步骤：
10.(1)将奇异酵母、噬果胶黄杆菌、苏云金芽孢杆菌分别接种与牛肉膏蛋白胨培养基上活化，分别得到种子菌剂；
11.(2)按照1％的接种量分别接种于lb液体培养基中扩大培养，振荡培养至菌含量均为o.d 600≈2.0，然后按照1:1:1的体积比混合即得。
12.进一步的，步骤(1)活化方法为：将奇异酵母、噬果胶黄杆菌、苏云金芽孢杆菌分别
接种与牛肉膏蛋白胨培养基在28
‑
32℃，ph7.0
‑
7.2下，摇床震荡培养5
‑
10小时，震荡速度为120
‑
180rpm，得奇异酵母、噬果胶黄杆菌、苏云金芽孢杆菌活化种子菌剂。
13.进一步的，所述牛肉膏蛋白胨培养基各原料重量份的组成为：nacl 1
‑
5份、牛肉膏13
‑
20份、蛋白胨15
‑
20份、琼脂9
‑
13份、蒸馏水800
‑
1200份。
14.进一步的，步骤(2)lb液体培养基的组成为：胰蛋白胨8
‑
10份、酵母提取物5
‑
8份、nacl 1
‑
5份、蒸馏水800
‑
1000份；参数条件为：ph值7.2—7.4，120℃灭菌20min。
15.本发明奇异酵母(saccharomyces paradoxus)，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(china general microbiological culture collection center,cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年12月5日，保藏编号为cgmcc2.5692。
16.本发明噬果胶黄杆菌(flavobacterium pectinovorum)，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(china general microbiological culture collection center,cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2012年10月15日，保藏编号：cgmcc 1.12362。
17.本发明苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(china general microbiological culture collection center,cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年9月10号，保藏编号：cgmcc 1.15822。
18.本发明生物菌剂的使用方法为：
19.首先，将秸秆粉碎烘干后备用，再将菌液和秸秆粉按照质量比1:10混合，调节物料含水量至60％，打堆发酵，自然状态下发酵30d，每4d翻堆一次，发酵完成后得秸秆生物有机肥。
20.本发明奇异酵母、噬果胶黄杆菌、苏云金芽孢杆菌均可以分泌纤维素酶、木聚糖酶等活性物质，可以有效降解纤维素等物质，所选奇异酵母可以促进发酵的快速完成，噬果胶黄杆菌同时具备分泌iaa、产铁载体、溶磷和解钾的特性，苏云金芽孢杆菌不仅可以有效降解纤维素酶，其也是一种重要的生防菌剂，所产生的活性物质可以与作物病原菌的互作过程中产生的蛋白激发子能激发植物防御反应，提高植物免疫力，预防或减轻病害发生，从而提升产量。三者按照特定比例组合，混合发酵协同增效，所得到的生物菌剂可以实现对于秸秆的最优化发酵，而发酵后得到的生物有机肥，可以有效促进作物生长，提高作物抗病能力，同时作为一种使用秸秆发酵的生物有机肥，可有效改善土壤物理性状，增加土壤肥力，减量化肥，促进秸秆回收利用、保护环境等多方面的功效，具有广阔的经济效益和市场效益。
具体实施方式
21.下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但不限于此。
22.实施例1
23.一种高效生物秸秆发酵菌剂，包括奇异酵母，保藏编号为cgmcc2.5692；噬果胶黄杆菌，保藏编号为cgmcc 1.12362和苏云金芽孢杆菌，保藏编号为cgmcc1.15822。
24.具体的，是将每种菌株单独培养，得种子菌剂，在进行扩繁培养后混合，得到混合菌剂。
25.一种高效生物秸秆发酵菌剂的制备方法，包括以下步骤：
26.(1)将奇异酵母、噬果胶黄杆菌、苏云金芽孢杆菌分别接种与牛肉膏蛋白胨培养基上活化，分别得到种子菌剂；
27.(2)按照1％的接种量分别接种于lb液体培养基中扩大培养，振荡培养至菌含量均为o.d 600≈2.0，然后按照1:1:1的体积比混合即得。
