T淋巴细胞及其应用的制作方法

t淋巴细胞及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物制药领域，具体地，本发明涉及t淋巴细胞及其应用，更具体地，本发明涉及t淋 巴细胞、慢病毒、转基因淋巴细胞、构建体、制备t淋巴细胞或者转基因淋巴细胞的方法、治疗癌症的 治疗组合物以及提高淋巴细胞活性的方法。


背景技术：

2.血液肿瘤是中国十大高发恶性肿瘤之一，占肿瘤发病率的第六位。尤其是急性淋巴细胞白血病多发 于青少年，是35岁以下人群发病率、病死率最高的恶性肿瘤，其中b-all(急性b淋巴细胞白血病) 最为常见。
3.有研究表明，大约90％的r/r b-all病人在接受car-t19(表达靶向cd19 car的淋巴细胞)后 获得完全缓解(cr)，尽管有起始响应率很高，但是很多病人出现复发，超过30％的使用blinatumomab 治疗的复发的病人和超过60％的使用过car-t19的复发病人为cd19抗原靶点丢失，致使cd19特异 性免疫疗法无法识别恶性细胞。这些现象同时也解释了抗原特异性免疫疗法的优势与劣势。
4.在car-t19治疗过程中复发主要有两种形式，第一种是病人早期丢失car-t19而出现复发，另一 种是car-t19还在但出现了cd19-白血病，这一种在接受blinatumomab之后也出现了。
5.因此，car-t细胞仍需要进一步开发和改进。


技术实现要素：

6.本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
7.在本发明的第一方面，本发明提出了一种t淋巴细胞。根据本发明的实施例，所述t淋巴细胞表达 嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括：胞外区，所述胞外区包括第一单链抗体、第二单链抗体、第一 连接肽以及cd8铰链区，所述第一单链抗体特异性识别第一抗原，所述第二单链抗体特异性识别第二 抗原，所述第一连接肽设置于所述第一单链抗体和第二单链抗体之间，所述第一单链抗体包括第一重链 可变区和第一轻链可变区以及第二连接肽，所述第二连接肽设置于所述第一重链可变区和第一轻链可变 区之间，所述第二单链抗体包括第二重链可变区和第二轻链可变区以及第三连接肽，所述第三连接肽设 置于第二重链可变区和第二轻链可变区之间，所述第一连接肽具有一个重复的ggggs的氨基酸序列， 所述第二连接肽和第三连接肽分别独立地具有2～6个重复的ggggs的氨基酸序列；跨膜区，所述跨膜 区与所述胞外区相连，所述跨膜区包括cd8的跨膜段，并且嵌入到所述t淋巴细胞的细胞膜中；以及 胞内区，所述胞内区与所述跨膜区相连，并且所述胞内区包括4-1bb的胞内段以及cd3ζ链。根据本发 明实施例的t淋巴细胞，可特异性杀伤第一抗原和第二抗原的单/双阳性的肿瘤细胞，且相比现有技术， 在体内具有更长久、更有力地的肿瘤细胞杀伤和清除效果。
8.根据本发明的实施例，上述t淋巴细胞还可以进一步包括如下附加技术特征至少
之一：
9.根据本发明的实施例，所述第一单链抗体为cd19单链抗体，所述第二单链抗体为cd22单链抗体， 所述第一抗原为cd19，所述第二抗原为cd22，所述第一重链可变区为cd19重链可变区，所述第一轻 链可变区为cd19轻链可变区，所述第二重链可变区为cd22重链可变区，所述第二轻链可变区为cd22 轻链可变区。根据本发明实施例的t淋巴细胞，可特异性杀伤cd19和cd22的单/双阳性的肿瘤细胞，
10.根据本发明的实施例，所述第一单链抗体为cd19单链抗体，所述第二单链抗体为bcma单链抗体， 所述第一抗原为cd19，所述第二抗原为bcma，所述第一重链可变区为cd19重链可变区，所述第一 轻链可变区为cd19轻链可变区，所述第二重链可变区为bcma重链可变区，所述第二轻链可变区为 bcma轻链可变区。
11.根据本发明的实施例，所述第一连接肽的n端与所述第二单链抗体的c端相连，所述第一连接肽的 c端与所述第一单链抗体的n端相连，所述第一单链抗体的c端与所述cd8铰链区的n端相连。发明 人发现，所述第二单链抗体、第一连接肽和第一单链抗体在上述连接顺序下，细胞因子，如il-2，ifn-γ， 分泌更低，根据本发明实施例的t淋巴细胞体内治疗更加安全。
12.根据本发明的实施例，所述第一连接肽的n端与所述cd22单链抗体的c端相连，所述第一连接肽 的c端与所述cd19单链抗体的n端相连，所述cd19单链抗体的c端与所述cd8铰链区的n端相连。 根据本发明实施例的上述t淋巴细胞，可特异性杀伤cd19和cd22的单/双阳性的肿瘤细胞，体内细胞 因子分泌更低，相比现有技术，在体内具有更长久、更有力地的血液肿瘤细胞杀伤和清除效果。
13.根据本发明的实施例，所述第一连接肽的n端与所述cd19单链抗体的c端相连，所述第一连接肽 的c端与所述cd22单链抗体的n端相连，所述cd22单链抗体的c端与所述cd8铰链区的n端相连。 根据本发明实施例的上述t淋巴细胞，可特异性杀伤cd19和cd22的单/双阳性的肿瘤细胞，相比现有 技术，在体内具有更长久、更有力地的血液肿瘤细胞杀伤和清除效果。
14.根据本发明的实施例，所述第三连接肽的n端与所述bcma重链可变区的c端相连，所述第三连 接肽的c端与bcma轻链可变区的n端相连，所述bcma轻链可变区的c端与所述第一连接肽的n 端相连，所述第一连接肽的c端与所述cd19轻链可变区的n端相连，所述第二连接肽的n端与所述 cd19轻链可变区的c端相连，所述第二连接肽的c端与所述cd19重链可变区的n端相连，所述cd19 重链可变区的c端与所述cd8铰链区的n端相连。根据本发明实施例的上述t淋巴细胞，可特异性杀 伤bcma和cd19的单/双阳性的肿瘤细胞，相比现有技术，在体内具有更长久、更有力地的肿瘤细胞 杀伤和清除效果。
15.根据本发明的实施例，所述第三连接肽的n端与所述cd22重链可变区的c端相连，所述第三连接 肽的c端与cd22轻链可变区的n端相连，所述cd22轻链可变区的c端与所述第一连接肽的n端相 连，所述第一连接肽的c端与所述cd19轻链可变区的n端相连，所述第二连接肽的n端与所述cd19 轻链可变区的c端相连，所述第二连接肽的c端与所述cd19重链可变区的n端相连，所述cd19重 链可变区的c端与所述cd8铰链区的n端相连。根据本发明实施例的上述t淋巴细胞，可特异性杀伤 cd19和cd22的单/双阳性的肿瘤细胞，体内细胞因子分泌更低，相比现有技术，在体内具有更长久、 更有力地的血液肿瘤细胞杀伤和清除效果。
16.根据本发明的实施例，所述第二连接肽的n端与所述cd19轻链可变区的c端相连，所述第二连接 肽的c端与cd19重链可变区的n端相连，所述cd19重链可变区的c端与所述第一连接肽的n端相 连，所述第一连接肽的c端与所述cd22重链可变区的n端相连，所述第三连接肽的n端与所述cd22 重链可变区的c端相连，所述第三连接肽的c端与所述cd22轻链可变区的n端相连，所述cd22轻 链可变区的c端与所述cd8铰链区的n端相连。根据本发明实施例的上述t淋巴细胞，可特异性杀伤 cd19和cd22的单/双阳性的肿瘤细胞，相比现有技术，在体内具有更长久、更有力地的血液肿瘤细胞 杀伤和清除效果。
17.根据本发明的实施例，所述第二连接肽和第三连接肽分别独立地具有3～5个重复的ggggs的氨基 酸序列。
18.根据本发明的实施例，所述第二连接肽和第三连接肽分别具有5个重复的ggggs的氨基酸序列。 发明人发现，当第二连接肽和第三连接肽分别具有5个重复的ggggs时，根据本发明实施例的t淋巴 细胞的杀伤效果更强，导入机体后，机体细胞因子分泌量更低，安全性更高。
19.根据本发明的实施例，所述胞外区具有seq id no:1～5所示的氨基酸序列。
20.malpvtalllplalllhaarpqvqlqqsgpglvkpsqtlsltcaisgdsvssnsaawnwirqspsr glewlgrtyyrskwyndyavsvksritinpdtsknqfslqlnsvtpedtavyycarevtgdledafdi wgqgtmvtvggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqtiwsylnwyqqrpgk apnlliyaasslqsgvpsrfsgrgsgtdftltisslqaedfatyycqqsysipqtfgqgtkleikggggsd iqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtd ysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqsl svtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqt ddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggav htrgldfacd(seq id no:1)。
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23.malpvtalllplalllhaarpqvqlqqsgpglvkpsqtlsltcaisgdsvssnsaawnwirqspsr g
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24.malpvtalllplalllhaarpqvqlqqsgpglvkpsqtlsltcaisgdsvssnsaawnwirqspsr glewlgrtyyrskwyndyavsvksritinpdtsknqfslqlnsvtpedtavyycarevtgdledafdi wgqgtmvtvggggsggggsggggsggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasq tiwsylnwyqqrpgkapnlliyaasslqsgvpsrfsgrgsgtdftltisslqaedfatyycqqsysipqt fgqgtkleikggggsdiqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrl hsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsg gggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgs ettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsst ttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd(seq id no：5)。
25.其中，seq id no:1所示的氨基酸序列是car-pcdhf32(分子结构如图1所示)表达的嵌合抗原受 体的胞外区的序列，seq id no:2所示的氨基酸序列是car-pcdhf34(分子结构如图2所示)表达的嵌 合抗原受体的胞外区的序列，seq id no:3所示的氨基酸序列是car-pcdhf31(分子结构如图15所示) 表达的嵌合抗原受体的胞外区的序列，seq id no:4所示的氨基酸序列是car-pcdhf58(除第二和第三 连接肽为5个重复ggggs外，其余结构与car-pcdhf32分子结构相同)表达的嵌合抗原受体的胞外 区的序列，seq id no:5所示的氨基酸序列是car-pcdhf59(除第二和第三连接肽为6个重复ggggs 外，其余结构与car-pcdhf32分子结构相同)表达的嵌合抗原受体的胞外区的序列。
26.在本发明的第二方面，本发明提出了一种慢病毒。根据本发明的实施例，所述慢病毒携带编码嵌合 抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体包括：胞外区，所述胞外区包括第一单链抗体、第二单链抗体、 第一连接肽以及cd8铰链区，所述第一单链抗体特异性识别第一抗原，所述第二单链抗体特异性识别 第二抗原，所述第一连接肽设置于所述第一单链抗体和第二单链抗体之间，所述第一单链抗体包括第一 重链可变区和第一轻链可变区以及第二连接肽，所述第二连接肽设置于所述第一重链可变区和第一轻链 可变区之间，所述第二单链抗体包括第二重链可变区和第二轻链可变区以及第三连接肽，所述第三连接 肽设置于第二重链可变区和第二轻链可变区之间，所述第一连接肽具有一个重复的ggggs的氨基酸序 列，所述第二连接肽和第三连接肽分别独立地具有2～6个重复的ggggs的氨基酸序列；跨膜区，所述 跨膜区与所述胞外区相连，所述跨膜区包括cd8的跨膜段，并且嵌入到所述t淋巴细胞的细胞膜中； 以及胞内区，所述胞内区与所述跨膜区相连，并且所述胞内区包括4-1bb的胞内段以及cd3ζ链。将根 据本发明实施例的慢病毒导入受体细胞-t淋巴细胞，可获得前面所述的t淋巴细胞，所获得的t淋巴 细胞可特异性杀伤第一抗原和第二抗原的单/双阳性的肿瘤细胞，且相比现有技术，在体内具有更长久、 更有力地的肿瘤细胞杀伤和清除效果。
27.根据本发明的实施例，上述慢病毒还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
28.根据本发明的实施例，所述第一单链抗体为cd19单链抗体，所述第二单链抗体为cd22单链抗体， 所述第一抗原为cd19，所述第二抗原为cd22，所述第一重链可变区为cd19重链可变区，所述第一轻 链可变区为cd19轻链可变区，所述第二重链可变区为cd22重链可变区，所述第二轻链可变区为cd22 轻链可变区。
