一种表达犬细小病毒2a型VP2的重组犬瘟热病毒

一种表达犬细小病毒2a型vp2的重组犬瘟热病毒
技术领域
1.本发明属于重组病毒构建技术领域，具体涉及一种表达犬细小病毒2a型vp2(viral protein 2)的重组犬瘟热病毒。


背景技术：

2.犬瘟热和犬细小病毒性肠炎是犬的两种常见传染病，分别由犬瘟热病毒(canine distemper virus,cdv)和犬细小病毒2型(canine parvovirus type 2,cpv
‑
2)感染而引发，具有较高的发病率和致死率。cdv宿主广泛，犬科动物、鼬科动物、猫科动物等均易感染。动物感染cdv的临床症状通常是呼吸系统、胃肠消化系统、表皮黏膜和中枢神经系统症状，伴随着双相热、全身不适和病毒血症。犬细小病毒性肠炎主要表现为心肌炎(幼犬)和出血性肠炎(成年犬)。幼犬的心肌炎临床表现为突然发病，呼吸困难、心律不齐，偶见腹泻、呕吐及体温升高，病犬大多突然死亡。成年犬的出血性肠炎表现为呕吐，腹泻，排泄茄汁样血便且便稀恶臭，体温升高，食欲低下或废绝，反应迟钝，病犬迅速消瘦、衰竭、进而死亡。
3.cdv属于副粘病毒科(paramyxoviridae)、麻疹病毒属(morbillivirus)成员。病毒基因组为单股、负链、线性的rna，全长15 690nt，编码六个结构蛋白(n、p、m、f、h、l蛋白)和两个非结构蛋白(c、v蛋白)。病毒经纯化后电镜下观察形状不定，但多呈球形或椭球形，外披脂质囊膜，囊膜外表面嵌有铆钉状纤突。cdv是一种理想的病毒表达载体，可在机体内有效地表达外源抗原以诱导特异性免疫应答反应。借助反向遗传技术，可将外源抗原插入至cdv cdna克隆，然后拯救重组cdv，进而验证其在体外和体内对于外源抗原的表达能力。
4.cpv
‑
2属于细小病毒科(parvoviridae)、原细小病毒属(protoparvovirus)成员。cpv
‑
2又分为三个抗原变异的亚型，分别为cpv
‑
2a、cpv
‑
2b、cpv
‑
2c。cpv
‑
2基因组为单股dna病毒，两端为“y”字型结构。病毒粒子无囊膜，呈二十面体对称。病毒衣壳由60个亚单位构成，其中vp1为5至6个拷贝，vp2为54至55个拷贝，因此vp2在病毒粒子中起到了最关键的作用。现已证明，通过基因工程技术表达的vp2，可诱导机体产生有效的免疫保护作用。