28.进一步的，步骤(1)活化方法为：将奇异酵母、噬果胶黄杆菌、苏云金芽孢杆菌分别接种与牛肉膏蛋白胨培养基在28℃，ph7.0
‑
7.2下，摇床震荡培养5小时，震荡速度为120rpm，得奇异酵母、噬果胶黄杆菌、苏云金芽孢杆菌活化种子菌剂。
29.进一步的，所述牛肉膏蛋白胨培养基各原料重量份的组成为：nacl 1份、牛肉膏13份、蛋白胨15份、琼脂9份、蒸馏水800份。
30.进一步的，步骤(2)lb液体培养基的组成为：胰蛋白胨8份、酵母提取物5份、nacl1份、蒸馏水800份；参数条件为：ph值7.2，120℃灭菌20min。
31.本发明奇异酵母(saccharomyces paradoxus)，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(china general microbiological culture collection center,cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年12月5日，保藏编号为cgmcc2.5692。
32.本发明噬果胶黄杆菌(flavobacterium pectinovorum)，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(china general microbiological culture collection center,cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2012年10月15日，保藏编号：cgmcc 1.12362。
33.本发明苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(china general microbiological culture collection center,cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年9月10号，保藏编号：cgmcc 1.15822。
34.实施例2
35.一种高效生物秸秆发酵菌剂，包括奇异酵母，保藏编号为cgmcc2.5692；噬果胶黄杆菌，保藏编号为cgmcc 1.12362和苏云金芽孢杆菌，保藏编号为cgmcc1.15822。
36.具体的，是将每种菌株单独培养，得种子菌剂，在进行扩繁培养后混合，得到混合菌剂。
37.一种高效生物秸秆发酵菌剂的制备方法，包括以下步骤：
38.(1)将奇异酵母、噬果胶黄杆菌、苏云金芽孢杆菌分别接种与牛肉膏蛋白胨培养基上活化，分别得到种子菌剂；
39.(2)按照1％的接种量分别接种于lb液体培养基中扩大培养，振荡培养至菌含量均为o.d 600≈2.0，然后按照1:1:1的体积比混合即得。
40.进一步的，步骤(1)活化方法为：将奇异酵母、噬果胶黄杆菌、苏云金芽孢杆菌分别接种与牛肉膏蛋白胨培养基在32℃，ph7.0
‑
7.2下，摇床震荡培养10小时，震荡速度为180rpm，得奇异酵母、噬果胶黄杆菌、苏云金芽孢杆菌活化种子菌剂。
41.进一步的，所述牛肉膏蛋白胨培养基各原料重量份的组成为：nacl5份、牛肉膏20份、蛋白胨20份、琼脂13份、蒸馏水1200份。
42.进一步的，步骤(2)lb液体培养基的组成为：胰蛋白胨10份、酵母提取物8份、nacl5
份、蒸馏水1000份；参数条件为：ph值7.2—7.4，120℃灭菌20min。
43.本发明奇异酵母(saccharomyces paradoxus)，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(china general microbiological culture collection center,cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年12月5日，保藏编号为cgmcc2.5692。
44.本发明噬果胶黄杆菌(flavobacterium pectinovorum)，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(china general microbiological culture collection center,cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2012年10月15日，保藏编号：cgmcc 1.12362。