29.根据本发明的实施例，所述第一单链抗体为cd19单链抗体，所述第二单链抗体为bcma单链抗体， 所述第一抗原为cd19，所述第二抗原为bcma，所述第一重链可变区为cd19重链可变区，所述第一 轻链可变区为cd19轻链可变区，所述第二重链可变区为bcma重链可变区，所述第二轻链可变区为 bcma轻链可变区。
30.根据本发明的实施例，所述第三连接肽的n端与所述cd22重链可变区的c端相连，所述第三连接 肽的c端与cd22轻链可变区的n端相连，所述cd22轻链可变区的c端与所述第一连接肽的n端相 连，所述第一连接肽的c端与所述cd19轻链可变区的n端相连，所述第二连接肽的n端与所述cd19 轻链可变区的c端相连，所述第二连接肽的c端与所述cd19重链可变区的n端相连，所述cd19重 链可变区的c端与所述cd8铰链区的n端相连。根据本发明实施例的上述慢病毒导入t淋巴细胞，所 获得的t淋巴细胞可特异性杀伤cd19和cd22的单/双阳性的肿瘤细胞，体内细胞因子分泌更低，相比 现有技术，在体内具有更长久、更有力地的血液肿瘤细胞杀伤和清除效果。
31.根据本发明的实施例，所述第二连接肽的n端与所述cd19轻链可变区的c端相连，所述第二连接 肽的c端与cd19重链可变区的n端相连，所述cd19重链可变区的c端与所述第一连接肽的n端相 连，所述第一连接肽的c端与所述cd22重链可变区的n端相连，所述第三连接肽的n端与所述cd22 重链可变区的c端相连，所述第三连接肽的c端与所述cd22轻链可变区的n端相连，所述cd22轻 链可变区的c端与所述cd8铰链区的n端相连。根据本发明实施例的上述慢病毒导入t淋巴细胞，所 获得的t淋巴细胞可特异性杀伤cd19和cd22的单/双阳性的肿瘤细胞，相比现有技术，在体内具有更 长久、更有力地的血液肿瘤细胞杀伤和清除效果。
32.根据本发明的实施例，所述第三连接肽的n端与所述bcma重链可变区的c端相连，所述第三连 接肽的c端与bcma轻链可变区的n端相连，所述bcma轻链可变区的c端与所述第一连接肽的n 端相连，所述第一连接肽的c端与所述cd19轻链可变区的n端相连，所述第二连接肽的n端与所述 cd19轻链可变区的c端相连，所述第二连接肽的c端与所述cd19重链可变区的n端相连，所述cd19 重链可变区的c端与所述cd8铰链区的n端相连。根据本发明实施例的上述慢病毒导入t淋巴细胞， 所获得的t淋巴细胞可特异性杀伤cd19和bcma的单/双阳性的肿瘤细胞，相比现有技术，在体内具 有更长久、更有力地的肿瘤细胞杀伤和清除效果。
33.根据本发明的实施例，编码所述胞外区的核酸分子具有seq id no:6～10任一所示的核苷酸序列。
34.atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccg caggtgcagctgcagcagagcggaccaggactggtgaagccatctcagaccctgagcctgacatg cgccatctctggcgatagcgtgagctccaactctgccgcctggaattggatcagacagtctccaag cagaggactggagtggctgggaaggacctactatagatccaagtggtacaacgattatgccgtgtc cgtgaagtctcggatcaccatcaaccctgaca
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35.atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccg gacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagt tgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgtt aaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtggg tctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgcc aacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggagatcacaggtggcggt ggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctgaggtgaaactgcaggagtcaggacctg gcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgact atggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggta gtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaaga gccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaac attattactacggtggtagctatgctatggactactggggccaaggaacctcagtcaccgtctcctc aggaggcggtgggtcgcaggtgcagctgcagcagagcggaccaggactggtgaagccatctcag accctgagcctgacatgcgccatctctggcgatagcgtgagctccaactctgccgcctggaattgg atcagacagtctccaagcagaggactggagtggctgggaaggacctactatagatccaagtggta caacgattatgccgtgtccgtgaagtctcggatcaccatcaaccctgacacatccaagaatcagttc tctctgcagctgaatagcgtgaccccagaggacacagccgtgtactattgcgcccgggaggtgacc ggcgacctggaggatgcctttgacatctggggccagggcaccatggtgacagtgggaggaggagg ctccggcggaggaggctctggaggaggaggcagcgacatccagatgacccagtccccatctagcc tgtccgcctctgtgggcgacagggtgaccatcacatgtcgcgcctcccagacaatctggtcttacc tgaactggtatcagcagagacccggcaaggcccctaatctgctgatctacgcagcctcctctctgc agagcggagtgccaagcaggttctccggccgcggctccggcaccgacttcaccctgacaatcagc tccctgcaggccgaggacttcgccacatactattgtcagcagagctat
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36.atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccg cagatccagctggtgcagtctggcccagagctgaagaagcccggcgagaccgtgaagatcagctg caaggcctccggctacaccttcacagactatagcatcaactgggtgaagagggcccctggcaagg gcctgaagtggatgggctggatcaataccgagacacgcgagccagcctacgcctatgacttccggg gcagattcgccttttccctggagacctctgccagcacagcctacctgcagatcaacaatctgaagt acgaggataccgccacatatttttgcgccctggactacagctatgccatggattattggggccaggg cacctccgtgacagtgagctccggaggaggaggctccggcggcggaggctctggcggcggcggc agcgacatcgtgctgacccagtccccagcctctctggccatgtccctgggcaagcgggccacaatc tcttgtagagcctccgagtctgtgagcgtgatcggcgcccacctgatccactggtaccagcagaag cctggccagccccctaagctgctgatctatctggccagcaacctggagaccggagtgccagcacg gttctccggctctggcagcggcacagactttaccctgacaatcgatcctgtggaggaggacgatgt ggccatctactcttgtctgcagagcaggatcttcccacgcacctttggcggcggcacaaagctgga gatcaagggaggcggtgggtcggacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctct gggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatca gcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtccc atcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaaga agatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggaccaa gctggagatcacaggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctgaggtga aactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtc tcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggag tggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgacca tcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacaca gccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggccaag gaacctcagtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccacc atcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgca cacgagggggctggacttcgcctgtgat(seq id no:8)。
37.atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccg caggtgcagctgcagcagagcggaccaggactggtgaagccatctcagaccctgagcctgacatg cgccatctctggcgatagcgtgagctccaactctgccgcctggaattggatcagacagtctccaag cagaggactggagtggctgggaaggacctactatagatccaagtggtacaacgattatgccgtgtc cgtgaagtctcggatcaccatcaaccctgacacatccaagaatcagttctctctgcagctgaatag cgtgaccccagaggacacagccgtgtactattgcgcccgggaggtgaccggcgacctggaggatg cctttgacatctggggccagggcaccatggtgacagtgggcggaggaggctctggcggaggaggc tctggaggaggaggcagcggcggaggaggctctggaggaggaggcagcgacatccagatgaccc agtccccatctagcctgtccgcctctgtgggcgacagggtgaccatcacatgtcgcgcctcccaga caatctggtcttacctgaactggtatcagcagagacccggcaaggcccctaatctgctgatctacgc agcctcctctctgcagagcggagtgccaagcaggttctccggccgcggctccggcaccgacttca ccctgacaatcagctccctgcaggccgaggacttcgccacatactattgtcagcagagctattccat ccctcagacctttggccagggcacaaagctggagatcaagggaggcggtgggtcggacatccaga tgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaa gtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatgga
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38.atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccg caggtgcagctgcagcagagcggaccaggactggtgaagccatctcagaccctgagcctgacatg cgccatctctggcgatagcgtgagctccaactctgccgcctggaattggatcagacagtctccaag cagaggactggagtggctgggaaggacctactatagatccaagtggtacaacgattatgccgtgtc cgtgaagtctcggatcaccatcaaccctgacacatccaagaatcagttctctctgcagctgaatag cgtgaccccagaggacacagccgtgtactattgcgcccgggaggtgaccggcgacctggaggatg cctttgacatctggggccagggcaccatggtgacagtgggcggaggaggctctggcggtggtggg tcgggcggaggaggctctggaggaggaggcagcggcggaggaggctctggaggaggaggcagc gacatccagatgacccagtccccatctagcctgtccgcctctgtgggcgacagggtgaccatcaca tgtcgcgcctcccagacaatctggtcttacctgaactggtatcagcagagacccggcaaggcccct aatctgctgatctacgcagcctcctctctgcagagcggagtgccaagcaggttctccggccgcggc tccggcaccgacttcaccctgacaatcagctccctgcaggccgaggacttcgccacatactattgt cagcagagctattccatccctcagacctttggccagggcacaaagctggagatcaagggaggcgg tgggtcggacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcac catcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatgg aactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggc agtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttact tttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggagatcacaggc ggtggtgggtcgggcggtggtgggtcgggcggtggtgggtcgggcggaggaggctctggaggag gaggcagcggtggcggcggatctgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgcc ctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctgg attcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatac tataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaa aaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtgg tagctatgctatggactactggggccaaggaacctcagtcaccgtctcctcaaccacgacgccagc gccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgt gccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgat(seq id no： 10)。
39.其中，具有seq id no:6所示核苷酸序列的核酸分子编码具有seq id no:1所示氨基酸序列的嵌 合抗原受体的胞外区；具有seq id no:7所示核苷酸序列的核酸分子编码具有seq id no:2所示氨基 酸序列的嵌合抗原受体的胞外区；具有seq id no:8所示核苷酸序列的核酸分子编码具有seq id no:3 所示氨基酸序列的嵌合抗原受体的胞外区，具有
seq id no:9所示核苷酸序列的核酸分子编码具有seqid no:4所示氨基酸序列的嵌合抗原受体的胞外区，具有seq id no:10所示核苷酸序列的核酸分子编 码具有seq id no:5所示氨基酸序列的嵌合抗原受体的胞外区。
40.根据本发明的实施例，编码所述跨膜区的核酸分子具有seq id no:11所示的核苷酸序列。
41.atctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccc tttactgc(seq id no:11)。
42.根据本发明的实施例，编码所述胞内区的核酸分子具有seq id no:12所示的核苷酸序列。
43.aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaact actcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgag agtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacg agctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgag atggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagata agatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacga tggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccct gccccctcgc taa(seq id no:12)。
44.根据本发明的实施例，编码所述嵌合抗原受体的核酸分子具有seq id no:13～17所示的核苷酸序 列。
45.ggatcccgccaccatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccac gccgccaggccgcaggtgcagctgcagcagagcggaccaggactggtgaagccatctcagaccc tgagcctgacatgcgccatctctggcgatagcgtgagctccaactctgccgcctggaattggatca gacagtctccaagcagaggactggagtggctgggaaggacctactatagatccaagtggtacaac gattatgccgtgtccgtgaagtctcggatcaccatcaaccctgacacatccaagaatcagttctctc tgcagctgaatagcgtgaccccagaggacacagccgtgtactattgcgcccgggaggtgaccggc gacctggaggatgcctttgacatctggggccagggcaccatggtgacagtgggaggaggaggctc cggcggaggaggctctggaggaggaggcagcgacatccagatgacccagtccccatctagcctgt ccgcctctgtgggcgacagggtgaccatcacatgtcgcgcctcccagacaatctggtcttacctga actggtatcagcagagacccggcaaggcccctaatctgctgatctacgcagcctcctctctgcaga gcggagtgccaagcaggttctccggccgcggctccggcaccgacttcaccctgacaatcagctcc ctgcaggccgaggacttcgccacatactattgtcagcagagctattccatccctcagacctttggcc agggcacaaagctggagatcaagggaggcggtgggtcggacatccagatgacacagactacatcc tccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaa tatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagatt acactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattag caacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttc ggaggggggaccaagctggagatcacaggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcg gcggatctgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtcc gtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccac gaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctca aatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgc aaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatgga ctactggggccaaggaacctcagtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcgccg
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46.ggatcccgccaccatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccac gccgccaggccggacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacaga gtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaacca gatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttca gtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgcca cttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggagatca caggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctgaggtgaaactgcagga gtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctc attacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagt aatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggac aactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactac tgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggccaaggaacctcagtca ccgtctcctcaggaggcggtgggtcgcaggtgcagctgcagcagagcggaccaggactggtgaa gccatctcagaccctgagcctgacatgcgccatctctggcgatagcgtgagctccaactctgccgc ctggaattggatcagacagtctccaagcagaggactggagtggctgggaaggacctactatagatc caagtggtacaacgattatgccgtgtccgtgaagtctcggatcaccatcaaccctgacacatccaa gaatcagttctctctgcagctgaatagcgtgaccccagaggacacagccgtgtactattgcgcccg ggaggtgaccggcgacctggaggatgcctttgacatctggggccagggcaccatggtgacagtgg gaggaggaggctccggcggaggaggctctggaggaggaggcagcgacatccagatgacccagtc cccatctagcctgtccgcctctgtgggcgacagggtgaccatcacatgtcgcgcctcccagacaat ctggtcttacctgaactggtatcagcagagacccggcaaggcccctaatctgctgatctacgcagc ctcctctctgcagagcggagtgccaagcaggttctccggccgcggctccggcaccgacttcaccc tgacaatcagctccctgcaggccgaggacttcgccacatactattgtcagcagagctattccatccc tcagacctttggccagggcacaaagctggagatcaagaccacgacgccagcgccgcgaccacca acaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggc ggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggc cgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaa actcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgt agctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcg cagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaaga gaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaa ggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagt gagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcag tacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa(seq idno:14)。