技术实现要素：

5.本发明目的是提供一种表达犬细小病毒2a型vp2的重组犬瘟热病毒(rcdv
‑
vp2)，从而弥补现有技术的不足。
6.本发明提供一种用于拯救表达cpv
‑
2a vp2的重组cdv核酸片段(rcdv
‑
vp2 cdna clone)，所述核酸片段的结构为5
′‑
n
‑
p
‑
vp2
‑
m
‑
f
‑
h
‑
l
‑3′
；其中n、p、m、f、h、l分别为犬瘟热病毒cdv的结构基因；vp2为犬细小病毒cpv
‑
2a vp2的开放阅读框(orf)；
7.进一步地，为了潜在提高vp2的表达效率，在vp2 orf的5
′
末端添加kozak序列；vp2 orf上游包含m基因起始序列(m gs)，下游包含p基因终止序列(p ge)。
8.作为实施例的一种具体记载，所述核酸片段的序列为seq id no:1；
9.本发明所提供的核酸片段用于在细胞内拯救能够表达犬细小病毒2a型vp2的重组犬瘟热病毒；
cdna clone质粒及分别表达n、p、l蛋白的真核表达质粒共转染bsr
‑
t7/5细胞，四者每孔的转染量分别为4μg、2μg、1μg、1μg。按每孔加150μl opti
‑
mem和16μl lipofectamine 2000的比例配制溶液i。再按每孔加150μl opti
‑
mem和8μg质粒配制溶液ii。将溶液i和ii轻柔混匀，室温放置15min以形成脂质体
‑
dna复合物。吸弃6孔板培养基，每孔加1ml opti
‑
mem，逐滴加入脂质体
‑
dna混合液。将6孔板置于co2培养箱转染6h，吸弃转染液，加入dmem，置于培养箱中培养72h。
29.实施例3、rcdv
‑
vp2的盲传及鉴定
30.用胰酶将共转染72h后的bsr
‑
t7/5细胞消化，与vds细胞混合后在t25培养瓶中继续培养，48h后便可观察到细胞病变(图2)，该代次为第1代(p1代)病毒。将重组病毒在vds细胞中连续传代，每代都会出现合胞体病变，第3代病变如图2。收获第7代病毒液，提取总rna进行rt
‑
pcr检测。上游引物序列：5
′‑
tcaagagtattactcatgcttaa
‑3′
，下游引物序列：5
′‑
tcgaagtcgtacacctcagtcat
‑3′
，扩增2037bp片段。rt
‑
pcr反应采用primescript
tm high fidelity one step rt
‑
pcr kit(takara)，反应条件设定如下，45℃10min,94℃2min,经历30个循环：98℃(10s),55℃(15s),68℃(21s)。为消除残留质粒污染，另设pcr对照。pcr反应采用2
×
primestar max premix(takara)，反应条件设定为30个循环：98℃(10s),55℃(10s),72℃(10s)。rt
‑
pcr和pcr的电泳结果如图3所示，仅rt
‑
pcr扩增出了特异性条带。将该条带切下，核酸经回收后进行sanger测序，结果与对应序列相符。
31.实施例4、rcdv
‑
vp2感染及vp2表达的间接免疫荧光(ifa)分析
32.将vds细胞分别感染rcdv
‑
vp2和野生型犬瘟热病毒(wt
‑
cdv)，未感染细胞设为对照，24h后4％多聚甲醛固定30min。pbs洗涤细胞4次，将细胞用0.4％triton x
‑
100通透30min，pbs洗涤细胞3次。37℃条件下，封闭液封闭1h。37℃条件下，细胞分别用稀释的cdv单抗和vp2单抗孵育2h，pbs洗涤3次。37℃条件下，cdv单抗及vp2单抗孵育的细胞分别用alexa555及488二抗孵育1h，pbs洗涤细胞3次，alexa488二抗孵育的rcdv
‑
vp2感染细胞采用dapi染核15min。细胞经90％甘油包被，荧光显微镜下观察。结果表明，rcdv
‑
vp2及wt
‑
cdv感染的细胞，经cdv单抗及alexa555二抗孵育后，呈现红色合胞体形态(图4)，说明rcdv
‑
vp2拯救成功。同时，rcdv
‑
vp2感染的细胞，经vp2单抗及alexa488二抗孵育后，呈现绿色合胞体形态(图5)，说明vp2得以表达。另外，dapi染核表明，经表达的vp2定位于细胞核(图5)。
33.实施例5、rcdv
‑
vp2的生长动力学
34.将vds细胞接种五个12孔板(106细胞/孔，6孔/板)，37℃培养2h。将第15代rcdv
‑
vp2和wt
‑
cdv分别接种细胞板(moi＝0.0002，3孔/病毒)，37℃感染3h，吸弃上清液，补加dmem，37℃孵育。感染后0、24、48、72h、96h，分别随机取出一个培养板，冻融两次，离心收集上清，测定病毒滴度。将测得结果绘制生长曲线，结果如图6所示，0至48h是rcdv
‑
vp2的对数生长期，峰值滴度为9.2
×
104tcid
50
/ml。
35.实施例6、vp2在重组病毒传代过程中的稳定性
36.将rcdv
‑
vp2在vds细胞中连续传代(72h/代)，共计30代。随机选取三个代次(第7、24、29代)病毒液，采用cpv
‑
2试纸条对vp2的表达进行分析，结果皆为阳性，如图7所示，图中“c”和“t”分别代表“control”和“test”线。对第20、30代病毒液进行rt
‑
pcr检测，如图8所
示，电泳结果皆为阳性。
37.上述结果表明，本发明方法制备的重组cdv，可以较理想地表达vp2。重组病毒可以在细胞内稳定复制传代至少30个代次。
38.尽管参考其示例性实施方案，对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离本发明说明书具体技术思路的情况下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。