45.本发明苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(china general microbiological culture collection center,cgmcc)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年9月10号，保藏编号：cgmcc 1.15822。
46.实施例3
47.微生物分泌纤维素酶能力测试
48.将实施例1
‑
2活化后的奇异酵母、噬果胶黄杆菌、苏云金芽孢杆菌种子菌剂，分别滴到刚果红培养基上进行培养，培养菌落至周围出现透明圈后，用0.02％刚果红溶液染色20min，1mol/l氯化钠溶液脱色20min后计算透明圈直径d、菌落直径d。根据透明圈直径(d)与菌落直径(d)的比值(h＝d/d)来初步判断该待测菌株降解纤维素的能力，h值越大表明该待测菌株降解纤维素的能力越强。
49.刚果红培养基的组成为：cmc
‑
na 10g，kno31 g，k2hpo40.5 g，mgso40.5 g，nacl 1.5g，刚果红0.2g，水1l，121℃灭菌30min。
50.试验结果如下表所示：
51.表1菌株透明圈直径d与菌落直径d的比值h
52.菌株奇异酵母噬果胶黄杆菌苏云金芽孢杆菌h值2.963.041.99
53.通过刚果红纤维素鉴别培养基培养后，只有纤维素分解菌周围才会形成透明圈。说明本发明三种菌株均可以产降解纤维素酶，能够用于秸秆的发酵。
54.测试例
55.设置对比试验，以验证本发明菌剂对于秸秆的发酵效果。测定发酵中期纤维素酶和木聚糖酶活性以判断发酵效果。
56.发酵方法为：将秸秆粉碎烘干后备用，再将菌液和秸秆粉按照质量比1:10混合，调节物料含水量至60％，打堆发酵，自然状态下发酵30d，每4d翻堆一次，于15d时候取样测试。
57.测试方法为：
58.(1)纤维素酶活测定
59.纤维素酶酶活采用羧甲基纤维素糖化力法(李兰晓，杜金华，李军训，等.cmc糖化力法测定纤维素酶活性条件的研究，饲料工业，2006，27(24)：49
‑
52)。纤维素酶酶活定义：在40℃、p h 4.6的条件下，1min水解羧甲基纤维素产生1.0μg葡萄糖的酶量定义为1个酶活单位(u/g)。
60.(2)木聚糖酶活测定
61.木聚糖酶酶活测定参考国标gb/t 23874—2009的方法。木聚糖酶酶活定义：在37℃、p h 5.5的条件下，每分钟从质量浓度为5mg/m l的木聚糖溶液中降解释放1mol还原糖所需要的酶量为1个酶活力单位(u/g)。
62.表2发酵效果实验结果
[0063][0064]
大田实验
[0065]
将使用实施例和对比例微生物菌剂制备秸秆生物有机肥，以验证肥效：
[0066]
生物有机肥制备方法为：将秸秆粉碎烘干后备用，再将菌液和秸秆粉按照质量比1:10混合，调节物料含水量至60％，打堆发酵，自然状态下发酵30d，每4d翻堆一次，发酵完成后得秸秆生物有机肥。
[0067]
试验于水稻田内进行，选择水稻作为水稻秸秆有机肥试验的目标作物，建立水稻秸秆有机肥肥效评价试验点。供试水稻品种为“甬优1540”，选择前期种植模式、环境特征基本一致的田块进行试验。
[0068]
实验设计
[0069]
试验共设11个处理，分别为实施例1
‑
2和对比例1
‑
8，小区面积均为60m2。在水稻移栽前，有机肥作基肥一次性施入，施用量均为1000kg/亩，空白对照(ck)为不施加任何肥料。
[0070]
试验前按照耕层土壤采样方法采集土壤样品，并进行分析测定，采集5个以上该地块的土样进行混合，风干后采用四分法进行土样制备，测定土壤的有机质含量、ph。水稻收获时，采用同样方法采集各处理耕层土壤样品4个，并进行检测分析。试验期间定期记录水稻生长情况，并记录主要农事操作，成熟时对水稻进行测产。实验结果如下表所示：
[0071]
表3水稻种植效果
[0072][0073]
通过上述实验结果可以看出，本发明三种菌株组成的微生物菌剂，相互之间协同配合，高效分泌活性酶，促进秸秆的腐熟和分解。制备成有机肥后，有效提升了水稻产量，增加土壤有机质，活化土壤，一定程度上可以替代化肥使用，降低化肥对土壤的不良影响，促进农业的持续和良性发展，具有潜在的经济效益和社会效益。
[0074]
需要说明的是，上述实施例仅仅是实现本发明的优选方式的部分实施例，而非全部实施例。显然，基于本发明的上述实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他所有实施例，都应当属于本发明保护的范围。