47.gccaccatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgcc aggccgcagatccagctggtgcagtctggcccagagctgaagaagcccggcgagaccgtgaaga tcagctgcaaggcctccggctacaccttcacagactatagcatcaactgggtgaagagggcccctg gcaagggcctgaagtggatgggctggatcaataccgagacacgcgagccagcctacgcctatgac ttccggggcagattcgccttttccctggagacctctgccagcacagcctacctgcagatcaacaat ctgaagtacgaggataccgccacatatttttgcgccctggactacagctatgccatggattattggg gccagggcacctccgtgacagtgagctccggaggaggaggctccggcggcggaggctctggcgg cggcggcagcgacatcgtgctgacccagtccccagcctctctggccatgtccctgggcaagcggg ccacaatctcttgtagagcctccgagtctgtgagcgtgatcggcgcccacctgatccactggtacc agcagaagcctggccagccccctaagctgctgatctatctggccagcaacctggagaccggagtg ccagcacggttctccggctctggcagcggcacagactttaccctgacaatcgatcctgtggaggag gacgatgtggccatctactcttgtctgcagagcaggatcttcccacgcacctttggcggcggcaca aagctggagatcaagggaggcggtgggtcggacatccagatgacacagactacatcctccctgtc tgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaa ttggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactca ggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctg gagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggg gggaccaagctggagatcacaggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggat ctgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcaca tgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaag ggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatcca gactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactg atgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactgg ggccaaggaacctcagtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggc gcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcg cagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggactt gtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgt atatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccg atttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcc cccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagta cgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaac cctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgg gatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagcca ccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa(seq id no:15)。
48.atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccg caggtgcagctgcagcagagcggaccaggactggtgaagccatctcagaccctgagcctgacatg cgccatctctggcgatagcgtgagctccaactctgccgcctggaattggatcagacagtctccaag cagaggactggagtggctgggaaggacctactatagatccaagtggtacaacgattatgccgtgtc cgtgaagtctcggatcaccatcaaccctgacacatccaagaatcagttctctctgcagctgaatag cgtgaccccagaggacacagccgtgtactattgcgcccgggaggtgaccggcgacctggaggatg cctttgacatctggggccagggcaccatggtgacagtgggcggaggaggctctggcggaggaggc tctggaggaggaggcagcggcggaggaggctctggaggaggaggcagcgacatccagatgaccc agtccccatctagcctgtccgcctctgtgggcgacagggtgaccatcacatgtcgcgcctcccaga caatctggtcttacctgaactggtatcagcagagacccggcaaggcccctaatctgctgatctacgc agcctcctctctg
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49.atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccg caggtgcagctgcagcagagcggaccaggactggtgaagccatctcagaccctgagcctgacatg cgccatctctggcgatagcgtgagctccaactctgccgcctggaattggatcagacagtctccaag cagaggactggagtggctgggaaggacctactatagatccaagtggtacaacgattatgccgtgtc cgtgaagtctcggatcaccatcaaccctgacacatccaagaatcagttctctctgcagctgaatag cgtgaccccagaggacacagccgtgtactattgcgcccgggaggtgaccggcgacctggaggatg cctttgacatctggggccagggcaccatggtgacagtgggcggaggaggctctggcggtggtggg tcgggcggaggaggctctggaggaggaggcagcggcggaggaggctctggaggaggaggcagc gacatccagatgacccagtccccatctagcctgtccgcctctgtgggcgacagggtgaccatcaca tgtcgcgcctcccagacaatctggtcttacctgaactggtatcagcagagacccggcaaggcccct aatctgctgatctacgcagcctcctctctgcagagcggagtgccaagcaggttctccggccgcggc tccggcaccgacttcaccctgacaatcagctccctgcaggccgaggacttcgccacatactattgt cagcagagctattccatccctcagacctttggccagggcacaaagctggagatcaagggaggcgg tgggtcggacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcac catcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatgg aactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggc agtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttact tttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggagatcacaggc ggtggtgggtcgggcggtggtgggtcgggcggtggtgggtcgggcggaggaggctctggaggag gaggcagcggtggcggcggatc
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50.其中，具有seq id no:13所示的核苷酸序列的核酸分子编码car-pcdhf32(分子结构如图1所示) 表达的嵌合抗原受体，具有seq id no:14所示的核苷酸序列的核酸分子编码car-pcdhf34(分子结构 如图2所示)表达的嵌合抗原受体，具有seq id no:15所示的核苷酸序列的核酸分子编码car-pcdhf31 (分子结构如图15所示)表达的嵌合抗原受体，具有seq id no:16所示的核苷酸序列的核酸分子编码 car-pcdhf58表达的嵌合抗原受体，具有seq id no:17所示的核苷酸序列的核酸分子编码 car-pcdhf59表达的嵌合抗原受体。
51.在本发明的第三方面，本发明提出了一种慢病毒。根据本发明的实施例，所述慢病毒携带具有seqid no：18～22所示的核苷酸序列的核酸分子。根据本发明实施例的慢病毒导入受体细胞-t淋巴细胞后， 所获得的t淋巴细胞可特异性杀伤第一抗原和第二抗原的单/双阳性的肿瘤细胞，且相比现有技术，在 体内具有更长久、更有力地的肿瘤细胞杀伤和清除效果。
52.cgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttg gggggaggggtcggcaattgacccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtg atgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcg ccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttccc gcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacctggctgcagta cgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaagg agccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctg gtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctg ctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttc ggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggg gcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctcgccggcctgctctggtg cctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagtt gcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggc gctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgt cgcttcatgtgactccactgagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttg gagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactga
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53.cgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttg gggggaggggtcggcaattgacccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtg atgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcg ccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttccc gcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacctggctgcagta cgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaagg agccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctg gtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttg
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54.cgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttg gggggaggggtcggcaattgacccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtg atgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcg ccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttccc gcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacctggctgcagta cgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaagg agccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctg gtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctg ctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttc ggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggg gcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctcgccggcctgctctggtg cctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagtt gcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggc gctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgt cgcttcatgtgactccactgagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttg gagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggt ggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagttt ggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgt gagggatcccgccaccatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctcca cgccgccaggccgcagatccagctggtgcagtctggcccagagctgaagaagcccggcgagacc gtgaagatcagctgcaaggcctccggctacaccttcacagactatagcatcaactgggtgaagagg gcccctggcaagggcctgaagtggatgggctggatcaataccgagacacgcgagccagcctacgc ctatgacttccggggcagattcgccttttccctggagacctctgccagcacagcctacctgcagatc aacaatctgaagtacgaggataccgccacatatttttgcgccctggactacagctatgccatggatt attggggccagggcacctccgtgacagtgagctccggaggaggaggctccggcggcggaggctc tggcggcggcggcagcgacatcgtgctgacccagtccccagcctctctggccatgtccctgggca agcgggccacaatctcttgtagagcctccgagtctgtgagcgtgatcggcgcccacctgatccact ggtaccagcagaagcctggccagccccctaagctgctgatctatctggccagcaacctggagaccg gagtgccagcacggttctccggctctggcagcggcacagactttaccctgacaatcgatcctgtgg aggaggacgatgtggccatctactcttgtctgcagagcaggatcttcccacgcacctttggcggcg gcacaaagctggagatcaagggaggcggtgggtcggacatccagatgacacagactacatcctcc ctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatat ttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattac actcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagca acctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcg gaggggggaccaagctggagatcacaggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcgg cggatctgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccg tcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacg aaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaa atccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgca aactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggact actggggccaaggaacctcagtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaaca ccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggg gggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgg gacttgtggggtccttctcctg
tcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaact cctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagc tgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcag acgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagag gagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaagga agaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgag attgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtac agccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaatgaggccggcc (seq id no：20)。
55.gccaccatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgcc aggccgcaggtgcagctgcagcagagcggaccaggactggtgaagccatctcagaccctgagcc tgacatgcgccatctctggcgatagcgtgagctccaactctgccgcctggaattggatcagacagt ctccaagcagaggactggagtggctgggaaggacctactatagatccaagtggtacaacgattatg ccgtgtccgtgaagtctcggatcaccatcaaccctgacacatccaagaatcagttctctctgcagc tgaatagcgtgaccccagaggacacagccgtgtactattgcgcccgggaggtgaccggcgacctg gaggatgcctttgacatctggggccagggcaccatggtgacagtgggcggaggaggctctggcgg aggaggctctggaggaggaggcagcggcggaggaggctctggaggaggaggcagcgacatcca gatgacccagtccccatctagcctgtccgcctctgtgggcgacagggtgaccatcacatgtcgcgc ctcccagacaatctggtcttacctgaactggtatcagcagagacccggcaaggcccctaatctgct gatctacgcagcctcctctctgcagagcggagtgccaagcaggttctccggccgcggctccggca ccgacttcaccctgacaatcagctccctgcaggccgaggacttcgccacatactattgtcagcaga gctattccatccctcagacctttggccagggcacaaagctggagatcaagggaggcggtgggtcg gacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagt tgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgtt aaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtggg tctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgcc aacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggagatcacaggcggtggt gggtcgggcggtggtgggtcgggcggaggaggctctggaggaggaggcagcggtggcggcggat ctgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcaca tgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaag ggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatcca gactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactg atgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactgg ggccaaggaacctcagtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggc gcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcg cagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggactt gtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgt atatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccg atttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcc cccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagta cgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaac cctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgg gatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagcca ccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa(seq id no：21)。
56.gccaccatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgcc aggc
cgcaggtgcagctgcagcagagcggaccaggactggtgaagccatctcagaccctgagcc tgacatgcgccatctctggcgatagcgtgagctccaactctgccgcctggaattggatcagacagt ctccaagcagaggactggagtggctgggaaggacctactatagatccaagtggtacaacgattatg ccgtgtccgtgaagtctcggatcaccatcaaccctgacacatccaagaatcagttctctctgcagc tgaatagcgtgaccccagaggacacagccgtgtactattgcgcccgggaggtgaccggcgacctg gaggatgcctttgacatctggggccagggcaccatggtgacagtgggcggaggaggctctggcgg tggtgggtcgggcggaggaggctctggaggaggaggcagcggcggaggaggctctggaggagg aggcagcgacatccagatgacccagtccccatctagcctgtccgcctctgtgggcgacagggtgac catcacatgtcgcgcctcccagacaatctggtcttacctgaactggtatcagcagagacccggcaa ggcccctaatctgctgatctacgcagcctcctctctgcagagcggagtgccaagcaggttctccgg ccgcggctccggcaccgacttcaccctgacaatcagctccctgcaggccgaggacttcgccacata ctattgtcagcagagctattccatccctcagacctttggccagggcacaaagctggagatcaaggg aggcggtgggtcggacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacag agtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaacc agatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttc agtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgcc acttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggagatc acaggcggtggtgggtcgggcggtggtgggtcgggcggtggtgggtcgggcggaggaggctctg gaggaggaggcagcggtggcggcggatctgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggt ggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgta agctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaac cacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagtt ttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattact acggtggtagctatgctatggactactggggccaaggaacctcagtcaccgtctcctcaaccacga cgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgccca gaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatat ctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttac tgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaact actcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgag agtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacg agctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgag atggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagata agatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacga tggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccct gccccctcgctaa(seq id no：22)。
57.其中，具有seq id no:18所示的核苷酸序列的核酸分子表达car-pcdhf32(分子结构如图1所示) 嵌合抗原受体，具有seq id no:19所示的核苷酸序列的核酸分子表达car-pcdhf34(分子结构如图2 所示)嵌合抗原受体，具有seq id no:20所示的核苷酸序列的核酸分子表达car-pcdhf31(分子结构 如图15所示)嵌合抗原受体，具有seq id no:21所示的核苷酸序列的核酸分子表达car-pcdhf58嵌 合抗原受体，具有seq id no:22所示的核苷酸序列的核酸分子表达car-pcdhf59嵌合抗原受体。
58.在本发明的第四方面，本发明提出了一种转基因淋巴细胞。根据本发明的实施例，所述淋巴细胞表 达嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括：胞外区，所述胞外区包括第一
单链抗体、第二单链抗体以及 第一连接肽，所述第一单链抗体特异性识别第一抗原，所述第二单链抗体特异性识别第二抗原，所述第 一连接肽设置于所述第一单链抗体和第二单链抗体之间，所述第一单链抗体包括第一重链可变区和第一 轻链可变区以及第二连接肽，所述第二连接肽设置于所述第一重链可变区和第一轻链可变区之间，所述 第二单链抗体包括第二重链可变区和第二轻链可变区以及第三连接肽，所述第三连接肽设置于第二重链 可变区和第二轻链可变区之间，所述第一连接肽具有一个重复的ggggs的氨基酸序列，所述第二连接 肽和第三连接肽分别独立地具有2～6个重复的ggggs的氨基酸序列；跨膜区，所述跨膜区与所述胞外 区相连，并且嵌入到所述淋巴细胞的细胞膜中；以及胞内区，所述胞内区与所述跨膜区相连，并且所述 胞内区包括免疫共刺激分子胞内段。根据本发明实施例的转基因淋巴细胞，可特异性杀伤第一抗原和第 二抗原的单/双阳性的肿瘤细胞，且相比现有技术，在体内具有更长久、更有力地的肿瘤细胞杀伤和清除 效果。
59.根据本发明的实施例，上述转基因淋巴细胞还可以进一步包括如下附加技术特征：
60.根据本发明的实施例，所述第一单链抗体为cd19单链抗体，所述第二单链抗体为cd22单链抗体， 所述第一抗原为cd19，所述第二抗原为cd22，所述第一重链可变区为cd19重链可变区，所述第一轻 链可变区为cd19轻链可变区，所述第二重链可变区为cd22重链可变区，所述第二轻链可变区为cd22 轻链可变区。
61.根据本发明的实施例，所述第一单链抗体为cd19单链抗体，所述第二单链抗体为bcma单链抗体， 所述第一抗原为cd19，所述第二抗原为bcma，所述第一重链可变区为cd19重链可变区，所述第一 轻链可变区为cd19轻链可变区，所述第二重链可变区为bcma重链可变区，所述第二轻链可变区为 bcma轻链可变区。
62.根据本发明的实施例，所述免疫共刺激分子胞内段独立地选自4-1bb、ox-40、cd40l、cd27、cd30、 cd28以及他们的衍生物的至少一种。
63.根据本发明的实施例，所述免疫共刺激分子胞内段是4-1bb、cd3的胞内段。
64.根据本发明的实施例，所述淋巴细胞是cd3
+
t淋巴细胞。
65.根据本发明的实施例，所述淋巴细胞是cd8
+
t淋巴细胞。
66.根据本发明的实施例，所述淋巴细胞是自然杀伤细胞。
67.根据本发明的实施例，所述淋巴细胞是自然杀伤t细胞。
68.根据本发明的实施例，所述第一连接肽的n端与所述二单链抗体的c端相连，所述第一连接肽的c 端与所述第一单链抗体的n端相连，所述第一单链抗体的c端与所述cd8跨膜区的n端相连。发明人 发现，所述第二单链抗体、第一连接肽和第一单链抗体在上述连接顺序下，细胞因子，如il-2，ifn-γ， 分泌更低，根据本发明实施例的转基因淋巴细胞体内治疗更加安全。
69.根据本发明的实施例，所述第一连接肽的n端与所述cd22单链抗体的c端相连，所述第一连接肽 的c端与所述cd19单链抗体的n端相连，所述cd19单链抗体的c端与所述跨膜区的n端相连。根 据本发明实施例的上述转基因淋巴细胞，可特异性杀伤cd19和cd22的单/双阳性的肿瘤细胞，体内细 胞因子分泌更低，相比现有技术，在体内具有更长久、更有力地的血液肿瘤细胞杀伤和清除效果。
70.根据本发明的实施例，所述第一连接肽的n端与所述cd19单链抗体的c端相连，所
述第一连接肽 的c端与所述cd22单链抗体的n端相连，所述cd22单链抗体的c端与所述跨膜区的n端相连。根 据本发明实施例的上述转基因淋巴细胞，可特异性杀伤cd19和cd22的单/双阳性的肿瘤细胞，相比现 有技术，在体内具有更长久、更有力地的血液肿瘤细胞杀伤和清除效果。
71.根据本发明的实施例，所述第三连接肽的n端与所述cd22重链可变区的c端相连，所述第三连接 肽的c端与cd22轻链可变区的n端相连，所述cd22轻链可变区的c端与所述第一连接肽的n端相 连，所述第一连接肽的c端与所述cd19轻链可变区的n端相连，所述第二连接肽的n端与所述cd19 轻链可变区的c端相连，所述第二连接肽的c端与所述cd19重链可变区的n端相连，所述cd19重 链可变区的c端与所述跨膜区的n端相连。根据本发明实施例的上述转基因淋巴细胞，可特异性杀伤 cd19和cd22的单/双阳性的肿瘤细胞，体内细胞因子分泌更低，相比现有技术，在体内具有更长久、 更有力地的血液肿瘤细胞杀伤和清除效果。
72.根据本发明的实施例，所述第二连接肽的n端与所述cd19轻链可变区的c端相连，所述第二连接 肽的c端与cd19重链可变区的n端相连，所述cd19重链可变区的c端与所述第一连接肽的n端相 连，所述第一连接肽的c端与所述cd22重链可变区的n端相连，所述第三连接肽的n端与所述cd22 重链可变区的c端相连，所述第三连接肽的c端与所述cd22轻链可变区的n端相连，所述cd22轻 链可变区的c端与所述跨膜区的n端相连。根据本发明实施例的上述t淋巴细胞，可特异性杀伤cd19 和cd22的单/双阳性的肿瘤细胞，相比现有技术，在体内具有更长久、更有力地的血液肿瘤细胞杀伤和 清除效果。
73.根据本发明的实施例，所述第三连接肽的n端与所述bcma重链可变区的c端相连，所述第三连 接肽的c端与bcma轻链可变区的n端相连，所述bcma轻链可变区的c端与所述第一连接肽的n 端相连，所述第一连接肽的c端与所述cd19轻链可变区的n端相连，所述第二连接肽的n端与所述 cd19轻链可变区的c端相连，所述第二连接肽的c端与所述cd19重链可变区的n端相连，所述cd19 重链可变区的c端与所述cd8铰链区的n端相连。根据本发明实施例的上述转基因淋巴细胞，可特异 性杀伤bcma和cd19的单/双阳性的肿瘤细胞，相比现有技术，在体内具有更长久、更有力地的肿瘤 细胞杀伤和清除效果。
74.根据本发明的实施例，所述第二连接肽和第三连接肽分别独立地具有3～5个重复的ggggs的氨基 酸序列。
75.根据本发明的实施例，所述第二连接肽和第三连接肽具有5个重复的ggggs的氨基酸序列。根据 本发明的实施例，所述第二连接肽和第三连接肽分别具有5个重复的ggggs的氨基酸序列。发明人发 现，当第二连接肽和第三连接肽分别具有5个重复的ggggs时，根据本发明实施例的转基因淋巴细胞 的杀伤效果更强，导入机体后，机体细胞因子分泌量更低，安全性更高。根据本发明的实施例，所述胞 外区具有seq id no:1～3所示的氨基酸序列。
76.在本发明的第五方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，所述构建体包括核酸分子， 所述核酸分子编码嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体是如前面所限定的。将根据本发明实施例的构建体 导入受体细胞-t淋巴细胞，可获得前面所述的转基因淋巴细胞，所获得的转基因淋巴细胞可特异性杀伤 第一抗原和第二抗原的单/双阳性的肿瘤细胞，且相比现有技术，在体内具有更长久、更有力地的肿瘤细 胞杀伤和清除效果。
77.根据本发明的实施例，上述构建体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
78.根据本发明的实施例，所述构建体进一步包括：启动子，所述启动子与所述核酸分子可操作地连接。
79.根据本发明的实施例，所述启动子为u6、h1、cmv、ef-1、ltr或rsv启动子。
80.根据本发明的实施例，所述构建体的载体是非致病性病毒载体；
81.根据本发明的实施例，所述病毒载体包括选自反转录病毒载体、慢病毒载体和腺病毒相关病毒载体 的至少之一。
82.在本发明的第六方面，本发明提出了一种制备前面所述的t淋巴细胞或者前面所述的转基因淋巴细 胞的方法。根据本发明实施例的方法，所述方法包括：将前面所述的构建体或者前面所述的慢病毒引入 到淋巴细胞中或者t淋巴细胞。根据本发明实施例的方法所制备的t淋巴细胞或转基因淋巴细胞，可特 异性杀伤第一抗原和第二抗原的单/双阳性的肿瘤细胞，且相比现有技术，在体内具有更长久、更有力地 的肿瘤细胞杀伤和清除效果。
83.在本发明的第七方面，本发明提出了一种用于治疗癌症的治疗组合物。根据本发明的实施例，所述 治疗组合物包括：前面所述的构建体、前面所述的慢病毒、前面所述的t淋巴细胞或者前面所述的转基 因淋巴细胞。根据本发明实施例的药物组合物，在体内具有更长久、更有力地的肿瘤细胞杀伤和清除效 果。
84.根据本发明的实施例，所述癌症包括选自b淋巴细胞白血病及b细胞淋巴瘤的至少之一。根据本发 明实施例的药物组合物可以应用于对b淋巴细胞白血病及b细胞淋巴瘤患者的免疫治疗；针对b淋巴 细胞白血病及b细胞淋巴瘤患者，根据本发明实施例的免疫细胞治疗疗效优于目前的治疗手段；另外， 本发明中的双cart细胞的极大促进了b淋巴细胞白血病及b细胞淋巴瘤患者复发的可能性，对于b 淋巴细胞白血病及b细胞淋巴瘤的治疗起到非常极大地推动作用。
85.在本发明的第八方面，本发明提出了前面所述的t淋巴细胞、前面所述的慢病毒、前面所述的转基 因淋巴细胞、前面所述的构建体或前面所述的治疗组合物在制备治疗癌症的药物中的用途。
86.根据本发明的实施例，所述癌症包括选自b淋巴细胞白血病及b细胞淋巴瘤的至少之一。根据本 发明实施例的t淋巴细胞、慢病毒、转基因淋巴细胞、构建体或治疗组合物作为治疗癌症的药物的组分， 能够用于对b淋巴细胞白血病及b细胞淋巴瘤患者的免疫治疗中。
87.在本发明的第九方面，本发明提出了一种提高淋巴细胞活性的方法。根据本发明的实施例，所述方 法包括：使所述淋巴细胞表达嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体是如前面所限定的，所述淋巴细胞活性 包括所述淋巴细胞在肿瘤病人体内的生存能力以及所述淋巴细胞在肿瘤病人体内的杀伤能力的至少一 种。
88.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本 发明的实践了解到。
附图说明
89.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得
明显和容易理解，其 中：
90.图1是根据本发明实施例的car-pcdhf32分子结构图；
91.图2是根据本发明实施例的car-pcdhf34分子结构图；
92.图3是根据本发明实施例的car-pcdhf32和car-pcdhf34质粒图谱；
93.图4是根据本发明实施例的pcdhf-32细胞工作原理图；
94.图5是根据本发明实施例的流式检测car-pcdhf-32、34阳性率的结果图；
95.图6是根据本发明实施例的nalm6和raji细胞表面cd19及cd22抗原表达峰度检测图；
96.图7是根据本发明实施例的car-pcdhf32和car-pcdhf34体外杀伤功能图，其中，
97.a为car-pcdhf32和car-pcdhf34对k562/k562-cd19/k562-cd22/nalm6/raji细胞杀伤效果；
98.b为效靶比5:1时，car-pcdhf32和car-pcdhf34对k562/k562-cd19/k562-cd22/raji细胞杀伤 效果对比；
99.c为效靶比5:1时，car-pcdhf32和car-pcdhf34对k562/k562-cd19/k562-cd22/raji细胞杀伤 实验中细胞因子分泌情况对比；
100.图8是根据本发明实施例的car-pcdhf32和car-pcdhf34对k562/k562-cd19/k562-cd22/raji细 胞杀伤实验中，细胞因子分泌情况图；
101.图9是根据本发明实施例的car-pcdhf32与单靶点cart、loop 6car体外杀瘤效果比较图；
102.图10是根据本发明实施例的pcdhf-60分子结构图；
103.图11是根据本发明实施例的经过慢病毒包装并侵染t细胞后获得cart-pcdhf32及cart-pcdhf60， 使用荧光抗原染色检测其阳性率的结果图；
104.图12是根据本发明实施例的car-pcdhf32和car-pcdhf60体外杀伤功能的结果图，其中，
105.a为car-pcdhf32和car-pcdhf60对k562/nalm6细胞杀伤效果；
106.b为car-pcdhf32和car-pcdhf60对k562/nalm6细胞杀伤实验中，细胞因子分泌情况；
107.图13是根据本发明实施例的进行cart-pcdhf32及cart-pcdhf60的体内功能对比实验方案图；
108.图14是根据本发明实施例的car-pcdhf32和car-pcdhf60体内功能对比实验结果，其中，a为 car-pcdhf32和car-pcdhf60体内实验小鼠体重变化监测数据；
109.b为car-pcdhf32和car-pcdhf60体内实验小鼠生存曲线；
110.图15是根据本发明实施例的car-pcdhf31分子结构；
111.图16是根据本发明实施例的car-pcdhf31和car-pcdhf60对k562/k562-cd19/k562-bcma/daudi 细胞杀伤效果图；
112.图17是根据本发明实施例的car-pcdhf31对k562/k562-cd19/k562-bcma/daudi细胞杀伤实验 中，细胞因子分泌情况；
113.图18是根据本发明实施例的双特异性cart结构中第二和第三连接肽为3～6个重复的ggggs的 体外杀伤效果；以及
114.图19是根据本发明实施例的双特异性cart结构中第二和第三连接肽为3～6个重复的ggggs的 细胞因子检测；
115.在附图中，t cell/t-cell是指t细胞；medium是指培养基；linker是指连接肽；linker annotation是 指连接肽注解。
具体实施方式
116.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号 表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨 在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
117.此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所 指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。 在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
118.术语“任选地”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。由此，限定有“任选地
”ꢀ
的特征可以明示或者隐含地包括或不包括该特征。
119.单链抗体(scfv)是一种基因工程抗体，其中vh和vl域与柔性多肽连接体相连。与整体抗体的 fab区相比，单链抗体表现出更好的组织渗透药动学，并且由于抗原结合表面未被改变而具有完全的抗 原结合特异性。
120.免疫共刺激分子是指为t淋巴细胞或b淋巴细胞完全活化提供共刺激信号的细胞表面分子及其配 体，如4-1bb、ox-40、cd40l、cd27、cd30、cd28、cd3以及他们的衍生物。
121.根据本发明的具体实施例，以构建一个慢病毒载体为例，发明人为了构建一个慢病毒载体，在某些 病毒序列的位置，将目的核酸插入到病毒基因组中，从而产生复制缺陷的病毒。为了产生病毒体，发明 人进而构建包装细胞系(包含gag，pol和env基因，但不包括ltr和包装成分)。发明人将含有目的基 因的重组质粒，连同慢病毒ltr和包装序列，一起引入包装细胞系中。包装序列允许重组质粒rna转 录产物被包装到病毒颗粒中，然后被分泌到培养基中。进而发明人收集包含重组慢病毒的基质，有选择 性地浓缩，并用于基因转移。慢载体可以感染多种细胞类型，包括可分裂细胞和不可分裂细胞。
122.另外，根据本发明的实施例，本发明实施例的慢病毒是复合慢病毒，除了常见的慢病毒基因gag， pol和env，还包含有调控和结构功能的其他基因。慢病毒载体是本领域技术人员所熟知的，慢病毒包括： 人类免疫缺陷病毒hiv
–
1，hiv
–
2和猿猴免疫缺陷病毒siv。慢病毒载体通过多重衰减艾滋病毒致病 基因产生，例如全部删除基因env，vif，vpr，vpu和nef，使慢病毒载体形成生物安全型载体。重组慢 病毒载体能够感染非分裂细胞，同时可用于体内和体外基因转移和核酸序列表达。例如：在合适的宿主 细胞中，和带有包装功能(gag，pol，env，rev和tat)的两个或更多的载体一起，能够感染非分裂细胞。 重组病毒的靶向性，是通过抗体或特定配体(靶向特定细胞类型受体)与膜蛋白的结合来实现的。同时， 重组病毒的靶向性通过插入一个有效序列(包括调控区域)到病毒载体中，连同另一个编码了特定靶细胞 上的受体的配体的基因，使载体具有了特定的靶向。各种有用的慢病毒载体，以及各种方法和操作等产 生的载体，用于改变细胞的表达。
123.根据本发明的实施例，本发明实施例的腺关联病毒载体(aav)可使用一种或多种
为人熟知的血清 类型腺关联病毒载体的dna构建。另外，根据本发明的实施例，本发明实施例的也包含微基因。微基 因意味着用组合(选定的核苷酸序列和可操作的必要的相关连接序列)来指导转化、转录和/或基因产物 在体内或体外的宿主细胞中的表达。应用“可操作的连接”序列包含连续目的基因的表达控制序列，和 作用于反式或远距离控制目的基因的表达控制序列。
124.另外，本发明实施例的载体还包括常规控制元素，在和质粒载体一起的细胞转染或/和病毒载体一起 的细胞感染中。大量的表达控制序列(包括天然的，可诱导和/或特定组织的启动子)可能被使用。根据 本发明的实施例，启动子为选自u6、h1、pol i、pol ii和pol iii的rna聚合酶启动子。根据本发明的 实施例，启动子为组织特异型启动子。根据本发明的实施例，启动子为诱导型启动子。根据本发明的实 施例，启动子为选自基于所选载体的启动子。根据本发明的实施例，当选择慢病毒载体时，启动子为 u6、h1、cmv ie基因、ef-1α、泛素c或磷酸甘油激酶(pgk)启动子。其他常规表达控制序列包括可 选标记或报告基因，包括编码遗传霉素、潮霉素、氨苄青霉素或嘌呤霉素耐药性等的核苷酸序列。载体 的其他组件包括复制起点。
125.构建载体的技术为本领域技术人员所熟知的，这些技术包括常规克隆技术，
126.根据本发明的实施例，提供给患者的本发明实施例的组合物，较好的应用于生物兼容溶液或可接受 的药学运载载体。作为准备的各种治疗组合物被悬浮或溶解在医药上或生理上可接受的载体，如生理盐 水；等渗的盐溶液或其他精于此道的人的比较明显的配方中。适当的载体在很大程度上取决于给药途径。 其他有水和无水的等渗无菌注射液和有水和无水的无菌悬浮液，是医药上可接受的载体。
127.表达特有的针对抗原cd19和cd22嵌合抗原受体的这些方法是联合治疗的一部分。这些病毒载体 和用于过继免疫治疗的抗肿瘤t细胞，可以被单独或结合其他治疗癌症的方法一起执行。在合适的条件 下，一个治疗方法的包括使用一个或多个药物疗法。
128.下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。
129.本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施 例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考j.萨姆布鲁克等著， 黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪 器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
130.本发明通过优化串联cd19和cd22单链抗体序列的轻重链顺序及其相互连接的连接肽的长短，获 得了一种新型的针对cd19和cd22靶点的双car结构。根据本发明的实施例，本技术可制备出高阳性 率cart细胞，且对于cd19和cd22靶点细胞具有高特异性和很好的杀伤效果。并且该结构可用于其 他靶点构建双靶点cart，具有良好的通用性。
131.实施例1靶向cd19和cd22的单链抗体(scfv)序列选择
132.b淋巴细胞抗原cd19也称为cd19，是一种单程i型膜蛋白，包含两个ig样c2型(免疫球蛋白样) 结构域。靶向cd19的scfv序列选择抗体fmc63-migg2a，fmc63-migg2a是上个世纪通过动物免疫获 得抗cd19的鼠源抗体，其结合表位为cd19远膜端ig结构域。fmc63-migg2a scfv已经成功被应用于 抗cd19 car构造，比如norvatis ctl019以及juno therapeutics jcar015。ctl019以及jcar015在 b细胞急性淋巴细胞白血病的临床试验取
得了较好的结果，完全缓解(complete remission)病人比 例》70％。其轻重链可变区序列如下所示：
133.轻链可变区氨基酸序列：
134.diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgs gtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleit
135.重链可变区氨基酸序列：
136.evklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalks rltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvss
137.cd22为ⅰ型跨膜糖蛋白是唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素家族成员。作为b细胞受体(bcr)的 抑制性共受体，cd22对b细胞激活信号具有负性调节作用，胞外部分包括7个免疫球蛋白结构域。靶 向cd22的scfv序列选择抗体m971，其结合表位为cd22近膜端ig结构域5-7。m971-migg是通过抗 体库筛选获得的人源化抗体，在靶向cd22的cart中获得广泛应用。如juno therapeutics jcar018在 2017ash报道的临床数据显示r/r all完全缓解(complete remission)病人比例为78％。其轻重链可变区 序列如下所示：
138.轻链可变区氨基酸序列：
139.diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqtiwsylnwyqqrpgkapnlliyaasslqsgvpsrfsgrg sgtdftltisslqaedfatyycqqsysipqtfgqgtkleik
140.重链可变区氨基酸序列：
141.qvqlqqsgpglvkpsqtlsltcaisgdsvssnsaawnwirqspsrglewlgrtyyrskwyndyav svksritinpdtsknqfslqlnsvtpedtavyycarevtgdledafdiwgqgtmvtv
142.实施例2构建靶向cd19和cd22的双特异性car质粒(pcdhf-32、34)
143.car-pcdhf32分子结构如图1所示。
144.car-pcdhf34分子结构如图2所示。
145.car-pcdhf32和car-pcdhf34质粒图谱如图3所示。
146.其中，car-pcdhf32细胞工作原理图图4所示。
147.实施例3cd19和cd22的双特异性cart(pcdhf-32、34)阳性率检测
148.利用293t细胞包装慢病毒，获得的慢病毒按moi＝10:1感染t细胞制备cart细胞(二抗apc goatanti mouse igg(h+l)检测anti-cd19 scfv阳性率，自产荧光标记抗原cd22-his-fitc检测anti-cd22 scfv 阳性率)，流式检测慢病毒滴度和慢病毒感染t细胞制备cart细胞方法可以通过公开途径获取)。流式 检测结果如图5所示。左上象限中显示细胞比例为anti-cd19 scfv和anti-cd22 scfv的阳性率，即为 pcdhf-32/pcdhf-34的阳性率。图中流式结果显示pcdhf-32和pcdhf-34阳性率均超过70％，该结 果表明此结构的双特异性cart可制备出高阳性率的细胞制品。
149.实施例4cd19和cd22的双特异性cart(pcdhf-32、34)体外杀瘤功能验证
150.nalm6细胞为急性淋巴细胞白血病细胞，raji细胞为黑色人种burkitt淋巴瘤细胞，使用流式方式检 测其细胞膜表面cd19及cd22抗原表达峰度，具体方法如下：取5e+05癌细胞与流式抗体4℃孵育20min (fitc anti-human cd22(bd pharmingen/555424)检测细胞表面cd22抗原表达峰度，apc anti-humancd19(biolegend/302212)检测细胞表面cd19抗原表达峰度)后，pbs清洗一次，重悬细胞上流式细 胞仪检测，结果图6所示，nalm6细胞为
cd19
+
/cd22
+
细胞系。
151.取靶细胞为k562，k562-cd19，k562-cd22，nalm6(or raji)4种靶细胞各1e+07细胞，先利用 cytocalceintm violet 550对靶细胞进行染色，1*10e+05细胞/100μl/孔；效应细胞(cart v9/cartm971/car-pcdhf32/car-pcdhf34，t细胞为对照)与靶细胞按照0.25:1，1：1，5：1及10：1加入96 孔板中混匀，终体积200μl，共培养6h后并将细胞混匀离心，上清利用human il-2与human ifn gammaelisa elisa试剂盒检测il-2及ifn-γ，沉淀部分用100μl结合缓冲液(binding buffer)重悬，300g离 心5min，添加2.0μl apc-annexin v和1.5μl pi染料，避光孵育15min，添加100μl binding buffer重悬， beckmanc cou lter流式细胞仪检测各靶细胞凋亡比例如图7所示，elisa检测各孔上清il-2及ifn-γ 浓度如图8所示。其中k562为cd19和cd22阴性细胞，k562-cd19和k562-cd22分别为cd19和 cd22单阳性细胞，raji和nalm6均为cd19和cd22双阳性细胞，结果显示car-pcdhf32和car-pcdhf34 对k562-cd19、k562-cd22、raji和nalm6均有较好的杀伤效果，并且在car-pcdhf34拥有较高自分 泌细胞因子的条件下car-pcdhf32的杀伤效果仍略优于car-pcdhf34(见图7和图8)。car-pcdhf32 与单靶点cart体外杀瘤效果对比中可以看出，car-pcdhf32杀伤效果与cd19单靶点cart杀伤效果接 近，该结果与文献《preclinical development of bivalent chimeric antigen receptors targeting both cd19and cd22》报道中最优结构loop 6car(本发明中其作为后续对照双car，命名为pcdhf60)的体外杀 瘤结果一致(见图9)。
152.实施例5本发明cd19和cd22的双特异性cart(pcdhf-32)与其他双特异性cart(pcdhf-60) 体内外杀瘤功能对比
153.根据文献《preclinical development of bivalent chimeric antigen receptors targeting both cd19 andcd22》中报道的最优双cart结构构建双cart质粒(pcdhf-60)，其结构如图10。
154.pcdhf60，使用荧光抗原染色检测其阳性率如图11。
155.使用nalm6为靶细胞，以实施例4中方法比较pcdhf-32与pcdhf-60体外杀伤能力，结果图12 所示。
156.使用ndg小鼠，以nalm6细胞为靶细胞尾静脉注射方式，构建小鼠肿瘤模型。并根据图13中实验 方案进行cart-pcdhf32及cart-pcdhf60的体内功能对比实验。实验过程中隔日记录小鼠体重，并绘 制小鼠生存曲线(图14)以及定期采取小鼠尾血，使用流式方法监测尾血中肿瘤和cart细胞比例(如 表1)。
157.表1：
[0158][0159]
综合以上实验数据可以看出，虽然体外杀伤实验结果显示car-pcdhf32相较car-pcdhf60的杀瘤 效率略低，但体内功能实验显示出car-pcdhf32相较car-pcdhf60更持久的cart续航能力以及更好 的体内血液肿瘤细胞清除效果。
[0160]
实施例6本发明双特异性cart结构与其他靶点配合的适用性(pcdhf-31)
[0161]
为验证本发明中连接肽(linker)结构是否可以用于其他靶点，因此以本发明中的linker结构构建 cd19和bcma双靶点cart，其中anti-bcmascfv序列部分使用c11d5.3抗体的轻重链部分，其轻重 链可变区序列如下所示：
[0162]
轻链可变区氨基酸序列：
[0163]
divltqspaslamslgkratiscrasesvsvigahlihwyqqkpgqppklliylasnletgvparfs gsgsgtdftltidpveeddvaiysclqsrifprtfgggtkleik
[0164]
重链可变区氨基酸序列：
[0165]
qiqlvqsgpelkkpgetvkisckasgytftdysinwvkrapgkglkwmgwintetrepayaydfr grfafsletsastaylqinnlkyedtatyfcaldysyamdywgqgtsvtvss
[0166]
car-pcdhf31分子结构如图15所示。
[0167]
daudi细胞为人burkitt's淋巴瘤细胞(cd19
+
/bcma
+
)，以k562/k562-cd19/k562-bcma/daudi细胞 作为靶细胞，以实施例4中方法验证cart-pcdhf31体外杀伤活性结果见图16和图17。
[0168]
综合以上实验数据可以看出，替换靶点后，使用本发明中linker结构的双cart仍保有良好的功能活 性。因此可以证明本发明中linker结构的双car具有靶点可替换的普适性和通用性。
[0169]
实施例7本发明双特异性cart结构中长linker的长度对体外杀伤效果的影响
[0170]
为验证本发明中cd19vh与cd19vl之间连接肽(linker)、cd22vh与cd22vl之间连接肽(linker) 结构长度是否对其杀伤活性具有影响，本发明中将cd19vh与vl之间的linker长度、cd22vh与vl 之间的linker长度分别构建了2～6个重复的ggggs的氨基酸序列并进行了体外功能验证。
[0171]
以k562/raji细胞作为靶细胞，以实施例4中方法验证2～6个重复的ggggs的氨基酸序列的双 cart体外杀伤活性。图18和图19为部分实验结果。其中cart-pcdhf32为第二和第三连接肽为3个 重复的ggggs的氨基酸序列的双car，cart-pcdhf58为第二和第三连接肽
为5个重复的ggggs的氨 基酸序列的双car，cart-pcdhf59为第二和第三连接肽为6个重复的ggggs的氨基酸序列的双car。
[0172]
综合以上实验数据可以看出，在e:t＝1:1和5:1时，cart-pcdhf58和cart-pcdhf59相较 cart-pcdhf32具有更强的体外杀伤效果。但细胞因子检测结果显示，il-2的分泌能力在e:t＝0.25:1和 1:1时，cart-pcdhf32、cart-pcdhf58和cart-pcdhf59基本相当；在e:t＝5:1和10:1时，cart-pcdhf59il-2的分泌较多。ifn-r的分泌能力除了在e:t＝5:1时，cart-pcdhf58略低于cart-pcdhf32外，其余 cart-pcdhf58和cart-pcdhf59的ifn-r分泌多于cart-pcdhf32。
[0173]
综合实施例7的实验结果可以看出，第二和第三连接肽具有3～5个重复的ggggs的氨基酸序列的 双cart引起细胞因子分泌量少于第二和第三连接肽具有6个重复的ggggs的氨基酸序列的双cart 引起细胞因子分泌量，第二和第三连接肽具有3～5个重复的ggggs的氨基酸序列的双cart安全性更 高。
[0174]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例
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等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施 例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描 述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在 不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或 示例的特征进行结合和组合。
[0175]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为 对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和 变型。